Un modello di endotossina orientato all'unità di terapia intensiva riproducibile nei ratti

Riepilogo

Qui, presentiamo un modello di endotossina riproducibile orientato all'unità di terapia intensiva nei ratti.

Abstract

La sepsi e lo shock settico rimangono la principale causa di morte nelle unità di terapia intensiva. Nonostante i significativi miglioramenti nella gestione della sepsi, la mortalità varia ancora tra il 20 e il 30%. Sono urgentemente necessari nuovi approcci terapeutici al fine di ridurre il fallimento multiorgano correlato alla sepsi e la morte. Modelli animali robusti consentono uno o più approcci terapeutici e di testare il loro effetto sui parametri fisiologici e molecolari. In questo articolo viene presentato un semplice modello animale.

In primo luogo, l'anestesia generale è indotta negli animali con l'uso di volatili o mediante anestesia intraperitoneale. Dopo il posizionamento di un catetere endovenoso (vena della coda), la tracheostomia e l'inserimento di un catetere intraarterio (arteria della coda), viene avviata la ventilazione meccanica. Vengono registrati valori basali della pressione arteriosa media, della saturazione di ossigeno nel sangue arterioso e della frequenza cardiaca.

L'iniezione di lipopolisaccaridi (1 milligrammo/chilogrammo di peso corporeo) disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato induce una risposta infiammatoria forte e riproducibile attraverso il recettore toll-like 4. Le correzioni dei fluidi e l'applicazione della noradrenalina vengono eseguite sulla base di protocolli consolidati.

Il modello animale presentato in questo articolo è facile da imparare e fortemente orientato al trattamento clinico della sepsi in un'unità di terapia intensiva con sedazione, ventilazione meccanica, monitoraggio continuo della pressione sanguigna e prelievo di sangue ripetitivo. Inoltre, il modello è affidabile, consentendo dati riproducibili con un numero limitato di animali in conformità con i principi 3R (ridurre, sostituire, perfezionare) della ricerca sugli animali. Mentre gli esperimenti sugli animali nella ricerca sulla sepsi non possono essere facilmente sostituiti, le misurazioni ripetitive consentono una riduzione degli animali e mantenere gli animali settici anestetizzati diminuisce la sofferenza.

Introduzione

La sepsi e la sua forma più grave, lo shock settico, sono sindromi sul terreno di un'infezione, con conseguente reazione infiammatoria di overshooting con il rilascio di citochine, che porta a cambiamenti fisiologici e biochimici con una difesa immunitaria soppressa e risultati fatali ^1,2. Questa reazione infiammatoria squilibrata provoca disfunzione d'organo e insufficienza d'organo in vari organi vitali come polmone, rene e fegato. Con il 37%³, la sepsi è uno dei motivi più comuni per cui un paziente deve essere ricoverato in un'unità di terapia intensiva (ICU). La mortalità per sepsi attualmente varia intorno al 20-30%⁴. Un trattamento antibiotico precoce ed efficace è della massima importanza⁵. La rianimazione di liquidi e vasopressori deve essere installata precocemente, a parte questo, il trattamento è puramente di supporto⁶.

La sepsi è definita come un'infezione comprovata o sospetta con batteri, funghi, virus o parassiti, che è accompagnata da disfunzione d'organo. I criteri di shock settico sono soddisfatti quando un ulteriore collasso cardiovascolare non risponde al solo trattamento con fluidi e un livello di lattato superiore a 2 millimole / litro è presente². L'insufficienza d'organo correlata alla sepsi può verificarsi in qualsiasi organo, ma è molto comune nel sistema cardiovascolare, nel cervello, nei reni, nel fegato e nel polmone. La maggior parte dei pazienti affetti da sepsi richiede l'intubazione endotracheale per proteggere le vie aeree del paziente, per proteggere dall'aspirazione e per applicare una ventilazione espiratoria positiva con un'alta frazione di ossigeno inspirato per prevenire o superare l'ipossia. Al fine di tollerare un tubo tracheale e ventilazione meccanica, i pazienti di solito richiedono sedazione.

Le endotossine, come i lipopolisaccaridi (LPS) come componente della membrana dei batteri gram negativi, inducono una forte reazione infiammatoria attraverso il recettore toll-like (TLR) 4⁷. L'attivazione di un percorso definito assicura una reazione infiammatoria stabile. Citochine come la proteina 1 chemioattrattante dei neutrofili indotta da citochine (CINC-1), la proteina 1 chemioattrattante monocitaria (MCP-1) e l'interleuchina 6 (IL-6) sono note come fattori prognostici per gravità ed esito in questo modello⁸. L'applicazione di LPS per via endovenosa è stata utilizzata con successo per studiare vari aspetti della sepsi nei ratti ^8,9.

