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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un saggio di reporter per studiare la regolazione della traduzione dell'mRNA in singoli ovociti durante la maturazione in vitro.

Abstract

Gli eventi associati alla maturazione nucleare degli ovocite sono stati ben descritti. Tuttavia, molto meno si sa delle vie molecolari e dei processi che si svolgono nel citoplasma in preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Durante la maturazione degli ovocite, i cambiamenti nell'espressione genica dipendono esclusivamente dalla traduzione e dal degrado degli RNA messaggeri materni (mRNA) piuttosto che dalla trascrizione. L'esecuzione del programma trascizionale, quindi, svolge un ruolo chiave nello stabilire la competenza allo sviluppo degli ovocite per sostenere lo sviluppo degli embrioni. Questo articolo fa parte di un focus sulla definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno che avviene durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovocita e zigote. In questo documento di metodo viene presentata una strategia per studiare la regolazione della traduzione degli mRNA bersaglio durante la maturazione degli ovocite in vitro. Qui, un reporter Ypet viene fuso alla regione non tradotta 3 ' (UTR) del gene di interesse e quindi micro-iniettato in ovociti insieme alla codifica dell'mRNA poliadenilato per mCherry per controllare il volume iniettato. Utilizzando la microscopia time-lapse per misurare l'accumulo del reporter, i tassi di traduzione sono calcolati a diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite. Qui, sono stati descritti i protocolli per l'isolamento e l'iniezione degli ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati, usando il reporter UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' come esempio.

Introduzione

Un ovocita di mammiferi completamente cresciuto subisce rapidi cambiamenti nella preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Questi cambiamenti sono essenziali per sostenere lo sviluppo embrionale dopo la fecondazione. Sebbene gli eventi associati alla maturazione nucleare siano relativamente ben descritti, molto meno si sa dei processi molecolari e delle vie nel citoplasma degli ovocite. Durante le fasi finali della maturazione degli ovociti, gli ovociti sono trascrittamente silenziosi e l'espressione genica dipende interamente dalla traduzione e dalladegradazione dell'mRNA 1,2. La sintesi di proteine critiche per la competenza allo sviluppo, quindi, si basa su un programma di traduzione a tempo di mRNA di lunga durata che sono stati sintetizzati in precedenza durante la crescita degli ovocite1,3. Come parte di un focus sulla definizione di questo programma di traduzione dell'mRNA materno eseguito durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovociti e zigoti, questo documento presenta una strategia per studiare l'attivazione e la repressione della traduzione degli mRNA materni bersaglio in singoli ovociti durante la maturazione meiotica in vitro.

In questo metodo, il frame di lettura aperto YPet viene clonato a monte dell'UTR 3 ' della trascrizione di interesse. Successivamente, gli mRNA che codificano questo reporter vengono micro-iniettati in ovociti insieme a mRNA poliadenylati che codificano mCherry per controllare il volume iniettato. L'accumulo di reporter viene misurato durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro utilizzando la microscopia time-lapse. L'accumulo di proteine fluorescenti gialle (YFP) e mCherry è registrato nei singoli ovociti, e i segnali YFP sono corretti dal livello stabilizzato della mCherry co-iniettata. Dopo l'acquisizione dei dati, i tassi di traslazione sono calcolati per intervalli di tempo diversi durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro calcolando la pendenza della curva ottenuta mediante raccordo a curva.

Questo approccio fornisce uno strumento per confermare sperimentalmente i cambiamenti nella traduzione di mRNA endogeni selezionati. Inoltre, questo metodo facilita la caratterizzazione di elementi normativi che controllano la traslazione durante la maturazione meiotica degli ovocite manipolando gli elementi cis-regolatori dell'UTR 3' degli mRNA target4,5,6. La manipolazione della lunghezza della coda poli(A) consente anche di comprendere l'attività dell'adenilasi/deadenylasi negli ovociti5. La mutagenesi degli elementi ad azione cis o l'immunoprecipitazione dell'RNA possono essere utilizzate per studiare le interazioni con le proteine leganti l'RNAimparentate 6,7. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare componenti essenziali del programma di traduzione che sono fondamentali per la competenza allo sviluppo degli ovocite misurando la traduzione UTR target 3' nei modelli associati alla riduzione della qualità degli ovocite 8,9,10. Questo documento di metodo presenta un esperimento rappresentativo in cui ovociti denudati di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati micro-iniettati con un reporter Ypet fuso all'UTR 3' di IL-7. Sono stati descritti l'impostazione e il protocollo per l'iniezione di ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati.

