Un protocollo completo ad alta efficienza per l'isolamento, la coltura, la polarizzazione e la caratterizzazione glicolitica dei macrofagi derivati dal midollo osseo

Riepilogo

Questo protocollo fornisce metodi dettagliati e completi per l'isolamento, la coltura, la polarizzazione e la misurazione dello stato metabolico glicolitico dei macrofagi derivati dal midollo osseo vivo (BMDM). Questo documento fornisce istruzioni dettagliate con illustrazioni visive realistiche per il flusso di lavoro e la valutazione glicolitica dei BMDM in tempo reale.

Abstract

I macrofagi sono tra le più importanti cellule presentanti l'antigene. Molti sottogruppi di macrofagi sono stati identificati con firme metaboliche uniche. I macrofagi sono comunemente classificati come sottotipi M1-like (infiammatori) e M2-like (antinfiammatori). I macrofagi M1-like sono macrofagi pro-infiammatori che vengono attivati da LPS e/o citochine pro-infiammatorie come INF-γ, IL-12 e IL-2. I macrofagi polarizzati M1-like sono coinvolti in varie malattie mediando la difesa dell'ospite contro una varietà di batteri e virus. Questo è molto importante per studiare i macrofagi M1-like indotti da LPS e i loro stati metabolici nelle malattie infiammatorie. I macrofagi M2-like sono considerati macrofagi antinfiammatori, attivati da citochine antinfiammatorie e stimolatori. Nello stato pro-infiammatorio, i macrofagi mostrano un aumento della glicolisi nella funzione glicolitica. La funzione glicolitica è stata attivamente studiata nel contesto della glicolisi, della capacità glicolitica, della riserva glicolitica, della glicolisi compensatoria o dell'acidificazione non glicolitica utilizzando analizzatori di flusso extracellulare (XF).

Questo articolo dimostra come valutare gli stati glicolitici in tempo reale con passaggi facili da seguire quando i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) respirano, consumano e producono energia. Utilizzando inibitori e attivatori specifici della glicolisi in questo protocollo, mostriamo come ottenere una visione sistemica e completa dei processi metabolici glicolitici nelle cellule e fornire risultati più accurati e realistici. Per essere in grado di misurare più fenotipi glicolitici, forniamo un metodo di normalizzazione semplice, sensibile e basato sul DNA per la valutazione della polarizzazione dei BMDM. La coltura, l'attivazione/polarizzazione e l'identificazione del fenotipo e dello stato metabolico dei BMDM sono tecniche cruciali che possono aiutare a studiare molti tipi diversi di malattie.

In questo articolo, abbiamo polarizzato i macrofagi M0 naive in macrofagi M1-like e M2-like con LPS e IL4, rispettivamente, e misurato un set completo di parametri glicolitici nei BMDM in tempo reale e longitudinalmente nel tempo, utilizzando l'analisi del flusso extracellulare e attivatori e inibitori glicolitici.

Introduzione

I macrofagi sono una delle cellule più critiche del sistema immunitario innato, simile a M1. Sono coinvolti nell'eliminazione delle malattie infettive, nella fagocitosi, nella presentazione dell'antigene e nella regolazione dell'infiammazione². Inoltre, i macrofagi sono necessari per regolare altre cellule immunitarie attraverso varie citochine che rilasciano³. C'è un grande spettro nei fenotipi dei macrofagi⁴. A seconda dei segnali a cui sono esposti, i macrofagi si polarizzano verso diversi stati infiammatori e metabolici⁵. I macrofagi manifestano alterazioni metaboliche in varie malattie, a seconda del tessuto in cui risiedono i macrofagi⁶. I macrofagi polarizzati hanno la capacità di riprogrammare o cambiare il loro metabolismo glicolitico, il metabolismo lipidico, il metabolismo degli amminoacidi e la fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS)^7,8. I macrofagi M1-like classicamente attivati e i macrofagi M2-like attivati alternativamente sono i due fenotipi di^{macrofagi 3} più studiati. I macrofagi quiescenti non attivati sono indicati come macrofagi M0. La polarizzazione dei macrofagi M0 verso un fenotipo simile a M1 può essere indotta dalla stimolazione di BMDM naive con lipopolisaccaride batterico (LPS)⁹. La via di segnalazione PI3K-AKT-mTOR-HIF1a può essere attivata nei macrofagi in presenza di citochine infiammatorie, interferone-gamma (IFN γ) o fattore di necrosi tumorale (TNF)¹⁰. I macrofagi M1-like hanno un aumento dei livelli di metabolismo della glicolisi, una diminuzione dei livelli di fosforilazione ossidativa (OXPHOS), producendo citochine infiammatorie coinvolte nelle malattie infettive e infiammatorie⁸. D'altra parte, la polarizzazione verso il fenotipo M2-like può essere indotta dall'interleuchina (IL)-4, attraverso le vie JAK-STAT, PPAR e AMPK, o da (IL)-13 e TGFβ pathays^11,12.

