Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare

Riepilogo

Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.

Abstract

Il cervelletto svolge un ruolo importante in diverse funzioni chiave tra cui il controllo del movimento, l'equilibrio, la cognizione, la ricompensa e l'affetto. Studi di imaging indicano che regioni cerebellari distinte contribuiscono a queste diverse funzioni. Gli studi molecolari che esaminano le differenze cerebellari regionali sono in ritardo in quanto sono per lo più eseguiti su estratti cerebellari interi, mascherando così qualsiasi distinzione tra specifiche regioni cerebellari. Qui descriviamo una tecnica per sezionare in modo riproducibile e rapido quattro diverse regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare vermale anteriore e posteriore e la corteccia cerebellare degli emisferi. Sezionare queste regioni distinte consente l'esplorazione di meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici all'equilibrio, al movimento, all'affetto e alla cognizione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per esplorare le differenze nella suscettibilità patologica di queste regioni specifiche in vari modelli di malattia murina.

Introduzione

Il cervelletto contiene oltre la metà dei neuroni nel cervello ed è stato storicamente indicato come un centro di controllo motorio e di equilibrio nel cervello¹. Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che il cervelletto svolge un ruolo chiave in varie altre funzioni tra cui la cognizione, l'elaborazione della ricompensa e l'influenza^2,3,4,5.

Il cervelletto ha un'anatomia ben descritta: la regione della corteccia è composta da granuli, Purkinje e strati molecolari. Le cellule del granulo formano lo strato cellulare del granulo e inviano input tramite fibre parallele ai dendriti della cellula di Purkinje dello strato molecolare che ricevono anche input da fibre rampicanti che hanno avuto origine nell'oliva inferiore. Le cellule di Purkinje inviano proiezioni inibitorie alle cellule nei nuclei cerebellari profondi (DCN), che funge da output principale dal cervelletto. L'uscita di questo circuito cerebellare è ulteriormente modulata dall'attività degli interneuroni inibitori nella corteccia cerebellare, comprese le cellule di Golgi, stellate e cesto⁴. Questa unità funzionale cerebellare è distribuita in tutti i lobuli della corteccia cerebellare. Nonostante questo circuito relativamente uniforme attraverso il cervelletto, le prove della letteratura di neuroimaging umano e degli studi sui pazienti indicano l'eterogeneità funzionale del cervelletto^6,7.

La corteccia cerebellare può essere divisa in due regioni principali: il verme definito dalla linea mediana e gli emisferi laterali. Il verme può essere ulteriormente diviso in lobuli anteriori e posteriori. Queste regioni distinte del cervelletto sono state implicate nel contribuire a comportamenti diversi. I modelli di attività evocati o privi di compiti implicavano che le regioni anteriori del verme contribuiscono maggiormente alla funzione motoria mentre il verme posteriore contribuisce maggiormente alla cognizione^6,7. Il verme è anche legato agli affetti e alle emozioni, mentre gli emisferi cerebellari contribuiscono alle funzioni esecutive, visivo-spaziali, linguistiche e altre funzioni mnemoniche⁸. Inoltre, studi anatomici hanno fornito prove che regioni cerebellari funzionalmente distinte sono collegate a diverse regioni corticali⁹. La mappatura delle lesioni-sintomi ha rivelato che i pazienti con ictus che colpiscono i lobuli anteriori (che si estendono nel lobulo VI) hanno avuto prestazioni più scarse nei compiti motori fini, mentre i pazienti con danni alle regioni del lobo posteriore e agli emisferi hanno mostrato deficit cognitivi in assenza di sindrome motoria cerebellare¹⁰. Infine, la patologia cerebellare regionale nella malattia indica che le regioni cerebellari funzionalmente distinte sono anche diversamente suscettibili alla malattia^11,12.

Sebbene molto meno esplorate, le prove preliminari dimostrano firme di espressione genica distinte tra le regioni corticali cerebellari. L'espressione cellulare di Purkinje di Zebrin II mostra un pattern specifico della regione nel verme tale che ci sono più cellule positive di Zebrina II nei lobuli posteriori e meno nei lobuli anteriori¹³. Ciò è anche correlato con la funzione fisiologica distinta a livello regionale in quanto le cellule di Purkinje negative di Zebrin II mostrano una maggiore frequenza di attivazione tonica rispetto alle cellule di Purkinje che sono Zebrin II^{positive 14}.