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Protocollo

Le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California a San Francisco (protocollo AN182026).

1. Preparazione dei mezzi di comunicazione

  1. Aggiungere tutti i componenti, come descritto nella tabella 1, per rendere il mezzo di raccolta degli ovocite di base e il mezzo di maturazione degli ovocite. Per il supporto di raccolta di base, impostare il pH su 7.4. Sia per il mezzo di raccolta che per quello di maturazione, aggiungere 3 mg/mL di albumina sierice bovina (BSA) e 1 μM di cilostamide il giorno dell'uso.

2. Preparazione della codifica mRNA per UTR Ypet-3' e mCherry

  1. Ottenere le sequenze UTR 3′ degli mRNA di interesse.
    NOTA: Per questo studio, le sequenze sono state precedentemente ottenute dall'ovocite del topo cDNA.
  2. Progettare primer per amplificare gli UCRA 3' di destinazione dal cDNA degli ovociti e parti del vettore pcDNA 3.1 contenenti una sequenza di codifica Ypet, un tag V5-epitopo e un promotore T7.
  3. Amplificare utilizzando un kit di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire i prodotti di reazione a catena della polimerasi (PCR) su un gel per verificare se i frammenti hanno le dimensioni corrette, tagliare le bande ed estrarre il DNA dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
  4. Fusi i frammenti PCR a un vettore utilizzando un kit di clonazione PCR.
    NOTA: I frammenti di PCR sono stati incubati sul ghiaccio per 4 ore per facilitare un processo di ricombinazione più efficiente. Ciò è contrario alle istruzioni del produttore, che raccomandano un tempo di incubazione di soli 45 minuti.
  5. Trasfetto frammenti PCR in 5-α escherichia coli competenti.
    1. Aggiungere il mix e il plasmide ai batteri e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
    2. Scaldare il mix e il plasmide mettendo la miscela in un bagno d'acqua a 42 °C per 45 s e raffreddare immediatamente sul ghiaccio per 3 minuti.
    3. Aggiungere 500 μL di brodo Super Optimal con mezzo di repressione catabolita (SOC) e incubare per 1 h a 37 °C.
    4. Spin down a 7000 × g per 2 min, e rimuovere la maggior parte del supernatante. Resuspend e piastra su una piastra di agar Luria Broth (LB) con l'antibiotico di selezione appropriato.
      NOTA: Carbenicillina è stata utilizzata in questo studio.
    5. Incubare durante la notte a 37 °C. Isolare le colonie premendo leggermente una punta di pipetta su una delle colonie e posizionarla in 3 mL di mezzo LB con 100 μg/mL di carbenicillina. Incubare per 12-24 ore a 37 °C.
    6. Estrarre il DNA dei plasmidi utilizzando il kit di isolamento del DNA plasmide secondo le istruzioni del produttore e confermare le sequenze tramite sequenziamento del DNA.
  6. Per Ypet/3' UTR:
    1. Produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro. Utilizzare un primer in avanti a monte della sequenza Ypet e un primer inverso con 20 residui di timina aggiuntivi. Cfr. tabella 2 per la sequenza dell'UTR Ypet/IL-7 3' e le sequenze dei primer avanti e indietro.
      NOTA: Questi residui aggiuntivi di timina aggiungeranno oligo(A) all'mRNA lineare dopo la trascrizione in vitro .
    2. Trascrivere in vitro il prodotto PCR utilizzando un kit di trascrizione T7 secondo le istruzioni del produttore.
    3. Purificare l'RNA complementare risultante (cRNA) utilizzando un kit di pulizia della trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
    4. Elutare il cRNA purificato in acqua priva di RNAse, misurare la concentrazione e valutare l'integrità mediante elettroforesi di agarosio. Conservare a -80 °C.
  7. Per mCherry:
    1. Produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro utilizzando un enzima di restrizione ad alta fedeltà; utilizzare l'enzima di restrizione mfEI-HF se si replica questo esempio. Digerire in un tampone di digestione durante la notte a 37 °C.
    2. Eseguire un gel per purificare il campione ed estrarre il DNA lineare utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
    3. Trascrivere in vitro il prodotto PCR utilizzando un kit di trascrizione T7 secondo le istruzioni del produttore.
    4. Poliadenilato il cRNA (150-200 nucleotidi) utilizzando un kit di pedinamento poli(A) secondo le istruzioni del produttore.
    5. Purificare il cRNA risultante utilizzando un kit di pulizia della trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
    6. Elutare il cRNA purificato in acqua priva di RNA, misurare le concentrazioni di mRNA e valutare l'integrità del messaggio mediante elettroforesi del gel. Conservare a -80 °C.