A differenza dei macrofagi M1-like, i macrofagi M2-like hanno una diminuzione della glicolisi e un aumento dell'OXPHOS e sono coinvolti in attività antiparassitarie e di riparazione tissutale ^8,13. I BMDM sono un sistema ampiamente utilizzato per lo studio dei macrofagi derivati dalle cellule staminali del midollo osseo. La glicolisi e l'OXPHOS sono le due principali vie di produzione di energia nelle cellule¹⁴. In base al loro microambiente, i BMDM possono scegliere di utilizzare uno di questi percorsi; In alcuni casi, passare da uno all'altro o utilizzare entrambi i percorsi¹⁴. In questo studio, ci siamo concentrati sul metabolismo della glicolisi nei macrofagi pro-infiammatori attivati. Quando il glucosio nel citoplasma viene convertito in piruvato e quindi lattato, le cellule producono protoni nel mezzo che causano un aumento del tasso di acidificazione nel mezzo circondato di cellule simili a M1⁵. È stato utilizzato un analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione dei mezzi cellulari. I risultati sono riportati come tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) o come tasso di efflusso protonico.

Un metodo ottimizzato e semplice e veloce per accedere ai livelli di glicolisi nei macrofagi polarizzati è essenziale per determinare il fenotipo glicolitico, i cambiamenti dei metaboliti e gli effetti di inibitori/attivatori e farmaci sui macrofagi polarizzati. Il metodo descritto in questo manoscritto è stato ottimizzato per fornire informazioni su specifici fattori di glicolisi (glicolisi, capacità glicolitica, riserva glicolitica e acidificazione non glicolitica), nonché sulla riprogrammazione metabolica del metabolismo glicolitico. L'inibitore (2DG) che è stato utilizzato in questo studio ha come bersaglio esplicito la via della glicolisi.

Questo protocollo ottimizzato è stato modificato e migliorato sulla base della combinazione di un protocollo¹⁶ pubblicato, dell'analisi del flusso extracellulare dei saggi glicolitici delle guide per l'utente del produttore e della comunicazione diretta con gli scienziati di ricerca e sviluppo del produttore.

Protocollo

I topi sono stati sacrificati umanamente secondo le linee guida dell'Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) e dell'American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) e utilizzando protocolli approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Texas A&M University (IACUC).

1. Raccolta del midollo osseo nei topi e coltura di BMDM

1. Sacrificare il topo (6-10 settimane di età i topi C57Bl/6 erano in questo protocollo) e stenderlo sul lato ventrale, tagliare la pelle e lo strato peritoneale e staccare delicatamente le zampe.
   NOTA: Utilizzare l'esposizione al gas CO₂ per l'eutanasia del topo.
2. Separare entrambe le zampe posteriori dall'anca in giù, facendo attenzione a non tagliare l'osso.
3. Metti l'intera gamba in una provetta conica vuota da 50 ml (con i piedi rivolti verso l'alto per avere una presa facile da estrarre in seguito) sul ghiaccio e procedi con il prelievo di entrambe le gambe dal topo.

2. Esposizione del femore

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in una cabina di biosicurezza.

1. Raccogli il femore tagliando la tibia da ciascuna gamba e rimuovi quanto più tessuto possibile che circonda il femore con forbici e carta da laboratorio.
2. Mettere i femori raccolti e "puliti" in una piastra di 10 cm contenente un pezzo di carta da laboratorio imbevuto di terreno di coltura tissutale (TC) o PBS. Metteteli sul ghiaccio.
3. Continuare a prelevare i femori e rimuovere il tessuto da tutti i femori prima di procedere alla fase di lavaggio (Figura 1A).

