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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui descriviamo strumenti e metodi computazionali che consentono la visualizzazione e l'analisi di dati di immagini tridimensionali e quadridimensionali di embrioni di topo nel contesto dell'allungamento e della segmentazione assiale, ottenuti mediante tomografia a proiezione ottica in toto e mediante imaging dal vivo e colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero utilizzando la microscopia multifotonica.

Abstract

La somitogenesi è un segno distintivo dello sviluppo embrionale dei vertebrati. Per anni, i ricercatori hanno studiato questo processo in una varietà di organismi utilizzando una vasta gamma di tecniche che comprendono approcci ex vivo e in vitro. Tuttavia, la maggior parte degli studi si basa ancora sull'analisi dei dati di imaging bidimensionali (2D), che limita la corretta valutazione di un processo di sviluppo come l'estensione assiale e la somitogenesi che coinvolgono interazioni altamente dinamiche in uno spazio 3D complesso. Qui descriviamo le tecniche che consentono l'acquisizione di immagini dal vivo del topo, l'elaborazione di set di dati, la visualizzazione e l'analisi in 3D e 4D per studiare le cellule (ad esempio, progenitori neuromesodermici) coinvolte in questi processi di sviluppo. Forniamo anche un protocollo passo-passo per la tomografia a proiezione ottica e la microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di topo (dalla preparazione del campione all'acquisizione di immagini) e mostriamo una pipeline che abbiamo sviluppato per elaborare e visualizzare i dati delle immagini 3D. Estendiamo l'uso di alcune di queste tecniche ed evidenziamo caratteristiche specifiche di diversi software disponibili (ad esempio, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) che possono essere utilizzate per migliorare la nostra attuale comprensione dell'estensione assiale e della formazione di somiti (ad esempio, ricostruzioni 3D). Complessivamente, le tecniche qui descritte sottolineano l'importanza della visualizzazione e dell'analisi dei dati 3D nella biologia dello sviluppo e potrebbero aiutare altri ricercatori ad affrontare meglio i dati delle immagini 3D e 4D nel contesto dell'estensione e della segmentazione assiale dei vertebrati. Infine, il lavoro impiega anche nuovi strumenti per facilitare l'insegnamento dello sviluppo embrionale dei vertebrati.

Introduzione

La formazione dell'asse del corpo dei vertebrati è un processo altamente complesso e dinamico che si verifica durante lo sviluppo embrionale. Alla fine della gastrulazione [nel topo, intorno al giorno embrionale (E) 8.0], un gruppo di cellule progenitrici epiblastiche note come progenitori neuromesodermici (NMP) diventa un fattore chiave dell'estensione assiale in una sequenza testa a coda, generando il tubo neurale e i tessuti mesodermici paraassiali durante la formazione del collo, del tronco e della coda 1,2,3,4 . È interessante notare che la posizione che questi NMP occupano nell'epiblasto caudale sembra svolgere un ruolo chiave nella decisione di differenziarsi in mesoderma o neuroectoderma5. Sebbene attualmente non ci sia un'impronta molecolare precisa per le NMP, queste cellule sono generalmente ritenute co-espressive T (Brachyury) e Sox2 5,6. I meccanismi esatti che regolano le decisioni sul destino dell'NMP (cioè se prendono vie neurali o mesodermiche) stanno solo iniziando a essere definiti con precisione. L'espressione di Tbx6 nella regione della striscia primitiva è un marcatore precoce della decisione del destino NMP, poiché questo gene è coinvolto nell'induzione e nella specificazione del mesoderma 6,7. È interessante notare che le prime cellule del mesoderma sembrano esprimere alti livelli di Epha18 e la segnalazione Wnt / β-catenina, così come Msgn1 hanno anche dimostrato di svolgere ruoli importanti nella differenziazione del mesoderma paraassiale e nella formazione di somiti 9,10. Un'analisi spazio-temporale completa delle NMP a livello di singola cellula sarà certamente strumentale per comprendere appieno i meccanismi molecolari che controllano la specifica del mesoderma.

La formazione di somiti (precursori delle vertebre) è una caratteristica chiave dei vertebrati. Durante l'allungamento assiale, il mesoderma paraassiale viene segmentato in una serie di unità ripetute bilaterali note come somiti. Il numero di somiti e il tempo necessario per la formazione di nuovi segmenti varia tra le specie11,12. La somitogenesi comporta oscillazioni periodiche di segnalazione (note come "orologio di segmentazione") che possono essere osservate dall'espressione ciclica di diversi geni delle vie di segnalazione Notch, Wnt e Fgf nel mesoderma presomitico (ad esempio, Lfng)11,12. L'attuale modello di somitogenesi postula anche l'esistenza di un "fronte d'onda di maturazione", una serie di complessi gradienti di segnalazione che coinvolgono la segnalazione di Fgf, Wnt e acido retinoico che definiscono la posizione del bordo posteriore di ogni nuovo somite. Un'interazione coordinata tra il "segmentation clock" e il "fronte d'onda di maturazione" è quindi fondamentale per la generazione di questi moduli precursori delle vertebre in quanto le perturbazioni in questi processi morfogenetici chiave possono provocare letalità embrionale o la formazione di malformazioni congenite (ad esempio, scoliosi)13,14,15.

Nonostante i recenti progressi sostanziali nelle tecniche di imaging, nei metodi di analisi delle bioimmagini e nel software, la maggior parte degli studi sull'allungamento assiale e sulla somitogenesi si basano ancora su dati di immagini bidimensionali singole / isolate (ad esempio, sezioni), che non consentono una visualizzazione completa del tessuto multidimensionale e complicano una chiara differenziazione tra malformazioni patologiche (cioè dovute a mutazioni) rispetto alla normale variazione morfologica che si verifica durante lo sviluppo embrionale16 . L'imaging in 3D ha già scoperto nuovi movimenti morfogenetici, precedentemente non identificati con i metodi 2D standard 17,18,19,20, evidenziando il potere dell'imaging in toto per comprendere i meccanismi della somitogenesi dei vertebrati e dell'estensione assiale.