3. Procedura sperimentale

NOTA: Nella figura 1è fornita una panoramica schematica della microiezione degli ovocici e della successiva microscopia time-lapse .

  1. Giorno 1
    1. Iniettare per via intraperitoneale topi di 21 giorni con 5 UI di gonadotropina siere della cavalla incinta per promuovere la crescita del follicolo allo stadioantrale 11.
  2. Giorno 3
    1. Collezione di ovocite
      1. Sacrifica i topi 44-48 ore dopo l'adescamento per raccogliere le ovaie e mettili in una piastra di Petri di plastica con mezzo di raccolta degli ovocite di base.
      2. Aprire con cura i follicoli astrali facendo un piccolo taglio nella parete del follicolo con un ago da 26 G. Isolare gli ovociti cumuli-chiusi intatti (COC) con diversi strati di cellule cumuliche utilizzando una pipetta di vetro azionata dalla bocca.
      3. Utilizzare una pipetta più piccola (leggermente più grande del diametro dell'ovocita) e denudare meccanicamente i COC mediante pipettazione ripetuta.
        NOTA: In alternativa, eseguire la microiezione su COC intatti.
      4. Utilizzando una pipetta più grande, aspirare gli ovociti denudati e metterli in una piastra di Petri con mezzo di maturazione integrato con 1 μM dell'inibitore della fosfodiesterasi, cilostamide, per evitare la ripresa della maturazione meiotica12. Mettere il piatto nell'incubatrice per 2 ore per lasciare che gli ovociti si riprendano dallo stress indotto dall'isolamento degli ovociti dai follicoli.
    2. Microintesi degli ovocite
      1. Preparare gli aghi di iniezione posizionando un tubo capillare in vetro borosilicato lungo 10 cm in un estrattore meccanico. Per un'iniezione ottimale, piegare la punta dell'ago con un angolo di 45° utilizzando un filamento riscaldato.
      2. Preparare piatti in polistirolo con goccioline da 20 μL di mezzo di raccolta di ovocite di base e coprire le goccioline con olio minerale leggero.
      3. Preparare una miscela di reporter aggiungendo 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR e 12,5 μg/μL mCherry. Preparare un volume maggiore e creare aliquote per esperimenti futuri per garantire concentrazioni simili di reporter. Conservare queste aliquote a -80 °C. Al momento dello scongelamento, centrifuga prima l'aliquota per 2 minuti a 20.000 x ge trasferisci in un nuovo tubo di microcentrifugo.
        NOTA: Questa centrifugazione impedirà all'ago di iniezione di intasarsi da potenziali aggregati nel mix di reporter.
      4. Caricare l'ago di iniezione per capillarità con circa 0,5 μL di miscela di reporter.
      5. Posizionare la pipetta di tenuta e l'ago di iniezione caricato nei supporti e posizionarsi nella goccia del mezzo di raccolta degli ovocite. Aspirare parte del mezzo nella pipetta di tenuta.
      6. Aprire l'ago di iniezione toccandolo delicatamente contro la pipetta di tenuta.
      7. Mettere gli ovociti in una goccia di mezzo di raccolta di base e iniettare 5-10 pL del mix di reporter.
      8. Incubare gli ovociti nel mezzo di maturazione con 1 μM cilostamide per 16 ore per consentire al segnale mCherry di stabilizzarsi.
      9. Preparare una piastra di Petri che verrà utilizzata per la microscopia time-lapse con almeno due goccioline da 20 μL di mezzo di maturazione per ogni reporter iniettato: una goccia con cilostamide da 1 μM per il controllo degli ovociti arrestati I e una goccia senza cilostamide per gli ovociti maturi. Coprire le goccioline con olio minerale leggero e posizionarlo nell'incubatrice.
    3. Microscopia time-lapse
      1. Dopo la pre-incubazione, rimuovere gli ovociti iniettati dall'incubatrice e lavarli quattro volte in mezzo di maturazione senza cilostamide. Mantenere alcuni ovociti in mezzo di maturazione con 1 μM cilostamide come gruppo di controllo degli ovociti arrestato da prophase I.
      2. Trasferire gli ovociti iniettati nelle rispettive goccioline sul piatto del microscopio time-lapse precedentemente preparato. Raggruppare gli ovociti utilizzando una pipetta di vetro chiusa (una pipetta chiusa può essere preparata tenendo la punta in fiamme per alcuni secondi).
        NOTA: Il raggruppamento degli ovociti aiuta a prevenirne il movimento durante la registrazione.
      3. Posizionare il piatto al microscopio dotato di un sistema di illuminazione a diodi emettitori di luce e di uno stadio motorizzato dotato di una camera ambientale mantenuta a 37 °C e al 5% di CO2. Per replicare questo studio, utilizzare i seguenti parametri: set di filtri: specchio dicroico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canale YFP (Eccitazione (Ex): S500/20 × 49057; Emissione (EM): D535/30 m 47281), canale mCherry (Es: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