Il trattamento della sepsi è ancora una sfida, in particolare a causa della mancanza di modelli animali predittivi. Se l'endotossiemia con attivazione dell'infiammazione sistemica sia un modello adeguato per lo sviluppo di terapie farmacologiche è discutibile. Tuttavia, con il noto percorso TLR 4 indotto da LPS è possibile acquisire importanti conoscenze.

Protocollo

Tutti gli esperimenti presentati in questo protocollo sono stati approvati dalle autorità veterinarie del Cantone di Zurigo, Svizzera (numeri di approvazione 134/2014 e ZH088/19). Inoltre, tutte le fasi eseguite in questo esperimento sono state conformi alle Linee guida sugli esperimenti con gli animali dell'Accademia svizzera delle scienze medie (SAMS) e alle Linee guida della Federazione delle associazioni europee di scienza degli animali da laboratorio (FELASA).

1. Induzione dell'anestesia e monitoraggio degli animali

1. Tenere ratti Wistar maschi con un peso di 250-300 grammi (g) in gabbie ventilate in condizioni prive di agenti patogeni. Fornire un ciclo luce/buio di 12-12 ore a una temperatura ambiente di 22 ± 1 °C e libero accesso a cibo e acqua.
2. Indurre l'anestesia generale per induzione volatile con isoflurano (concentrazione del 3-5%) in una scatola di induzione dell'anestesia per 30 secondi (Figura 1A) o, in alternativa, indurre l'anestesia con un'iniezione a colpo singolo di ketamina/xilazina (10/1 milligrammo (mg) per 100 g di peso corporeo).
3. Trasferire l'animale in un luogo di lavoro e posare l'animale su un tappetino riscaldante durante l'intero esperimento. Mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37 °C.
4. Utilizzare un naso per fornire ossigeno (600 ml / minuto). Aggiungere isoflurano 2-3% se l'anestesia volatile è stata scelta per il mantenimento dell'anestesia. Assicurati che l'animale stia respirando spontaneamente.
5. Confermare il livello di anestesia dall'assenza del riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi prima dell'installazione della tracheostomia e dei cateteri arteriosi e venosi.
6. Verificare una sufficiente ossigenazione mediante monitoraggio della saturazione periferica di ossigeno (saturazione di ossigeno normale 98 - 100%).
7. Utilizzare un unguento (unguento alla vitamina A) per proteggere gli occhi.
8. Preparare strumenti chirurgici sterili e cateteri su un tavolino come mostrato nella Figura 1B.
9. Inoltre, preparare il monitoraggio della pressione e della saturazione di ossigeno come mostrato nella Figura 1C.

2. Accesso endovenoso

1. Applicare un laccio emostatico sulla coda prossimale del ratto per facilitare l'accesso venoso (Figura 2A).
2. Disinfettare la coda 3 volte con alcool.
3. Indurre un catetere endovenoso G26 in una delle due vene laterali della coda.
   NOTA: Dalla nostra esperienza è più facile posizionare l'accesso endovenoso nella parte distale della coda del ratto, perché la vena qui si trova più vicino alla pelle. Inoltre, in caso di cannulazione fallita, c'è abbastanza spazio per muoversi prossimalmente.
4. Evitare rigorosamente l'iniezione d'aria.
5. Sciogliere il laccio emostatico dopo aver posizionato il catetere endovenoso.
6. Fissare il catetere endovenoso in posizione con nastro adesivo (Figura 2B).
7. Collegare le pompe a siringa all'accesso endovenoso per l'applicazione continua di liquidi e farmaci.
8. Utilizzare rubinetti a 3 vie per il liquido in bolo, l'applicazione di farmaci e il prelievo di sangue venoso.

3. Tracheostomia

1. Radere l'area anteriore del collo dell'animale.
2. Disinfettare la pelle rasata 3 volte con la soluzione di providone-iodio.
3. Eseguire un'incisione longitudinale di circa 2 cm utilizzando un bisturi (con una lama numero 10).
4. Ritrarre la pelle con 2-0 suture di seta.
5. Preparare senza mezzi termini la laringe e la trachea con le forbici chirurgiche (Figura 3A).
6. Assicurati di aprire la trachea con micro forbici chirurgiche alla^3-5a fibbia tracheale.
7. Inserire una cannula tracheale sterile nella trachea. Fare attenzione, non inserire la cannula troppo in profondità per evitare la ventilazione unilaterale.
8. Fissare la cannula in posizione utilizzando una sutura di seta 2-0.
9. Collegare la cannula a un ventilatore per la ventilazione controllata dalla pressione o dal volume (Figura 3B).