La microscopia 3D e 4D di embrioni di topo, in particolare l'imaging dal vivo, è tecnicamente impegnativa e richiede passaggi critici durante la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e la pre-elaborazione dei dati al fine di consentire un'analisi spazio-temporale accurata e significativa. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'imaging dal vivo e la colorazione dell'immunofluorescenza a montaggio intero degli embrioni di topo, che può essere utilizzato per studiare sia le NMP che le cellule mesodermiche durante l'estensione e la segmentazione assiale. Inoltre, descriviamo anche un protocollo per la tomografia a proiezione ottica (OPT) di embrioni e feti più anziani, che consente la visualizzazione 3D in toto e la quantificazione di anomalie patologiche che possono derivare da problemi durante la somitogenesi (ad esempio, fusione ossea e scoliosi)13,21,22. Infine, illustriamo la potenza delle ricostruzioni di imaging 3D nello studio e nell'insegnamento della segmentazione dei vertebrati e dell'allungamento assiale.

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Protocollo

Gli esperimenti che coinvolgono animali hanno seguito le legislazioni portoghese (Portaria 1005/92) ed europea (direttiva 2010/63/UE) in materia di alloggio, allevamento e benessere. Il progetto è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico dell'Instituto Gulbenkian de Ciência e dall'Ente Nazionale Portoghese ,Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (riferimento di licenza: 014308).

1. Preparazione del campione per l'imaging 3D e 4D

NOTA: Qui forniamo una descrizione dettagliata su come sezionare e preparare embrioni di topo da E8,25 a E10,5 per l'imaging dal vivo (1,1), embrioni da E7,5 a E11,5 per microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero (1.2) e feti per tomografia a proiezione ottica (1.3).