      4. Immettere le impostazioni appropriate per l'esperimento time-lapse (vedere Table of Materials per il software utilizzato in questo studio): Fare clic su App | Acquisizione multidimensionale. Selezionare la prima scheda Main e selezionare timelapse, posizioni a più fasi elunghezze d'onda multiple.
      5. Selezionare la scheda Salvataggio per immettere la posizione in cui salvare l'esperimento.
      6. Selezionare la tabulazione Timelapse per immettere il numero di punti di tempo, la durata e l'intervallo di tempo.
        NOTA: La durata dell'esperimento time-lapse dipende dalle specie animali studiate, poiché la tempistica della maturazione meiotica degli ovocite differisce da una specie all'altra. In questo esperimento con gli ovociti del topo, gli ovociti sono stati registrati ogni 15 minuti per 16 ore.
      7. Selezionare la scheda Stage. Attivare brightfield e individuare la posizione degli ovociti aprendo una nuova finestra selezionando Acquisisci | Acquisire | Mostra in diretta. Una volta localizzati gli ovociti, tornare alla finestra Acquisizione multidimensionale e premere + per impostare la posizione degli ovociti.
      8. Selezionare le lunghezze d'ondadella scheda e impostare 3 diverse lunghezze d'onda per brightfield (esposizione 15 ms), YFP (esposizione 150 ms per Ypet/IL7 3' UTR) e mCherry (esposizione 75 ms per Ypet/IL7 3' UTR).
        NOTA: Regolare l'esposizione per ogni reporter UTR Ypet/3' in base al livello di accumulo del reporter e al volume iniettato. Assicurarsi che il segnale YFP cada al centro della gamma di rilevamento all'inizio dell'esperimento per evitare sottovalutazioni o saturazioni in caso di attivazione della traduzione. Per mCherry, regolare l'esposizione per ogni lotto di mCherry in quanto il segnale dipende dal numero di nucleotidi di adenina aggiunti durante la procedura di poliadenilazione. A causa della variazione dell'efficienza della poliadenilazione, utilizzare lo stesso lotto di mCherry in diversi esperimenti per un migliore confronto tra esperimenti.
      9. Avviare l'esperimento time lapse facendo clic su Acquire. Vedere la figura 2 e il file supplementare per un esempio di registrazione time-lapse in un singolo ovocita.
    4. Analisi della traduzione UTR Ypet-3'
      1. Per questa analisi (vedi Tabella dei materiali per il software utilizzato in questo studio), eseguire due misurazioni della regione per ogni ovocita: l'ovocita stessa-click sulla regione dell'ellisse e circondare l'ovocita-e una piccola regione vicino all'ovocita da utilizzare per la sottrazione di fondo-click sulla regione rettangolare.
        NOTA: Assicurarsi che gli ovociti non si spostino fuori dalla regione selezionata durante la registrazione time-lapse. Prestare particolare attenzione al posizionamento della misurazione della regione intorno all'estrusione del corpo polare, in quanto ciò causa movimento nell'ovocita e può distorcere la registrazione.
      2. Esportare i dati di misurazione dell'area in un foglio di calcolo facendo clic prima su Apri registro e quindi su Dati registro per esportare il software di analisi dei dati.
      3. Per ogni singolo ovocita e per tutti i punti di tempo misurati, sottrarre la misurazione della regione di sfondo dalla misurazione della regione degli ovocita. Eseguire questa operazioni per le lunghezze d'onda YFP e mCherry separatamente.
      4. Registrare la tempistica della rottura germinale della vescicola (GVBD) e dell'estrusione del corpo polare (PBE) per un riferimento successivo.
        NOTA: Escludere gli ovociti del mouse in maturazione quando GVBD supera le 2 ore.
      5. Tracciate l'espressione YFP e mCherry nel tempo per ogni ovocita da verificare per verificare la presenza di valori anomali.
        NOTA: Questa dovrebbe essere una curva liscia, se non lo è questo può indicare che l'ovocita si è spostato durante la registrazione.
      6. Per ogni singolo ovocita, calcolare l'espressione media mCherry per gli ultimi dieci punti di tempo della registrazione. Per ogni punto di tempo, dividere l'espressione YFP per l'espressione mCherry mediata per correggere il volume iniettato per ottenere un rapporto YFP/mCherry in ogni punto di tempo per ogni singolo ovocito.
      7. Calcolare i tassi di traslazione per un intervallo di tempo specifico adattando la pendenza della curva in base alla regressione lineare. Valutare le differenze nei tassi di traduzione utilizzando l'inferenza statistica.