Oltre alla corteccia cerebellare, il cervelletto comprende i nuclei cerebellari profondi (DCN) che fungono da output primario per il cervelletto. I nuclei sono costituiti dai nuclei mediali (MN), interposti (IN) e laterali (LN). L'imaging funzionale e gli studi sui pazienti hanno dimostrato che il DCN partecipa anche a vari comportamenti¹⁵, ma pochissimi studi esaminano il cambiamento dell'espressione genica nel DCN.

I progressi nelle tecniche molecolari hanno permesso di valutare l'espressione genica regionale nel cervello e hanno scoperto l'eterogeneità tra e all'interno di diverse regioni del cervello sia negli stati fisiologici che in quelli patologici¹⁶. Tali studi implicano che il cervelletto è diverso dalle altre regioni del cervello. Ad esempio, il rapporto tra neuroni e cellule gliali è invertito nel cervelletto rispetto ad altre regioni del cervello¹. Anche in condizioni fisiologiche normali, l'espressione dei geni proinfiammatori è sovraregolata nel cervelletto rispetto alle altre regioni cerebrali¹⁷. Le tecniche molecolari sono state anche molto utili nell'identificare le vie che contribuiscono alla patogenesi delle malattie cerebellari. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA di interi estratti cerebellari ha identificato geni alterati in un modello murino transgenico specifico della cellula di Purkinje di atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) rispetto ai loro controlli di tipo selvaggio. Tali evidenze hanno rivelato percorsi molecolari chiave alla base della patogenesi nelle cellule cerebellari di Purkinje e hanno contribuito a identificare potenziali bersagli terapeutici¹⁸. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che ci sono differenze nella vulnerabilità alle malattie tra le regioni cerebellari^11,12,19. Ciò potrebbe indicare che ci sono cambiamenti chiave che si verificano in regioni cerebellari distinte, che possono essere mascherate o non rilevate con interi estratti cerebellari. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche che consentano ai ricercatori di esaminare i profili molecolari in diverse regioni cerebellari.

La tecnica qui proposta descrive un metodo riproducibile per sezionare quattro regioni distinte del cervelletto di topo al fine di isolare l'RNA da quelle regioni ed esplorare le differenze regionali nell'espressione genica. Lo schema del cervelletto del topo nella Figura 1A evidenzia il verme in blu e gli emisferi in giallo. Nello specifico, questa tecnica permette di isolare quattro regioni: i nuclei cerebellari profondi (DCN) (scatole tratteggiate di rosso in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme anteriore (CCaV) (blu scuro in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme posteriore (CCpV) (azzurro in Figura 1A),e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH) (gialla in Figura 1A). Valutando separatamente l'espressione genica di queste regioni, sarà possibile studiare i meccanismi molecolari alla base delle funzioni discrete di queste diverse regioni, nonché le potenziali differenze nella loro vulnerabilità alla malattia.

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Protocollo

1. Configurazione

1. Raccogli l'attrezzatura necessaria tra cui forbici di decapitazione, pinza smussata, forbici di dissezione, forbici vascolari, microspatula, matrice cerebrale di topo sagittale, lame di rasoio, punte di pipet da 200 μL, piastra di Petri di vetro, vetrino di vetro e secchiello del ghiaccio. Disadere tutte le attrezzature su un pad assorbente.
2. Metti la capsula di Petri, la lastra di vetro e la matrice cerebrale sul ghiaccio.
3. Utilizzando una lama di rasoio con un angolo perpendicolare, tagliare circa 5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL. Ciò rende la dimensione dell'apertura all'estremità della punta larga circa 1 mm. Questo dovrebbe essere sufficiente per eliminare il DCN. Ma questo può anche essere regolato secondo necessità a seconda della dissezione. Avere molti suggerimenti pronti per una facile sostituzione e regolazione.
4. Etichetta 1,5 mL di tubi per microfughe con identificazione animale e regione cerebellare (quattro tubi per animale).
5. Riempire il contenitore criosafe con azoto liquido per congelare il tessuto dopo l'estrazione.