  1. Preparazione del campione per l'imaging dal vivo
    1. Dissezione dell'embrione di topo e preparazione per l'imaging dal vivo (ad esempio, LuVeLu reporter 23).
      1. Sezionare embrioni di topo tra E8,25 ed E10,5 in mezzo M2 preriscaldato (37 °C). Rimuovere delicatamente il sacco vitellino con una pinza pulita e lavare l'embrione una volta con un mezzo M2 fresco per rimuovere il sangue e i detriti prodotti durante la dissezione.
        NOTA: È importante evitare di danneggiare l'embrione in alcun modo, altrimenti non si svilupperà correttamente durante la procedura di imaging dal vivo.
      2. Durante la procedura di imaging dal vivo, incubare gli embrioni in una camera riscaldata (37 °C), in un ambiente 65% O2 e 5% CO2 (N2 bilanciato), in mezzo DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con 10% di siero bovino fetale definito HyClone, 2 mM L-glutammina e 1% penicillina-streptomicina.
        NOTA: Queste condizioni di coltura consentono lo sviluppo embrionale per circa 10 ore. Altri protocolli 9,10, utilizzando diverse condizioni di coltura, potrebbero consentire periodi ancora più lunghi.
  2. Preparazione del campione per microscopia a immunofluorescenza
    1. Procedura di dissezione e fissazione dell'embrione di topo
      1. Sezionare embrioni di topo da E7,5 a E11,5 in soluzione salina tamponata con fosfato freddo (4 °C) (PBS) o in mezzo M2. Dopo la rimozione di tutte le membrane extra-embrionali (ad esempio, la membrana di Reichart o il sacco vitellino) lavare l'embrione in PBS fresco per rimuovere il sangue e i detriti prodotti durante la procedura di dissezione.
      2. Fissare gli embrioni a 4 °C, in paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS, per il tempo specificato nella Tabella 1.
        ATTENZIONE - Il PFA deve essere maneggiato all'interno di una cappa aspirante
        Fase di sviluppoTempo di fissazione raccomandato (PFA 4%)
        E7,5 ·1h30
        E8,5 ·2 ore
        E9,5 ·3 ore
        E10,5 ·4 ore
        E11,5 ·4 ore
        Tabella 1 - Tempi di fissazione per embrioni in diversi stadi di sviluppo
      3. Dopo la fissazione, lavare gli embrioni almeno due volte (5-10 minuti ciascuno) in PBS per rimuovere completamente il PFA. A questo punto, gli embrioni possono essere portati direttamente nel protocollo di colorazione dell'immunofluorescenza (Fase 1.2.2) o possono essere disidratati e conservati per un uso futuro (Fase 1.2.1.4).
      4. Se necessario, conservare gli embrioni a -20 °C in metanolo al 100% per lunghi periodi.
        1. Per migliorare la conservazione dei tessuti, disidratare gradualmente l'embrione con aumenti del 10% della concentrazione di metanolo (diluito in PBS), ogni passo 10 minuti a temperatura ambiente (RT) su uno shaker, fino a raggiungere il 100% di metanolo. Sostituire il metanolo al 100% una volta usando un'aliquota fresca.
        2. Recuperare gli embrioni congelati per reidratazione seguendo una serie di metanolo inverso / PBS, ogni fase 10 minuti a RT su uno shaker, e con lavaggi finali in PBS (due volte, 5-10 minuti ciascuno) prima di entrare nel protocollo di immunocolorazione.
          ATTENZIONE - Il metanolo deve essere maneggiato all'interno di una cappa aspirante.
    2. Colorazione immunofluorescenza a tutto monte
      NOTA: Il seguente protocollo di colorazione a immunofluorescenza è stato adattato dalla procedura descritta in Osorno et al.24. Tutti i lavaggi dovrebbero essere eseguiti su uno shaker. Dopo la fase di blocco, le incubazioni vengono eseguite a 4 °C per garantire l'integrità/conservazione degli anticorpi.
      1. Lavare gli embrioni tre volte (30 minuti ciascuno) in PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100 (0,1% PBST) e poi una volta nello 0,5% di PBST per 1 ora (RT) per migliorare la permeabilizzazione.
      2. Per ridurre il legame aspecifico, lavare in glicina 1 M in PBS (pH 7,5) per 30 minuti a RT.
      3. Lavare tre volte in 0,1% PBST per 30 minuti per rimuovere completamente la glicina.
      4. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 °C in soluzione bloccante contenente: 3% di siero (dalla specie animale in cui sono stati prodotti gli anticorpi secondari), 1% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,1% di Triton X-100, in PBS.
      5. Diluire gli anticorpi primari in soluzione bloccante (normalmente 1:200 per gli anticorpi T e Sox2) e incubare per due o tre giorni a 4 °C.
      6. Prima di aggiungere gli anticorpi secondari, lavare gli embrioni tre volte (30 minuti ciascuno) in PBST allo 0,1% a 4 °C. Diluire gli anticorpi secondari in soluzione bloccante (1:1000) e incubare per 2 giorni a 4 °C, al riparo dalla luce.
      7. Lavare gli embrioni sei volte (30 minuti ciascuno) in PBST allo 0,1% a 4 °C.
      8. Per la controcolorazione nucleare, incubare embrioni in 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI), diluiti 1:500 in PBST, durante la notte su uno shaker a 4 °C, protetto dalla luce.
      9. Infine, lavare gli embrioni tre volte (30 minuti ciascuno) in PBST allo 0,1% a 4 °C.
    3. Pulizia dei tessuti e preparazione dei vetrini
      1. Pulizia dei tessuti con metil salicilato o una miscela di alcool benzilico con benzil benzoato (BABB)
        1. Prima di eliminare con metil salicilato o BABB, disidratare completamente gli embrioni portandoli al 100% di metanolo, attraverso una serie di metanolo/PBS costituita da successivi aumenti del 10% della concentrazione di metanolo (tempi di incubazione di 10 minuti ciascuno a 4 °C). Per ottenere una completa disidratazione, sostituire il metanolo al 100% con uno fresco e attendere altri 10 minuti.
        2. Eseguire la pulizia degli embrioni incorporando in una serie di metil salicilato o BABB in metanolo con aumenti successivi del 20% della concentrazione, incubazione di 20 minuti per ogni fase. Quando il metil salicilato o la soluzione BABB raggiunge il 100%, apportare due modifiche aggiuntive per una soluzione fresca.
          ATTENZIONE: sia il metil salicilato che il BABB devono essere maneggiati all'interno di una cappa aspirante.
          NOTA: Per una corretta pulizia, è essenziale che gli embrioni siano completamente disidratati. È inoltre essenziale che il metanolo sia completamente miscelato con metil salicilato o BABB nella serie di soluzioni di compensazione.
        3. Dopo che gli embrioni diventano completamente trasparenti, maneggiarli individualmente, usando preferenzialmente uno stereoscopio a fluorescenza, per ridurre le possibilità di danni ai tessuti.
        4. Per l'imaging, montare gli embrioni in un vetrino concavo a depressione di 75 mm x 25 mm o in un vetro di copertura #1,5 da 20 mm x 60 mm. Quest'ultima opzione consentirà l'imaging da entrambi i lati, se necessario, ma è molto più fragile e difficile da sigillare. Trasferire gli embrioni ai vetrini del microscopio usando uno stuzzicadenti, una punta di cotone fine, una pipetta Pasteur o qualsiasi altro strumento simile.
        5. Per evitare di comprimere gli embrioni, aggiungere distanziali realizzati con frammenti di vetro di copertura #1 (spessore 170 μm), rondelle in silicone o metallo sottile. Quindi aggiungere una goccia di mezzo di montaggio, coprire con un vetro di copertura #1 o #0 20x20 mm e sigillare.