3. Vampate di midollo

1. Per lavare il midollo dai femori, utilizzare una siringa da 3 ml riempita con terreno TC o PBS con un ago da 23 G. Riempire la siringa prima di esporre il midollo.
2. Usa le forbici per esporre il midollo tagliando l'estremità del femore in entrambe le epifisi.
3. Inserire la punta dell'ago nel femore e sciacquare delicatamente il midollo in un piatto di 10 cm.
4. Far scorrere l'ago su tutta la lunghezza del femore e sciacquare fino a quando il colore dell'osso diventa bianco. Di solito, la maggior parte del midollo può essere espulsa con 2-3 ml di terreno.
5. Sciacquare tutti i femori e il midollo osseo nella piastra. Usa un ago per rompere eventuali grumi visibili. Filtrare il midollo in una provetta conica da 50 mL (Figura 1A).

4. Lisi dei globuli rossi

1. Centrifugare il midollo a 190 x g per 10 min. Aspirare il surnatante.
2. Risospendere il pellet in 4 mL di tampone di lisi ACK con una pipetta. Lasciare agire il tampone di lisi dei globuli rossi per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 4 mL di TC medium RPMI-C 10% (RPMI 1640 -GlutaMAX) integrato con 2-mercaptoetanolo, gentamicina, streptomicina e 10% FCS alla sospensione midollare e centrifugare a 1300 x g per 10 min.
4. Filtrare nuovamente per rimuovere i detriti di globuli rossi e risospendere in un piccolo volume di RPMI-C 10% per il conteggio.
5. Contare le celle con un contatore di celle (Figura 1B). Un contatore di cellule Vi-Cell è stato utilizzato per determinare il conteggio e la vitalità delle cellule nella sospensione.

5. Impiattamento e cultura

1. Aggiungere 10 mL di RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor, un regolatore essenziale della proliferazione, differenziazione e sopravvivenza di monociti/macrofagi) a tutte le piastre da 10 cm desiderate.
2. Aggiungere un volume appropriato di celle contate in modo che ogni piastra da 10 cm contenga 1 x 10⁶ cellule. Mettere le piastre in un'incubatrice a 37 °C (giorno 0).
3. Il giorno 3, aggiungere delicatamente 5 mL di RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF fresco a ciascuna piastra.
   NOTA: Il giorno 7, i BMDM dovrebbero essere pronti per il test (Figura 1C).

6. Raccolto da piatti

1. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che la maggior parte delle cellule abbia aderito alle piastre.
2. Aspirare delicatamente il terreno. Quindi aggiungere 3 ml di PBS e agitare delicatamente la piastra. Aspirare bene per rimuovere eventuali cellule non aderenti rimanenti.
3. Aggiungere 7-10 mL di PBS freddo alla piastra, utilizzare una pipetta P1000 per lavare il fondo delle piastre e raccogliere tutte le cellule rimanenti in una provetta di raccolta.
   NOTA: Tenere le provette sul ghiaccio poiché i macrofagi aderiscono molto strettamente e aderiscono all'interno della provetta. Se le celle fossero mantenute fredde, sarebbero state meno aderenti.
4. Centrifugare, contare e piastrare, piûą per esperimenti (Figura 1D). Utilizzando la citometria a flusso, le cellule risultanti dovrebbero essere positive al >95% per CD11b e F4/80. (La polarizzazione dei macrofagi è stata determinata mediante colorazione con marcatori M1-like di CD38, TNF-a e MCP-1 e marcatori M2-like di CD206.
   NOTA: Eseguire i passaggi 6.1-6.3 nella cabina di biosicurezza ed eseguire il passaggio 6.4 sul piano di lavoro. Mantenere le tecniche asettiche durante tutta la procedura.

Figura 1: Flusso di lavoro grafico della coltura del midollo osseo di topo di macrofagi derivati dal midollo osseo. (A) Prelievo delle zampe, esposizione al femore e lavaggio del midollo; (b) lisi dei globuli rossi; (C) Impiattamento e cultura; (D) Raccolta di cellule dalle piastre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Il giorno prima del test dell'analizzatore di flusso metabolico: semina e polarizzazione delle cellule per il test glicolitico