2. Estrazione e dissezione del cervello

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida dei comitati per la cura degli animali dell'Università del Minnesota.

1. Eutanasia del mouse utilizzando il 5% di esposizione a CO_2. Una volta che la respirazione è cessata, eseguire la lussazione cervicale. Decapitare il topo con le forbici di decapitazione e scartare la carcassa nell'apposito recipiente.
2. Fai un'incisione con una lama di rasoio lungo la linea sagittale mediale della testa partendo dal naso e continuando fino in fondo. Separare la pelle, separandosi su entrambi i lati della linea mediana. Usa la lama del rasoio per tagliare via il muscolo su ciascun lato, tagliando oltre i canali uditivi.
3. Usando le forbici sezionanti, tagliare tutte le regioni del midollo spinale, fino a dove il tronco cerebrale incontra il cervelletto, facendo attenzione a non danneggiare il cervelletto.
4. Inserire una delle lame vascolari a forbice nello spazio tra il tronco cerebrale e la colonna vertebrale e tagliare verso il condotto uditivo, sollevando le forbici per tagliare in modo pulito l'osso ma limitare i danni al tessuto.
5. Continuare a tagliare lungo il bordo del cranio verso i bulbi olfattivi, continuando a sollevarsi mentre si taglia per limitare i danni al tessuto cerebrale.
6. Usando la pinza smussata, staccare delicatamente la parte posteriore del cranio scoprendo la regione posteriore del cervello e del cervelletto.
7. Usando la pinza smussata lungo il bordo del cranio che è stato appena tagliato, sbuccia il resto del cranio su e sopra il cervello. Questo passaggio dovrebbe rimuovere la maggior parte della calotta cranica, rivelando il cervello.
8. Taglia il resto del cranio con le forbici vascolari e la pinza smussata, liberando la maggior parte del cranio dalla parte superiore del cervello.
9. Usando la microspatula, sollevare leggermente il cervello e raccogliere sotto e scivolare verso l'alto per rimuovere i bulbi olfattivi dal cranio rimanente e scollegare le fibre del tratto ottico. Il cervello dovrebbe liberarsi facilmente a questo punto.
10. Metti il cervello nella capsula di Petri seduto sul ghiaccio e rimuovi qualsiasi cranio rimanente o altri detriti.
11. Usando la microspatula, posizionare delicatamente il cervello nella matrice cerebrale con il lato dorsale in alto. Prenditi del tempo per assicurarti che sia impostato il livello nella matrice, in particolare che la linea mediana cada al centro della matrice. Questa matrice è progettata per il tessuto cerebrale di topo adulto, il tessuto di animali più giovani o malati può riposare più in basso nella matrice, ma dovrebbe essere ancora possibile ottenere risultati riproducibili su tutti i campioni.
12. Posizionare una lama di rasoio lungo la linea mediana sagittale, assicurandosi che la lama spinga fino in fondo alla matrice (Figura 1B).
13. Posizionare un'altra lama di rasoio di 1 mm sul lato della prima lama (Figura 1B). Posizionare altre due lame a 1 mm di distanza l'una dall'altra. Il risultato finale dovrebbe essere costituito da tre lame posizionate su un lato del cervello, tutte distanti 1 mm l'una dall'altra. Fai lo stesso con l'altra parte. In totale, 7 lame saranno posizionate a 1 mm di distanza (Figura 1C).
14. Con attenzione, afferrare le estremità anteriore e posteriore delle lame di rasoio e sollevare direttamente dalla matrice. Il tessuto all'esterno delle lame di rasoio può essere scartato.
15. Lentamente, separare una lama di rasoio alla volta dalle altre, facendo attenzione a non danneggiare le sezioni di tessuto.
16. Far scorrere con attenzione la sezione di tessuto fuori dalla lama del rasoio e sul vetrino di vetro con la microspatula. In totale ci saranno sei sezioni cerebrali sagittali (Figura 1D).
17. Le 4 sezioni più laterali avranno DCN visibile (scatola viola, Figura 1D). Per isolare il DCN, tenere la punta del pipetto da 200 μL tagliata perpendicolarmente sopra il DCN e spingere verso il basso attraverso il tessuto saldamente, oscillando in tutte le direzioni per sezionare completamente il DCN dal tessuto circostante. Sollevare direttamente per rimuovere in modo pulito il DCN e confermare visivamente la presenza del tessuto nella punta.
18. Posiziona un dito nella parte superiore della punta e spingi verso il basso, causando il rigonfiamento del tessuto. Posizionare la punta in un tubo di microfuga correttamente etichettato e assicurarsi che il punzone di tessuto sia posizionato sul fondo del tubo. Ripetere 2.17 per le restanti tre sezioni, posizionando i punzoni DCN nello stesso tubo. Posizionare il tubo in azoto liquido per congelare il flash. Rappresentazione della dimensione di ciascun punzone nella Figura 1E.
19. Le sezioni che hanno estratto DCN si qualificano come emisfero cerebellare. Spingere via il resto del tessuto cerebrale intorno al cervelletto in queste sezioni. Utilizzare una pinna smussata e raccogliere delicatamente queste sezioni della corteccia cerebellare dell'emisfero e posizionarle nel rispettivo tubo del microfugo. Blocco flash.
20. Per le ultime due sezioni vermali (scatola azzurra, Figura 1D),allontanare il tessuto cerebrale circostante lasciando solo il cervelletto. Usando una lama di rasoio, fai un taglio separando i lobuli anteriori dai lobuli posteriori. Il taglio dovrebbe essere subito dopo la formazione del lobulo 6 e non dovrebbe includere il lobulo 10 (Figura 1F).
21. Utilizzando una pinna smussata, posizionare con attenzione le sezioni della corteccia cerebellare anteriore e le sezioni della corteccia cerebellare posteriore nei rispettivi tubi del microfugo e congelare il flash lasciando i tubi in azoto liquido per 5 minuti. Da qui passare all'estrazione dell'RNA, o si possono conservare i tubi a -80 °C.