        6. Se si utilizzano distanziali in vetro o metallo, sigillare con paraffina fusa per stabilizzare meglio la preparazione - non sigillare con smalto perché si dissolve con metil salicilato o BABB. Per evitare bolle, posizionare il coverslip su un lato e poi, gradualmente e delicatamente farlo scorrere lateralmente; aggiungere più supporto se necessario.
          NOTA: Si prega di vedere il video per capire meglio come manipolare gli embrioni eliminati e come montarli sul vetrino del microscopio.
      2. Pulizia dei tessuti con RapiClear
        1. Quando si utilizza RapiClear, non è richiesta la disidratazione dell'embrione. Dopo il passaggio 1.2.2.9, posizionare gli embrioni al centro di un vetrino concavo di depressione di 75 mm x 25 mm, rimuovere tutto il PBST nel vetrino di depressione del microscopio e aggiungere 200 μL di soluzione di compensazione.
        2. Dopo 10 minuti protetti dalla luce, quando gli embrioni iniziano a diventare trasparenti, sostituire la soluzione di compensazione, attendere altri 20 minuti (protetti dalla luce) e quindi ricoprire con una copertura, partendo da un lato e spostandosi delicatamente verso l'altro.
          NOTA: Il tempo per cancellare completamente l'embrione può variare da pochi minuti a una notte a seconda dello stadio e delle dimensioni degli embrioni. Inoltre, l'intero processo dovrebbe essere fatto sotto uno stereomicroscopio. Per comprendere meglio la compensazione e la preparazione del vetrino del microscopio, consultare il protocollo video.
  3. Preparazione del campione per la tomografia a proiezione ottica
    NOTA: le seguenti procedure sono state adattate dai protocolli precedenti19,25,26. Il protocollo sarà descritto per l'analisi di feti di topo E18.5.
    1. Procedura di dissezione e fissazione del feto di topo
      1. Sezionare i feti di topo E18.5 in PBS freddo (4 °C), rimuovere tutte le membrane extra-embrionali e quindi lavare i feti più volte in PBS fresco per rimuovere il sangue e i detriti prodotti durante la procedura di dissezione.
      2. Fissare i feti in PFA al 4% prodotto in PBS, a 4 °C per 5-7 giorni.
      3. Lavare i feti una volta (15 min) in PBS e poi tre volte (30 min ciascuno) in acqua demineralizzata o PBS. Eseguire i lavaggi su uno shaker.
      4. Disidratare i feti per incubazione (serie di 25 min a RT su uno shaker) in soluzioni di metanolo di concentrazioni crescenti (aumenti del 10% diluiti in acqua demineralizzata o PBS) fino al 100% di metanolo.
      5. Cambiare la soluzione di metanolo al 100% (utilizzare un'aliquota fresca) tre volte (20 minuti ciascuna) per garantire la completa disidratazione. Gli embrioni possono quindi essere conservati a -20 °C o essere portati direttamente (un giorno dopo) al processo di sbiancamento (fase 1.3.2).
    2. Processo di sbiancamento
      1. Per rimuovere la pigmentazione naturale, incubare i feti (separatamente) su uno shaker, prima per un giorno in 5% H202 in metanolo e poi in 10% H202 in metanolo per un massimo di 3 giorni fino a quando gli embrioni perdono tutta la pigmentazione naturale.
        ATTENZIONE: H2O2 deve essere maneggiato delicatamente all'interno di una cappa aspirante. La soluzione sbiancante contenente H2O2 a contatto con il campione crea vapori e, pertanto, il tubo contenente i feti deve rimanere aperto durante l'intera procedura di sbiancamento. Alcuni protocolli di sbiancamento suggeriscono la combinazione di H2O2 con formammide. Se si utilizza questa alternativa, è necessario prestare particolare attenzione, poiché l'aggiunta di H2O2 alla formammide non diluita può provocare un'esplosione.
      2. Reidratare gradualmente gli embrioni in una serie di metanolo inverso (con una diminuzione del 10%) in acqua demineralizzata, ciascuno incubato per 20 minuti a RT su uno shaker, e infine lavare tre volte (30 minuti ciascuno) in acqua demineralizzata. Aspetta un giorno, cambia l'acqua demineralizzata e procedi oltre.
        NOTA: vedere la Figura 1 supplementare per un risultato rappresentativo del processo di sbiancamento.
    3. Protocollo di demineralizzazione
      NOTA: La demineralizzazione è facoltativa ma consigliata per feti o cuccioli.
      1. Eseguire la demineralizzazione lavando i feti in 0,1 M EDTA a 42 °C per alcune ore [vedi anche Cho et al.27] seguiti da cinque lavaggi (20 minuti ciascuno) con acqua demineralizzata per rimuovere completamente l'EDTA. Eseguire tutte le procedure su uno shaker.
    4. Preparazione del campione per la compensazione
      1. Incorporare i feti in un blocco di agarosio all'1%. Per preparare questi blocchi riempire un tubo di plastica da 50 ml o una siringa (costruendo uno spazio cilindrico tagliando il lato di uscita della siringa e usando lo stantuffo per bloccare il lato opposto) con agarosio fuso, posizionare il feto nell'agarosio in posizione verticale e mantenere questa posizione al centro del blocco con l'aiuto di pinze durante la solidificazione dell'agarosio.
      2. Posizionare lo stampo con il blocco a 4 °C (30 min) affinché l'agarosio si gelatini completamente. In caso di posizionamento errato del feto all'interno del blocco o di comparsa di bolle d'aria, sciogliere l'agarosio posizionando il blocco a 50 °C durante la notte e ripetere la procedura il giorno successivo.
      3. Rimuovere il blocco di agarosio con il feto dallo stampo e metterlo in un contenitore con acqua demineralizzata. Sostituire con acqua fresca demineralizzata dopo 15 min.
      4. Prima di schiarire con BABB, disidratare il campione. Per preservare meglio l'integrità dei tessuti, eseguire gradualmente la disidratazione del feto con aumenti del 10% della concentrazione di metanolo (diluito in acqua demineralizzata o PBS), ogni passaggio per più di 45 minuti a RT su uno shaker, fino a raggiungere il 100% di metanolo.
      5. Cambiare il metanolo al 100% (utilizzare un'aliquota fresca), prima quattro volte in intervalli di un'ora e poi di nuovo il giorno successivo per garantire la completa disidratazione.
    5. Processo di cancellazione e montaggio del campione per l'imaging OPT
      1. Pulire i feti su uno shaker attraverso una serie (2,5 ore ciascuna) di soluzione babbano in metanolo, con aumenti del 25% della concentrazione di BABB, fino a raggiungere il 100% di BABB.
      2. Sostituire la soluzione BABB con una nuova ogni giorno, fino a quando il feto non è completamente trasparente. Questo processo potrebbe richiedere da 3 a 5 giorni. Mantenere il blocco contenente il feto, su uno shaker durante l'intera procedura. I feti possono rimanere in soluzione BABB al 100% per lunghi periodi.
        NOTA: Se il feto non è correttamente disidratato, diventerà leggermente traslucido (emulsione "biancastra") dopo la prima aggiunta di BABB. Se ciò accade, fai un passo indietro nel metanolo puro ed esegui due lavaggi aggiuntivi in metanolo fresco. Non refrigerare mai i campioni durante l'esecuzione della disidratazione e della pulizia, poiché i cambiamenti di temperatura possono portare alla condensazione dell'acqua.
      3. Collegare il blocco di agarosio cancellato all'asse motore dello scanner OPT, regolare l'ottica per ottenere un'immagine dell'intero feto e procedere all'acquisizione di un set di dati di proiezione completo19,28.