1. Riscaldare l'analizzatore di flusso metabolico a 37 °C accendendo lo strumento.
2. Idratare una cartuccia aggiungendo 200 μl di una soluzione calibrante e incubare la cartuccia in un incubatore senza CO₂ per una notte (Figura 2A). L'umidità dell'incubatrice senza CO₂ non è importante per l'idratazione della cartuccia.
   1. Un'ora prima dell'esperimento, immergi la piastra un paio di volte su e giù, il che aiuterà a rimuovere le bolle d'aria.
3. Progetta la mappa della piastra sul software nel test da sforzo di glicolisi predefinito-iniezione acuta, seguendo le istruzioni del test.
   1. Fare clic sull'icona del software, quindi fare clic su Test di iniezione acuta da stress glicolisi. Sull'icona di definizione del gruppo, generare i nomi dei gruppi.
4. Ci sono cinque cicli di misurazione con una durata di 18 minuti e quattro iniezioni. Cambiare l'iniezione della porta A in glucosio, della porta B in oligomicina, della porta C in rotenone e antimicina A (Rot/AA) e della porta D in 2DG.
5. Risospendere le cellule in terreno RPMI-C al 10% e seminare 50k cellule per pozzetto, ad eccezione dei quattro bordi della piastra (A1, A12, H1 e H12; Aggiungere solo terreni, senza cellule) in una micropiastra dell'analizzatore di flusso metabolico fino a un volume finale di 100 μl. Normalmente è necessario un minimo di 40k cellule per condurre questo saggio.
6. Lasciare riposare le celle a temperatura ambiente per 45 minuti per evitare l'effetto bordo delle celle. L'effetto bordo si verifica quando il fluido intorno al perimetro della piastra evapora parzialmente, causando variazioni di volume e concentrazione e riducendo la vitalità cellulare.
7. Aggiungere 10 ng/mL di LPS per polarizzare i macrofagi naïve verso le cellule M1-like e aggiungere 20 ng/ml di IL-4 per polarizzarli verso le cellule M2-like. Utilizzare almeno 3-6 pozzetti per condizione (Figura 2B).
8. Controllare le cellule al microscopio e posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.

Figura 2: Dimostrazione grafica della semina e della polarizzazione delle cellule. (A) Messa a punto dell'analizzatore di flusso extracellulare e idratazione della cartuccia; (B) Polarizzazione delle cellule e incubazione notturna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Giorno del saggio: XF Medium e preparazione del composto

1. Integrare 100 mL di terreno di prova XF RPMI (pH 7,4) con 2 mM di glutammina.
2. Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di filtraggio sottovuoto da 0,2 μm.
3. Immergere il terreno di coltura in un bagnomaria a 37 ^°C per 20 minuti.
4. Rimuovere le celle piastrate dall'incubatore a 37 °C, 5% CO₂ . Lavare due volte le cellule con il terreno di prova e sostituire il terreno precedente con il terreno di analisi fino al volume finale di 180 μL.
5. Utilizzare un microscopio per assicurarsi che tutti i pozzetti abbiano celle confluenti e contrassegnare tutti i pozzetti che presentano graffi dovuti al pipettaggio. In caso di graffi, rimuovere la piastra prima di analizzare.
6. Posizionare la piastra contenente le cellule in un incubatore non contenente CO₂ per 45 minuti (Figura 3A).
7. Utilizzo dei composti e dei terreni di analisi per produrre soluzioni madre di glucosio (100 mM), oligomicina (100 μM), Rot/AA (50 μM) e 2DG (500 mM) (Tabella 1).
8. Preparare una miscela per iniezione 10x di ciascun composto utilizzando il terreno di analisi (Tabella 2).

Scorte di iniezione (fornite nei kit)	Aggiungere un terreno di prova completo (mL)	Concentrazione finale dello stock (μM)
Glucosio	3	100 mila
Oligomicina	0.72	100
2-DG	3	100mila

Tabella 1. Scorte di iniezione

Porte sulla cartuccia	Soluzioni a magazzino	Aggiungi volume di stock	Aggiunta di terreni di analisi	Concentrazione finale delle iniezioni (10x)	Aggiungere questo volume alla porta designata (μL)	Concentrazione finale dopo l'iniezione in ogni pozzetto
Un	Glucosio (100 mM)	3000 μl + 0 μl		100 mM	20	10 mM
B	Oligomicina (100 μM)	300 μl + 2700 μl		10 μM	22	1,0 μM
C	Rotenone/ Antimicina A (50 μM)	300 μl + 2700 μl		5 μM	25	0,5 μM
D	2-DG (500 mM)	300 μl + 0 μl		500 mM	28	50 mM

