Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Riepilogo

Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Abstract

Tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa, gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente strumento basato sull'imaging per lo studio di fenomeni citoplasmatici, come la citochinesi, la formazione del fuso mitotico e l'assemblaggio del nucleo. Basandosi sui primi metodi che riprendevano estratti fissi campionati in punti temporali sparsi, i recenti approcci hanno ottenuto estratti live utilizzando la microscopia time-lapse, rivelando caratteristiche più dinamiche con una risoluzione temporale migliorata. Questi metodi di solito richiedono sofisticati trattamenti superficiali del vaso di imaging. Qui introduciamo un metodo alternativo per l'imaging dal vivo di estratti di uova che non richiedono alcun trattamento chimico superficiale. È semplice da implementare e utilizza materiali di consumo di laboratorio prodotti in serie per l'imaging. Descriviamo un sistema che può essere utilizzato sia per la microscopia a campo largo che per quella confocale. È progettato per l'imaging di estratti in un campo 2-dimensionale (2D), ma può essere facilmente esteso all'imaging in 3D. È adatto per studiare la formazione di modelli spaziali all'interno del citoplasma. Con dati rappresentativi, dimostriamo la tipica organizzazione dinamica di microtubuli, nuclei e mitocondri in estratti interfasici preparati con questo metodo. Questi dati di immagine possono fornire informazioni quantitative sulla dinamica citoplasmatica e sull'organizzazione spaziale.

Introduzione

Il citoplasma costituisce il volume principale di una cellula e ha un'organizzazione distinta. Gli ingredienti del citoplasma eucariotico possono auto-assemblarsi in una vasta gamma di strutture spaziali, come gli astri dei microtubuli e l'apparato di Golgi, che a loro volta sono disposti dinamicamente e girati a seconda dell'identità della cellula e dello stato fisiologico. Comprendere l'organizzazione spaziale del citoplasma e il suo legame con le funzioni cellulari è quindi importante per capire come funziona la cellula. Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono stati tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa 1,2,3,4,5,6,7,8, ma recenti lavori li stabiliscono come un potente sistema di imaging dal vivo per studi meccanicistici delle strutture citoplasmatiche e delle loro funzioni cellulari 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. Questi estratti non diluiti preservano molte strutture e funzioni del citoplasma, consentendo manipolazioni dirette di contenuti citoplasmatici non ottenibili nei modelli cellulari convenzionali^19,20. Ciò li rende ideali per caratterizzare i fenomeni citoplasmatici e sezionare le loro basi meccanicistiche.

I metodi esistenti per l'imaging degli estratti richiedono modifiche chimiche della superficie o la fabbricazione di dispositivi microfluidici. Un metodo basato su coprivetrini richiede la passivazione al glicole polietilenico (PEG) dei vetrini di vetro²¹. Un metodo basato su microemulsioni richiede la deposizione da vapore di tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano su superfici vetrate^22,23. I sistemi basati sulla microfluidica consentono un controllo preciso del volume, della geometria e della composizione delle goccioline di estratto, ma richiedono strutture di microfabbricazione specializzate^11,12,24.

Qui introduciamo un metodo alternativo per l'imaging degli estratti di uova che è facile da implementare e utilizza materiali prontamente disponibili e a basso costo. Ciò include la preparazione di una camera di imaging con un vetrino e un coprivetrino rivestito con nastro fluorurato di etilene propilene (FEP). La camera può essere utilizzata per l'imaging di estratti con una varietà di sistemi di microscopia, tra cui stereoscopi e microscopi verticali e invertiti. Questo metodo non richiede alcun trattamento chimico delle superfici, pur ottenendo una chiarezza ottica simile ottenuta con i metodi esistenti a base di vetro discussi sopra. È progettato per visualizzare uno strato di estratti con uno spessore uniforme su un campo 2D e può essere facilmente esteso per visualizzare un volume 3D di estratti. È adatto per l'imaging time-lapse del comportamento citoplasmatico collettivo su un ampio campo visivo.

Abbiamo utilizzato estratti di uova interfasici per dimostrare il nostro metodo di imaging. La preparazione dell'estratto segue il protocollo di Deming e Kornbluth¹⁹. In breve, le uova naturalmente arrestate in metafase della meiosi II vengono schiacciate da una rotazione a bassa velocità. Questo spin rilascia il citoplasma dall'arresto meiotico e consente all'estratto di procedere in interfase. Normalmente, la citocalasina B viene aggiunta prima dello spin di schiacciamento per inibire la formazione di F-actina. Tuttavia, può essere omesso se si desidera F-actina. La cicloeximide viene anche aggiunta prima dello spin di schiacciamento per impedire all'estratto interfase di entrare nella mitosi successiva. Gli estratti vengono successivamente collocati nelle suddette camere di imaging e posti su un microscopio. Infine, le immagini vengono registrate nel tempo a intervalli definiti da una fotocamera collegata al microscopio, producendo serie di immagini time-lapse che catturano il comportamento dinamico dell'estratto in un campo 2D.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.