2. Microscopio / Acquisizione di immagini

  1. Per una corretta imaging 3D e 4D, scegli il microscopio che meglio si adatta all'obiettivo sperimentale. La tabella 2 fornisce informazioni generali per guidare attraverso la selezione.
Tecniche di microscopia otticaPrincipio di imagingObiettivo sperimentale e considerazioni
Imaging widefieldUtilizza fluorescenza, luce riflessa o trasmessa.Ideale per una panoramica rapida e generale dell'embrione (ad es. per screening e per valutare stadi di sviluppo e fenotipi evidenti). La ridotta profondità di campo, rispetto allo spessore osservabile ad alti ingrandimenti non consente un'accurata interpretazione o analisi della morfologia 3D.
Confocale (scansione laser; CLSM)Utilizza l'illuminazione a scansione laser e il rilevamento della fluorescenza attraverso un foro stenopeico.Consente l'imaging di fette ottiche di campioni marcati fluorescenti, idealmente con un segnale forte. L'imaging attraverso un foro stenopeico rimuove il segnale dalla profondità di campo, consentendo così un'accurata discriminazione delle informazioni in 3D. L'acquisizione è di ordini di grandezza più lenta di widefield, ma con contrasto senza precedenti e discriminazione 3D della morfologia. L'alta risoluzione temporale non è raggiungibile perché le immagini vengono acquisite 1 pixel alla volta. Ottimo per l'imaging 3D di embrioni di topo fissi fino a E9.5. L'imaging attraverso l'intero mesoderma presomitico o somiti richiede la pulizia dei tessuti, a causa della diffusione della luce nei tessuti più profondi. La fototossicità e lo sbiancamento sono una considerazione. Il fotosbiancamento può, entro certi limiti, essere compensato a posteriori. Tuttavia, gli effetti fototossici nei campioni vivi non possono, e spesso non sono facili da determinare. Questo è più ovvio se i campioni mostrano una bassa espressione e sono necessarie potenze laser elevate.
Fluorescenza di eccitazione a due fotoni (TPEFM)Utilizza l'eccitazione laser nel vicino infrarosso pulsato (NIR) anziché l'illuminazione laser visibile.TPEFM consente l'affettamento ottico attraverso campioni più spessi rispetto a CLSM. La risoluzione è leggermente inferiore, ma il contrasto nei tessuti più profondi è notevolmente migliore, rendendolo ideale per l'imaging dal vivo di embrioni di topo. Sebbene il TPEFM sia spesso considerato meno fototossico del CLSM convenzionale, richiede elevate potenze laser che possono anche avere effetti deleteri su cellule e tessuti. Ideale per l'imaging 3D di embrioni fino a E11.5, anche se l'imaging attraverso l'intero mesoderma presomitico richiede ancora la pulizia dei tessuti.
Confocale (disco rotante)Una forma di confocale che, invece di un singolo laser, utilizza più sorgenti puntiformi.L'uso di più strutture puntiformi consente una creazione più rapida di fette ottiche (sono realizzabili diversi fotogrammi al secondo o pile al minuto) rispetto a CLSM. L'acquisizione è praticamente veloce come widefield, con una ragionevole discriminazione 3D. Tuttavia, consente solo l'imaging dei tessuti più superficiali dell'embrione di topo. Consente un rilevamento più sensibile rispetto al CLSM, rendendolo un'alternativa per gli embrioni con bassa espressione di proteine di fluorescenza.
Foglio luminoso / piano singolo (LSFM/SPIM)Invece di un'illuminazione a campo largo o puntiforme, il campione viene illuminato un piano ortogonale alla volta. Nella maggior parte delle configurazioni, consente l'imaging da più angolazioni.Richiede anche campioni etichettati in modo fluorescente. L'acquisizione di fette ottiche l'acquisizione è estremamente veloce (più fotogrammi al secondo) e ha effetti ridotti di fototossicità o sbiancamento. Tuttavia, se è richiesta la multiview, le successive fasi di pre-elaborazione del set di dati potrebbero richiedere ore/giorni di calcolo. LSFM/SPIM consente un migliore rilevamento di livelli di espressione inferiori rispetto a CLSM. Ideale per l'imaging 3D di embrioni di topo in toto durante la gastrulazione. I campioni spesso devono essere montati e mantenuti in sospensione (preparazione non convenzionale).
Tomografia a proiezione ottica (OPT)Le fette ottiche non vengono rilevate ma calcolate da una serie di immagini a campo largo dell'intero embrione da diverse angolazioni (le "proiezioni").Ideale per l'imaging 3D di embrioni/feti di topo in fase successiva (>5 mm), ma solo fissi e cancellati. Ha il vantaggio di produrre pile 3D di fette ottiche di campioni fluorescenti e non fluorescenti. I set di dati sono isometrici (fette con uguale risoluzione in tutte e tre le dimensioni) che lo rendono ideale per l'analisi anatomica. L'acquisizione di un set di dati di proiezione può richiedere solo pochi minuti, seguiti da 15-30 minuti di ricostruzione.
Tomografia a coerenza ottica (OCT)Utilizza l'illuminazione NIR attraverso il campione per ottenere fette ottiche basate sull'interferenza con la riflessione della luce.OCT consente una facile imaging attraverso tessuti vivi (pochi millimetri di profondità nel campione senza contrasto fluorescente) con una risoluzione di poche decine di micrometri. L'acquisizione è molto veloce (poche fette al secondo). Sebbene sia una possibile alternativa per OPT, questa tecnica non è comunemente disponibile.
Super-risoluzione (SR), forza atomica (AFM) o imaging near-field (NSOM)SR è normalmente basato sulla localizzazione di singole molecole e AFM/NSOM su superfici di scansione a risoluzioni di sotto-diffrazione (pochi nanometri).Consente l'imaging a livello di sotto-diffrazione (risoluzione <200nm), spesso con l'intento di rilevare singole molecole o molecole sulla superficie cellulare. Non ideale per l'analisi morfologica di grandi campioni come embrioni di topo. L'acquisizione è in genere un processo lento (da secondi a minuti per immagine).