4. Accesso arterioso

1. Disinfettare la coda del ratto 3 volte con la soluzione di povidone-iodio.
2. Tagliare la pelle usando un bisturi (con una lama numero 10) circa 1 cm longitudinalmente sul lato ventrale.
3. Fare attenzione, non tagliare troppo profondamente per evitare una lesione dell'arteria della coda.
4. Utilizzare un microscopio chirurgico per esporre l'arteria con attenzione. Tagliare la fascia che circonda l'arteria con micro forbici chirurgiche.
5. Ligate la parte distale dell'arteria usando una sutura di seta 6-0.
6. Preparare una sutura di seta prossimale 6-0 ma non stringere la seta (Figura 4A).
7. Introdurre un catetere G-26 nell'arteria tra la sutura di seta distale e prossimale.
8. Una volta che il catetere è nell'arteria, stringere la sutura di seta prossimale e fissare il catetere in posizione (Figura 4B).
9. Collegare il catetere a un trasduttore di pressione per fornire una misurazione continua della pressione arteriosa (pressione arteriosa media normale: 60 - 100 mmHg) (Figura 4C).
10. Inoltre, posizionare un rubinetto a 3 vie tra il catetere collegato al trasduttore di pressione e il catetere G-26 per il prelievo di sangue arterioso.

5. Misurazione di base, induzione della sepsi e misurazioni di follow-up

1. Dopo che l'animale ha raggiunto uno stato stazionario, iniettare l'LPS.
2. Raccogliere campioni di sangue quando viene raggiunto uno stato stazionario (di solito dopo 15-30 minuti).
3. Sostituire la perdita di liquidi da campioni di sangue con la soluzione di Ringer in un rapporto di 1:4.
4. Per indurre la sepsi, iniettare l'LPS come bolo o come applicazione LPS continua.
5. Per l'applicazione in bolo, iniettare 1 mg di LPS/chilogrammo di peso corporeo (kg) disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ad una concentrazione di 1 mg/ml.
6. Per l'applicazione continua, iniettare 300 μg di LPS/kg/ora durante l'intero esperimento utilizzando una pompa a siringa (soluzione madre di LPS: 1 mg/mL in PBS).
7. Evitare l'iniezione d'aria in ogni momento al fine di prevenire l'embolia atmosferica.
8. Definire protocolli di sostituzione dei fluidi, protocolli di applicazione vasocostrittori e criteri di aborto (ad esempio ipotensione definita come una pressione arteriosa media inferiore a 50 mmHg per più di 30 minuti nonostante la sostituzione del fluido) prima di impostare l'esperimento.
   NOTA: Si consiglia un'infusione continua della soluzione di Ringer ad una velocità di 10 ml/kg/ora.
9. Sottrarre qualsiasi somministrazione continua di fluidi (ad esempio, per l'applicazione LPS continua) dalla quantità infusa in modo che i risultati siano comparabili con quelli dei gruppi di controllo.
   NOTA: Alla fine dell'esperimento, e prima di prelevare qualsiasi organo come fegato, rene o milza per ulteriori analisi come l'esame istologico o biochimico, gli animali possono essere eutanasizzati da un'incisione della vena cava inferiore. Il metodo raccomandato di eutanasia è quello di portare gli animali su un piano chirurgico di anestesia prima dell'incisione della vena cava inferiore e dell'iniezione di soluzione salina ghiacciata nel cuore sinistro, specialmente se devono essere valutati marcatori infiammatori negli organi. Assicurarsi di rispettare i requisiti legali e le linee guida locali. Per verificare l'insufficienza d'organo correlata alla sepsi, è possibile analizzare il marcatore pro-apoptosi come la caspasi-3 e l'α1-microglobulina per verificare il danno tubulare nei reni. L'analisi specifica per organo di marcatori come CINC-1, MCP-1 e IL-6 può anche fornire informazioni sulla risposta infiammatoria specifica dell'organo.

Risultati

Il sistema presentato consente l'endotossiemia con animali emodinamicamente stabili come riportato in precedenza⁹. Mentre la pressione arteriosa media rimane stabile negli animali con e senza stimolazione LPS gli animali trattati con LPS sviluppano caratteristiche di sepsi come un eccesso di base negativo e una forte reazione infiammatoria misurata dalle citochine plasmatiche (6 ore dopo l'applicazione) come CINC-1 (867 ng / mL), MCP-1 (5027 ng / mL) e IL-6 (867 ng / mL) ⁸,...

Discussione

Il protocollo qui descritto consente un modello di sepsi altamente riproducibile, ma semplice da imparare, che può essere adattato in base alla domanda di ricerca. I dati essenziali in vivo che si riferiscono alla funzione degli organi come la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna e la saturazione di ossigeno arterioso periferico possono essere raccolti continuamente e il prelievo di sangue può essere eseguito ripetutamente durante l'esperimento. Inoltre, è possibile installare modifiche relative ai protocolli di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Standard surgical
Alaris Syringe Pump	Bencton Dickinson
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7.68034E+12	GTIN-number
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Facilitates vascular preparation
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Infinity Delta XL Anesthesia monitoring	Draeger, Lübeck, Germany
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Ketamine (Ketalar)	Pfitzer, New York, NY
Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5	Sigma, Buchs, Switzerland
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Ringerfundin	Bbraun, Melsungen, Germany
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Xylazine (Xylazin Streuli)	Streuli AG, Uznach, Switzerland