1. Preparazione di diapositive e copertine

1. Applicare uno strato di nastro adesivo fluorurato di etilene propilene (FEP) su un vetrino con un applicatore a rullo. Tagliare il nastro adesivo eccessivo sui bordi con una lama di rasoio pulita. Preparare i coprivetrini rivestiti con nastro FEP nello stesso modo (Figura 1A).
2. Applicare un distanziatore di immagini adesivo fronte-retro sul lato rivestito con nastro FEP del vetrino. Lasciare la fodera protettiva sulla parte superiore non sbucciata (Figura 1A).
   NOTA: Le diapositive e le copertine devono essere preparate prima dell'esperimento. Possono essere utilizzati immediatamente o conservati in scatole per evitare l'accumulo di polvere sulle superfici. Il pozzo nel distanziatore di imaging è profondo 120 μm e ha un diametro di 9 mm.

2. Preparazione e imaging dal vivo di estratti di uova interfasiche

NOTA: Il seguente protocollo è adattato da Deming e Kornbluth¹⁹, Murray²⁰ e Smythe e Newport²⁵ con modifiche. Tutti i passaggi devono essere eseguiti a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

1. Da tre a dieci giorni prima della raccolta delle uova, iniettare rane mature di Xenopus laevis per via sottocutanea nel sacco linfatico dorsale con 100 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG).
2. Da sedici a diciotto ore prima della raccolta delle uova pianificata, iniettare le rane dal punto 2.1 con 500 UI di gonadotropina corionica umana (hCG). Lasciare le rane a 18 °C nel tampone per la deposizione delle uova (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2,5mM CaCl 2·2H₂ O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, preparare come soluzione madre 20x a pH_7,4 e diluire con acqua pulita del serbatoio di rana a 1x prima dell'uso) fino alla raccolta delle uova.
3. Il giorno dell'esperimento, raccogli le uova in una grande piastra di Petri di vetro e valuta la qualità delle uova. Scartare tutte le uova che sembrano palline bianche gonfie o che appaiono in una stringa (Figura 1B). Esaminare le uova sotto uno stereoscopio, mantenere le uova con aspetto normale (Figura 1C) e scartare quelle con pigmento irregolare o screziato (Figura 1D).
   NOTA: Questo protocollo funziona con uova raccolte da una singola rana, che in genere depone 25 ml di uova entro 16 ore dopo l'iniezione di hCG. Di solito, un totale di 3-6 rane sono indotte da hCG e la rana con la più alta qualità dell'uovo viene scelta per l'esperimento di preparazione dell'estratto.
4. Trasferire le uova in un becher di vetro da 400 ml e rimuovere il più possibile il tampone per la deposizione delle uova mediante decantazione.
5. Incubare le uova in 100 ml di soluzione dejellying appena preparata (2% p/v di L-cisteina in acqua, regolare a pH 8,0 con NaOH) e ruotarle delicatamente periodicamente. Dopo circa 3 minuti, versare la soluzione e aggiungere 100 ml di soluzione fresca di dejelly. Continuare l'incubazione fino a quando le uova sono ben imballate (senza spazio tra le uova), ma evitare di lasciare le uova nella soluzione di dejellying per più di un totale di 5 minuti.
6. Rimuovere il più possibile la soluzione di degelatinaggio mediante decantazione e lavare le uova in tampone MMR 0,25x (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl₂, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, preparato come soluzione madre 10x, regolato a pH 7,8 con NaOH e diluito in acqua Milli-Q prima dell'uso) aggiungendo il tampone, Ruotando le uova e poi versando il tampone. Ripetere alcune volte fino a quando non viene utilizzato un totale di 1 L del tampone per i lavaggi.
7. Lavare le uova alcune volte con un totale di 400 ml di tampone di lisi delle uova (250 mM di saccarosio, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, reso fresco e regolato a pH 7,7 con KOH). Rimuovere le uova con aspetto anomalo usando una pipetta Pasteur tra i lavaggi.
   NOTA: Le uova con aspetto anormale si riferiscono a quelle che sembrano palline bianche gonfie (Figura 1B), hanno pigmentazione chiazzata (Figura 1D), si stanno deteriorando con una regione bianca in crescita (Figura 1E) o mostrano un'area pigmentata scura e contratta nell'emisfero animale (Figura 1F).