Tabella 2 - Informazioni generiche per guidare la selezione della tecnica di imaging/microscopio più adatta allo specifico obiettivo sperimentale del ricercatore.

3. Pre-elaborazione del set di dati di immagini

NOTA: Qui evidenziamo alcuni dei passaggi chiave della pre-elaborazione del set di dati di immagini, vale a dire la riduzione del rumore (3.1) e la deconvoluzione (3.2), e forniamo algoritmi che consentono una corretta preparazione e pre-elaborazione di serie temporali di set di dati 3D (3.3) e colorazioni di immunofluorescenza a montaggio intero (3.4). Infine, indichiamo riferimenti che descrivono in dettaglio un protocollo per la pre-elaborazione e la ricostruzione del set di dati OPT.

  1. Riduzione del rumore
    1. Se le immagini mostrano un rapporto segnale-rumore ridotto, prendere in considerazione l'applicazione di un metodo classico come un filtro "Mediano" o "Diffusione anisotropica" disponibile in Fiji/ ImageJ29, o un metodo più elaborato basato sull'apprendimento automatico come "CARE"30 o "Noise2Void"31.
      NOTA: questo è particolarmente rilevante per i set di dati di imaging dal vivo, in cui il fotosbiancamento e il fotodanno sono una delle principali preoccupazioni e sono necessarie esposizioni inferiori e guadagni più elevati del rilevatore.
  2. Deconvoluzione
    1. Se le immagini sono state acquisite con alta risoluzione (vicino o al campionamento nyquist) prendere in considerazione l'esecuzione del ripristino dell'immagine con la deconvoluzione per migliorare la qualità del set di dati prima dell'analisi. Attenzione che alcuni strumenti di deconvoluzione includono anche un passaggio di denoising.
      NOTA: Questo è stato ampiamente affrontato in Krull et al.32 e nella documentazione disponibile sul sito web del software di deconvoluzione Huygens (https://svi.nl/HomePage).
  3. Preparazione di una serie temporale di set di dati 3D per una corretta visualizzazione e analisi
    NOTA: Spesso l'embrione o la deriva dello stadio possono verificarsi durante l'imaging time-lapse. Questo deve essere corretto prima di eseguire l'analisi. A volte, la deriva è abbastanza grave che l'acquisizione deve essere interrotta e le regolazioni apportate. In questo caso, è meglio mantenere le stesse dimensioni X, Y e Z.
    1. Stack 4D separati possono essere concatenati in un singolo hyperstack 4D utilizzando la funzione "concatenare" delle Figi. Tuttavia, questo strumento non gestisce compositi / hyperstack, quindi è necessario convertire tutti i segmenti 4D in semplici stack utilizzando l'operazione Image | Hyperstacks | Hyperstack da impilare. Mantieni un sistema di numerazione per mantenere l'ordine di questi segmenti 4D e prendi nota delle informazioni su ciascuno di essi (canali, sezioni, punti temporali). Ripetere la procedura per tutti i segmenti e quindi concatenarli utilizzando la procedura Image | Stack | Strumenti | Concatenare.
    2. Ricostruire l'hyperstack concatenato con l'operazione Image | Hyperstacks | Impila su Hyperstack e scegli l'ordine corretto delle diverse dimensioni. Ispezionare Hyperstack per assicurarsi che tutte le dimensioni siano sequenziate correttamente.
      NOTA: il numero di canali (c) e sezioni (z) deve essere lo stesso per tutti i segmenti 4D; il numero di intervalli (temporali) (t) deve essere uguale al totale dei punti temporali aggiunti per tutti i segmenti 4D. È importante sfogliare lo stack per capire come vengono interpolate le diverse dimensioni, prima di eseguire la conversione in hyperstack. L'impostazione predefinita di Fiji/ImageJ è l'alternanza dei canali, quindi l'alternanza di sezioni Z e quindi l'alternanza di punti temporali ("XYCZT"). Verificare che questo si applichi ai dati generati dal microscopio.
    3. Scegliete Composito come modalità di visualizzazione e salvate come Formato file immagine con tag (TIFF). Per set di dati di grandi dimensioni, prendere in considerazione la conversione in formato BigDataViewer33 , eseguendo l'operazione Plugins | | Di BigDataViewer Esporta l'immagine corrente come XML/HDF5. Questo genera un set di dati che può essere sfogliato in modo più efficiente e in 3D utilizzando BigDataViewer e può essere gestito da altri strumenti Fiji / ImageJ per set di dati big data.
    4. Registrare l'hyperstack concatenato (serie temporale di stack 3D) per compensare la deriva embrionale/stadio utilizzando il plug-in ImageJ34 "Correct 3D Drift" o il plug-in BigStitcher35, a seconda del grado di correzione della deriva necessaria. I file XML / HDF5 possono essere aperti con BigStitcher.
      NOTA: È necessario eseguire la registrazione di time-lapse 3D che mostrano la deriva dell'embrione prima di qualsiasi tentativo di eseguire il tracciamento cellulare o l'analisi del movimento; la correzione per la deriva è anche necessaria per interpretare correttamente i movimenti morfogenetici.
  4. Pre-elaborazione di set di dati di imaging a immunofluorescenza
    1. Attenuazione del segnale della profondità Z
      NOTA: Sebbene il metodo che proponiamo per correggere l'attenuazione del segnale possa essere utile, questo dovrebbe essere usato con attenzione, poiché spesso meno segnale in profondità può effettivamente riflettere un fenomeno biologico e non ottico. Considerare la possibilità di misurare il decadimento in un'area di tessuto in cui non ci si aspetta che la molecola di interesse sia presente o espressa e regolare la compensazione per quell'area. Se c'è ancora un segnale positivo inferiore in profondità, può rivelare un fenomeno biologico reale. Considera anche che alcune aree del campione possono produrre più scattering o attenuazione laser rispetto ad altre e che non saranno completamente corrette con questo semplice metodo.