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Risultati

Gli ovociti arrestati dai prophase I di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati iniettati con un mix di reporter contenente mRNA che codifica per il reporter Ypet fuso all'UTR 3' di IL-7 e mRNA che codifica per mCherry. L'espressione YFP e mCherry è stata registrata in 39 ovociti, di cui 30 maturi, e 9 sono stati arrestati in prophase I come controllo negativo. Tre ovociti in maturazione sono stati esclusi per l'analisi perché avevano un GVBD ritardato (N=2) o si sono spostati nella piastra durante la registrazione (N=1)....

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Discussione

Il metodo presentato descrive una strategia per studiare l'attivazione e la repressione della traduzione dell'mRNA bersaglio in diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro. IL-7, una citochina rilasciata dall'ovocito che può essere coinvolta nella comunicazione cellulare ovocita-cumulo8,13, è stata scelta allo scopo di descrivere questo metodo. IL-7 è noto per essere sempre più tradotto durante la maturazione degli ovoc...

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM097165, GM116926 ed Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello è stato sostenuto da una borsa di studio della Fondazione Lalor e Natasja G. J. Costermans è stata sostenuta da una borsa di studio Rubicon dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamideEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile FilteredGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodium Bicarbonate JT-Baker3506-1
Sodium PyruvateGibco 11360-070
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Cloning KitMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
DNA loading dye (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (Capsules)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife TechnologiesAM1908
MfeI-HF restriction enzymeNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(A) Tailing kitInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
TAE buffer Apex Biomedical 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettesSigma-AldrichA5177-5EA
Calibrated micro-pipettesDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2BD305111
Syringe 1 mlBD309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-0-20-CFor time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentBF100-78-10
Oil for Embryo CultureIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006For micro-injection
Tissue Culture DishFalcon353001For oocyte incubation
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPreparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0 Molecular Devices For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

Riferimenti

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