8. Utilizzando una pipetta di trasferimento con la punta ben aperta, trasferire le uova in una provetta da centrifuga a fondo tondo da 17 mL contenente 1 mL di tampone per lisi delle uova. Girare il tubo in una centrifuga clinica a 400 x g per 15 secondi per confezionare le uova.
9. Rimuovere il più possibile il tampone di lisi delle uova dalla parte superiore delle uova confezionate utilizzando una pipetta Pasteur.
   NOTA: È importante rimuovere quanto più tampone possibile dalle uova confezionate, al fine di ridurre al minimo la diluizione dell'estratto di uova. A volte è necessario rimuovere alcune uova sciolte insieme al tampone residuo per raggiungere questo obiettivo.
10. Determinare il volume approssimativo delle uova confezionate, quindi aggiungere 5 μg/mL di aprotinina, 5 μg/mL di leupeptina, 5 μg/mL di citocalasina B e 50 μg/mL di cicloeximide direttamente sopra le uova confezionate.
    NOTA: Aprotinina e leupeptina sono inibitori della proteasi. La citocalasina B inibisce la polimerizzazione dell'actina, impedendo all'estratto di contrarsi e gelificare²⁶. La cicloeximide inibisce la sintesi proteica, mantenendo così l'estratto nell'interfase del ciclo cellulare.
11. Schiacciare le uova centrifugando il tubo a 12.000 x g, 4 °C, per 15 minuti, in un rotore oscillante.
    NOTA: Alla fine della centrifugazione, le uova dovrebbero essersi rotte e il lisato separato in tre strati principali: uno strato lipidico giallo in alto, l'estratto citoplasmatico (chiamato anche estratto grezzo) nel mezzo e uno strato denso scuro contenente i granuli di pigmento nella parte inferiore (Figura 1G).
12. Collegare un ago da 18 gauge a una siringa. Con la punta dell'ago smussata rivolta verso l'alto, forare il tubo dal lato nella parte inferiore dello strato citoplasmatico e recuperare l'estratto disegnando lentamente.
    NOTA: Prelevare lentamente l'estratto citoplasmatico per evitare l'inclusione di contenuto contaminante dallo strato lipidico giallo.
13. Trasferire l'estratto citoplasmatico recuperato in una nuova provetta da microcentrifuga e tenerlo in ghiaccio. Utilizzare l'estratto entro 1 ora.
14. Quando è pronto per l'immagine, integrare l'estratto con i reagenti desiderati e le sonde di imaging a fluorescenza.
    NOTA: Le sonde di imaging a fluorescenza etichettano strutture citoplasmatiche specifiche in modo che possano essere visualizzate da un microscopio a fluorescenza.
15. Rimuovere il rivestimento protettivo superiore dal distanziatore di imaging sul vetrino preparato al punto 1.2 e depositare circa 7 μL di estratto al centro del pozzetto. Applicare immediatamente il coprislip rivestito con nastro FEP con il lato FEP rivolto verso l'estratto per sigillare il pozzetto. Procedere rapidamente all'imaging (Figura 1H,I).
16. Impostare il vetrino su un microscopio invertito o verticale con un palco motorizzato e una fotocamera digitale. Immagina gli estratti nelle posizioni spaziali e negli intervalli di tempo desiderati sia nei canali a campo chiaro che in quelli a fluorescenza.
    NOTA: in genere, per l'imaging viene utilizzato un obiettivo 5x. Il palco motorizzato consente l'acquisizione automatica delle immagini in più posizioni spaziali definite. La microscopia a campo chiaro visualizza le strutture citoplasmatiche con diversi gradi di trasparenza. La microscopia a fluorescenza visualizza le strutture citoplasmatiche specificamente etichettate dalle sonde di imaging a fluorescenza aggiunte al punto 2.14. La telecamera registra immagini time-lapse di queste strutture, catturando così le dinamiche dell'organizzazione citoplasmatica.

Risultati

Gli estratti di uovo di Xenopus laevis possono essere utilizzati per studiare l'auto-organizzazione del citoplasma durante l'interfase. La Figura 2A mostra i risultati di un esperimento riuscito. Abbiamo integrato estratti interfasici con nuclei di spermatozoi demembranati di Xenopus laevis 19 ad una concentrazione di 27 nuclei / μL e 0,38 μM purificati GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteina di fusione costituita da glutatione-S-tra...

Discussione

Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente sistema modello per studi basati sull'imaging di varie strutture subcellulari 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organizzazione citoplasmatica nel suo complesso

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M