      1. Per gli embrioni più spessi / in fase avanzata, l'attenuazione del fascio, il fotosbiancamento e l'aberrazione sferica causata dalla mancata corrispondenza degli indici di rifrazione (tra il mezzo di montaggio e l'obiettivo del microscopio) possono portare a set di dati in cui l'intensità della fluorescenza è notevolmente attenuata nelle fette più profonde della pila Z. Pertanto, compensare questa perdita di segnale prima dell'analisi. Determinare analiticamente l'attenuazione più accurata è complessa e altamente dipendente dal campione36, ma una rapida approssimazione può essere determinata empiricamente in ImageJ / Fiji usando il processo | matematica | Macro e cliccando su Anteprima.
      2. Caricare lo Z-stack in Fiji/ImageJ e quindi eseguire la procedura Image | Stack | Reslice. Inizia da: in alto, mantieni l'interpolazione selezionata e OK. Ora la "Z" sarà l'asse "Y". Quindi, fai | immagine | delle tabelle di ricerca (LUT) Fuoco (o qualsiasi altra LUT multicolore). Ciò contribuirà a valutare visivamente la migliore compensazione durante i passaggi successivi. Passa a una fetta nel mezzo dell'embrione, dove gli effetti dell'attenuazione in profondità sono chiaramente visibili (l'intensità scende dall'alto [superficiale] al basso [più profondo]).
      3. Procedere alla determinazione della correzione della caduta di intensità verticale ("y") con la procedura Process | matematica | Macro, e aggiungere il seguente "Codice" esattamente come scritto qui:
        v = v * A * exp ( B * y/h )
        In questa espressione, "v" è la variabile per l'intensità dei pixel (che verrà regolata come funzione sulla profondità), "y" la variabile per la profondità e "h" per la profondità completa, e "exp" è una funzione esponenziale; "A" deve essere sostituito con un numero compreso tra 0,5 e 1,0 (scegliere valori più bassi per evitare la sovrasaturazione degli strati superiori dello Z-stack); B sostituito con un numero compreso tra 0,5 e 2,0, a seconda di quanto sia grave l'attenuazione della profondità Z - idealmente dovrebbe essere 1, tuttavia in alcuni casi è necessario meno (o più) per compensare correttamente gli strati inferiori; un valore più alto di B si tradurrà in una maggiore compensazione di attenuazione. Clicca su Anteprima per fare una prima valutazione. Testare diversi valori di A e B fino ad ottenere un'adeguata compensazione dall'alto verso il basso dell'immagine (la LUT "Fire" può essere utile per questa valutazione). Quando sei soddisfatto, applica le impostazioni facendo clic su OK.
        NOTA: questo deve essere eseguito in ogni canale individualmente, perché i coloranti e i laser spostati in rosso possono attenuarsi meno e alcuni coloranti sbiancano più velocemente di altri. Tieni presente che questa procedura potrebbe non essere abbastanza accurata da consentire una quantificazione affidabile delle variazioni di intensità della fluorescenza in profondità, sebbene sia certamente più affidabile rispetto all'esecuzione di quantificazioni direttamente nel set di dati 3D originale che è gravemente influenzato dall'attenuazione del segnale in profondità. Un modo per identificare e controllare questo effetto è confrontare l'imaging di diversi embrioni dai lati dorsale o ventrale.
      4. Ripristinate la geometria originale dello Z-stack compensato eseguendo Image | Stack | Reslice, inizia dall'alto, mantieni spuntata l'interpolazione Evita , e ora la "Y" deve diventare di nuovo il piano "Z"; sostituire il colore eseguendo "Image | Tabelle di ricerca | Grigi" (o l'altra LUT di scelta). Scartare lo z-stack originale non compensato e salvare la versione compensata.
        NOTA: vedere la Figura 2 supplementare come risultato rappresentativo del metodo di attenuazione del segnale Z-depth.
    2. Correzione del ridimensionamento dell'asse Z
      1. Se l'imaging con un obiettivo progettato per un indice di rifrazione diverso da quello utilizzato per il montaggio degli embrioni, è necessario eseguire il ridimensionamento dello spessore della fetta, altrimenti le misurazioni in profondità saranno errate (potenzialmente del 50% se si utilizza un obiettivo "secco" su un embrione disboscato). Questo è spiegato, rivisto e i diversi metodi discussi, in 37 e 38. Determinare analiticamente l'effettiva scala di distorsione dell'asse Z è complessa, ma un'approssimazione accettabile può essere facilmente determinata trovando il rapporto tra l'indice di rifrazione del campione e l'indice di rifrazione dell'obiettivo (ad esempio, 1,53 / 1,0 per un embrione eliminato da metil salicilato ripreso con un obiettivo secco 20 x, o 1,56 / 1,33 per un embrione eliminato con BABB e ripreso con un obiettivo di immersione in acqua).
      2. Con il set di dati Z-stack già aperto in Fiji/ImageJ (per le immagini multicanale, dopo che sono state assemblate come "composite" con tutti i canali), vai a Image | Proprietà e modifica della profondità di Voxel allo spessore della fetta ottenuta durante l'acquisizione dell'immagine moltiplicata per la correzione del ridimensionamento dell'asse Z determinata nel passaggio precedente (4.2.1; Sezione "Pre-elaborazione del set di dati di immagini"). Confermare il risultato utilizzando il | Immagine Stack | Viste ortogonali.
    3. Riposizionamento dell'embrione in una posizione anatomicamente standard utilizzando Fiji/ImageJ
      NOTA: Riposizionamento dell'embrione (vedi i vantaggi evidenziati in Figura supplementare 3) in una posizione standardizzata dell'asse anteriore-posteriore [A-P] e dorsale-ventrale [D-V] utilizzando Fiji/ImageJ, richiede l'installazione del TransformJ 39 suite di plugin dal sito web di aggiornamento "ImageScience" delle Fiji.