3. Estrazione dell'RNA

NOTA: Questo protocollo è stato modificato dal protocollo Cold Spring Harbor per l'estrazione dell'RNA con TRIzol^20. TRIzol solubilizza il materiale biologico, rendendo possibile l'estrazione dell'RNA.

1. Posizionare i tubi del microfugo nel ghiaccio per evitare che il tessuto si scongeli troppo rapidamente, applicare 150 μL di TRIzol freddo nel tubo del microfugo. Omogeneizzare con un pestello sterilizzato. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, pipettare la soluzione su e giù per assicurarsi che non vi sia tessuto rimanente intatto. Rompere ulteriormente eventuali piccoli pezzi di tessuto tirandolo su in una siringa da insulina un paio di volte.
2. Aggiungere altri 350 μL di TRIzol e pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
3. Aggiungere 150 μL di cloroformio al tubo e agitare vigorosamente e quindi lasciare riposare per 2-3 minuti. Il cloroformio separa la soluzione tissutale omogeneizzata in fasi (RNA, DNA e proteine).
4. Centrifugare a 12.000 x g, a 15°C, per 10 minuti. Assicurarsi che tutti i tubi siano allo stesso orientamento.
5. Rimuovere con cura i tubi e impostare la temperatura della centrifuga a 4°C. Rimuovere solo la fase acquosa chiara in un nuovo tubo (questo è l'RNA), facendo attenzione a non interrompere l'interfase opaca (il DNA).  La fase più bassa sarà rossa e contiene proteine. La soluzione rimanente nei tubi può essere salvata o scartata.
6. Aggiungere alcol isopropilico al 100% con un rapporto 1:2 (se rimosso 200 ul di fase acquosa, aggiungere 100 μL di alcol isopropilico). Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. L'alcol isopropilico fa precipitare l'RNA fuori dalla soluzione.
7. Centrifugare a 12.000 x g, a 4°C, per 10 minuti. Assicurati di posizionare tutti i tubi con lo stesso orientamento per facilitare la visualizzazione del pellet. Il pellet risultante sarà l'RNA estratto.
8. Rimuovere con attenzione i tubi, rimuovere il surnatante con un pipetto facendo attenzione a non disturbare il pellet. Il pellet è un po 'gelatinoso e sarà difficile da vedere, ma dovrebbe essere in grado di stimare dove si basa sull'orientamento dei tubi nella centrifuga.
9. Dopo aver rimosso tutto il surnatante, aggiungere 500 μL di etanolo al 75%, vortice brevemente e centrifugare a 7500 x g, a 4°C, per 5 minuti. L'etanolo lava ulteriormente il pellet.
10. Rimuovere il surnatante con attenzione, senza interrompere il pellet. Lasciare i tappi aperti per asciugare il campione. Questo di solito richiede 5-10 minuti, ma può variare a seconda di quanto etanolo è rimasto sul pellet. Non asciugare troppo.
11. Una volta asciutto, risusciughare il pellet in acqua priva di DNase. Aggiungere 20 μL ai campioni per DCN e 30 μL per tutti gli altri.
12. Una volta ripresa, i campioni possono essere conservati a -80 °C o procedere a ulteriori test.

4. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RTqPCR)

1. Prima di questo passaggio sarà necessario trattare DNase l'RNA per rimuovere qualsiasi DNA genomico e generare cDNA utilizzando iScript da BioRad. Assicurati di normalizzare la concentrazione di RNA prima di produrre il cDNA. Inoltre, è importante ottimizzare i primer per qPCR. Seguire i metodi descritti qui per completare questo passaggio²¹. Breve descrizione del qPCR di seguito.
2. I primer sono tutti acquistati da IDT. Le sequenze avanti e indietro sono entrambe nella stessa provetta del campione e conservate a una concentrazione di 20 volte superiore.
   Rps18 (gene di controllo):
   Avanti – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
   Inverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Parvalbumina (Proteina legante il calcio, cellule inibitorie):
   Avanti – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
   Inverso – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
   Kcng4 (Subunità del canale del potassio):
   Avanti – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
   Inverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
   Aldolasi C (Zebrina II, espressa in modo differenziale attraverso la corteccia cerebellare):
   Avanti – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
   Inverso – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3'
3. Le condizioni qPCR erano le seguenti. Periodo di pre-incubazione, 5 minuti, a 95°C. Periodo di amplificazione, 50 cicli: 10 minuti a 95°C, 10 minuti a 62°C e 10 minuti a 72°C. Periodo della curva di fusione, 5 secondi a 95 °C, un minuto a 65 °C e impostare la velocità di rampa su 0,07 °C/secondo fino alla temperatura target di 97 °C. Quindi periodo di raffreddamento per 10 minuti a 40 ° C.  Tutte le reazioni qPCR sono state eseguite in triplice copia e l'espressione genica è stata analizzata utilizzando 2^{- ΔΔCt} con Rps18 come controllo del carico per normalizzare l'espressione genica. L'estratto cerebellare sfuso è stato usato come riferimento.

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Risultati

Per questi esperimenti sono stati utilizzati quattro topi femmina di tipo C57/Black6 di undici settimane. Un topo è stato utilizzato per condurre una dissezione cerebellare completa che viene definita "cervelletto di massa" e ha permesso il confronto dei livelli di RNA nelle regioni sezionate con una dissezione completa. Gli altri tre topi sono stati utilizzati per condurre la dissezione cerebellare descritta in questo protocollo. L'utilizzo di tre topi consente di garantire che le tende...

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Discussione

Il metodo qui descritto consente di valutare l'espressione genica sottostante e i meccanismi molecolari all'interno di quattro distinte regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare anteriore del verme (CCaV), la corteccia cerebellare posteriore del verme (CCpV) e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH). La capacità di valutare queste regioni separatamente amplierà la nostra conoscenza dell'eterogeneità di specifiche regioni cerebellari e possibilmente farà luce sul loro con...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Microcentrifuge tubes	ThermoScietific	3456
100% Isopropyl Alcohol	VWR Life sciences	1106C361
200 ul Pipet tips	GeneMate	P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform	Macron	220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol	Pharmco	111000200
Glass Slide (for electrophoresis)	BIORAD
Homogenizer	Kimble	6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish	Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C	IDT	Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades	Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles	FisherScientific	12141364
TRIzol Reagent	Ambion by Life technologies	15596018
Vascular Scissors