Tabella 2. Concentrazioni finali di iniezione

9. Giorno del test: Esecuzione del test glicolitico acuto su macrofagi polarizzati

1. Aprire il modello salvato del test da stress di glicolisi (iniezione acuta) dal software. Il test di glicostress acuto predefinito prevede 3 minuti di miscelazione e misurazione prima di ogni iniezione.
2. Controlla il modello e i dettagli del test e, quando sei pronto, fai clic su Esegui e segui le istruzioni del test predefinito. Tuttavia, tutti i parametri possono essere personalizzati.
3. Rimuovere la cartuccia del sensore dall'incubatrice senza CO₂ , rimuovere il coperchio e inserirla nello strumento in modo che il pozzetto A1 della piastra della cartuccia cada nell'angolo in alto a sinistra del pannello di inserimento della macchina. Di solito, la calibrazione dura dai 20 ai 45 minuti.
4. Al termine della calibrazione, il dispositivo espellerà la piastra contenente la soluzione calibrante e manterrà la cartuccia del sensore. Rimuovere il calibrante contenente la piastra.
5. Rimuovere la piastra cellulare dall'incubatore non CO₂ , rimuovere il coperchio della piastra e inserirla nella macchina. Fare clic su Esegui (Figura 3B).
6. Al termine del test, la macchina espelle la piastra cellulare e la cartuccia del sensore.
7. Rimuovere il supporto dalla piastra e congelarlo a -20 °C per un'ulteriore normalizzazione.
8. Utilizzare il kit di test di proliferazione cellulare commerciale (ad es. CyQUANT) per normalizzare le cellule.
9. Aggiungere 1 mL di Composto B o tampone di lisi a 19 mL di acqua distillata priva di nucleasi.
10. Aggiungere 100 μl di soluzione di lavoro composta A o GR alla soluzione sopra menzionata.
11. Assicurarsi che le celle della piastra siano scongelate, quindi aggiungere 200 μl di soluzione a ciascun pozzetto.
12. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
13. Misura la fluorescenza in lunghezze d'onda di eccitazione di 480 nm e di emissione di 520 nm utilizzando un lettore di piastre.
14. Normalizza le celle sul pannello di normalizzazione del software.
15. Normalizzare le cellule in base alla conta delle cellule dei macrofagi naive (Figura 3C). Considera la media dei macrofagi naïve come 1 (dividendo il numero di cellule di ciascun pozzetto per il numero medio di cellule dei macrofagi naïve) e applicali a tutti i macrofagi.

Figura 3: Giorno del saggio: preparazione del terreno e del composto ed esecuzione del saggio. (A) Preparazione delle cellule per il saggio; (B) Preparazione, calibrazione ed esecuzione del saggio dei composti; (C) Normalizzazione e analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

La glicolisi e la fosforilazione ossidativa mitocondriale sono le due principali vie di produzione di ATP nelle cellule (Figura 4A). Alcune cellule hanno la capacità di passare da un percorso all'altro per soddisfare le loro richieste di energia. La conversione del glucosio in piruvato nel citoplasma è chiamata glicolisi. Il piruvato ha due destini; verrà convertito in lattato o ulteriormente metabolizzato attraverso il ci...

Discussione

Come accennato in precedenza, la macchina analizzatrice di flusso extracellulare può fornire informazioni in tempo reale su due principali percorsi di produzione di energia delle cellule misurando l'OCR (tasso di consumo di ossigeno), un indicatore dell'attività OXPHOS mitocondriale, e l'ECAR (tasso di acidificazione extracellulare) che è un indicatore della glicolisi. I macrofagi possono utilizzare entrambe le vie, a seconda del loro microambiente. Possono anche cambiare i loro perco...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
23G needles	VWR	BD305145
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
50ml Conical Tube	VWR	21008-951
ACK lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	A1049201	It can be lab-made
Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit User Guide	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206 (MMR) Antibody	BioLegend	141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ug	eBioscience	48-0112-82
BD 3ML - SYRINGE	VWR	BD309657	Other syringes are acceptable too
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete System	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	Cells can be manually counted too
Cell Strainer-70µm	VWR	10199-656
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 monoclonal antibody (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044
Flow cytometer: BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes	VWR	82003-822
LPS-SM ultrapure (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
Murine IL-4	Peprotech	214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38	BD Biosciences	553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Petri Dish 100mm x 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI, Glutamax, HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse Calibrant Solution	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200mM Glutamine Solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks	Agilent Technologies	102416-100
XF Glycolysis Stress Test Kit	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI Medium, pH 7.4 without phenol Red	Agilent Technologies	103336-100