      NOTA: questa tecnica è preferibile ai round di rotazioni nei tre piani che introdurrebbero artefatti di aliasing e degrado della risoluzione. Tuttavia, poiché il plug-in del visualizzatore 3D Fiji/ImageJ non è in grado di gestire correttamente set di dati di dimensioni superiori a 200-300 Mb (il plug-in potrebbe non eseguire il rendering o mostrare un comportamento imprevedibile quando si tenta di ruotare l'angolo di visione), il set di dati 3D originale deve essere prima sottocampionato.
      1. Inizia riducendo le dimensioni del set di dati nell'immagine delle Figi | Scalare e quindi inserire i valori di "scala" X, Y e Z necessari per ridurre il set di dati a meno di 200 Mb (ad esempio un down-sampling di 0,5 x 0,5 x 0,5 si tradurrà in un set di dati 8 volte più piccolo). Assicurati che l'opzione Crea nuova finestra sia selezionata.
      2. Quindi vai a Plugin | visualizzatore 3D. All'interno della finestra del visualizzatore 3D, fai clic sull'embrione per selezionarlo e dovrebbe apparire una casella 3D rossa. Quando si utilizza questa modalità (con la casella rossa attivata), la rotazione del set di dati può essere controllata con il mouse, in contrasto con il comportamento predefinito, che consiste nel ruotare l'angolo di visione. Quando si riposiziona l'embrione con il mouse, non fare mai clic all'esterno o il set di dati verrà deselezionato.
      3. Quando sei soddisfatto della nuova posizione dell'embrione, seleziona Modifica | trasformazione | Esporta l'immagine trasformata nel menu della finestra "Visualizzatore 3D". Per ispezionare i diversi piani ortogonali vai su Image | Stack | Viste ortogonali. Se l'embrione non è posizionato correttamente, chiudere la finestra e tornare alla finestra del visualizzatore 3D e ri-regolare. Ripetere il passaggio 4.3.2.
      4. Quando l'embrione è posizionato correttamente, selezionare dal menu della finestra "Visualizzatore 3D" Modifica | trasformazione | Salvare la trasformazione e salvare la matrice di trasformazione in un file di testo con estensione *.mat. Apri questo file di testo usando Fiji/ImageJ, rimuovi le prime due righe (testo) e salva di nuovo. Questo crea un file matrice di trasformazione compatibile con il plugin "TransformJ" descritto in 39.
      5. Passare al set di dati a piena risoluzione (può essere un hyperstack composito multicanale) ed eseguire l'operazione Plugins | | TransformJ TransformJ affine. Nella nuova finestra, cercare il file della matrice precedentemente salvato, selezionare l'interpolazione B-Spline cubica | ricampionare isotropicamente | Va bene.
        NOTA: questa operazione richiede un uso intensivo della memoria e della CPU. A seconda delle dimensioni della workstation e del set di dati, l'operazione potrebbe richiedere da minuti a ore. L'uso dell'opzione isotropica di ricampionamento garantisce che nessuna risoluzione venga persa durante l'operazione di trasformazione, quindi il set di dati aumenterà di dimensioni in modo significativo e non sarà più anisotropo come l'originale z-stack confocale; è prevedibile che il numero di sezioni nell'asse Z aumenti allo stesso numero di pixel X e Y di ciascuna fetta e che lo stack si gonfi a 5-10 volte la dimensione originale. Ciò è necessario per garantire che nessuna informazione venga persa nel corso dell'interpolazione dei voxel durante la rotazione e la traslazione.
      6. Una volta che l'embrione è stato riposizionato correttamente, è spesso possibile tagliare la maggior parte dello spazio vuoto creato intorno all'embrione. Eseguire un'immagine a proiezione Z completa | Stack | Progetto Z... e scegli Intensità massima; disegna il ROI minimo che contiene l'intero embrione in X e Y. Passa alle finestre dell'immagine del set di dati originale, vai a Modifica | | di selezione Ripristina la selezione e ritaglia selezionando Immagine | ritaglio.
      7. Tagliare le fette all'inizio e alla fine che non intersecano i tessuti embrionali. Per questo, seleziona | immagine Stack | Strumenti | Slice remover e specificare la prima e l'ultima fetta da rimuovere, assicurandosi di cambiare l'"incremento" in 1 (altrimenti rimuove solo ogni altra fetta).
      8. Dopo aver riposizionato e tagliato il nuovo set di dati, assicurarsi di salvarlo come nuovo file TIFF. Se questo set di dati è troppo grande (più della RAM della GPU), prendere in considerazione l'utilizzo di BigDataViewer per esportare come XML/DHF5, come spiegato nel passaggio 3.3 (dalla sezione "Pre-elaborazione del set di dati immagine").
  5. Pre-elaborazione e ricostruzione del set di dati OPT
    1. Utilizzare il protocollo per la pre-elaborazione e la ricostruzione del set di dati OPT descritto in Martins et al.19 e Gualda et al.28.

4.3D rendering, visualizzazione e analisi

NOTA: Qui forniamo un elenco di possibili applicazioni di diversi strumenti software, che consentono o migliorano la visualizzazione e l'analisi di set di dati di imaging 3D.

  1. Rendering e visualizzazione 3D con Drishti
    NOTA: Drishti40 è un software di visualizzazione scientifica gratuito progettato per esplorare e presentare set di dati 3D e 4D da microscopia micro-CT, confocale / multifotonica e light-sheet. Qui utilizziamo questo software per il rendering 3D e la visualizzazione della colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero (Step 2; Sezione "Preparazione del campione per l'imaging 3D"). Ci sono più tutorial online per aiutare gli utenti a capire come utilizzare Drishti; cerca online "Ajay Limaye Drishti 3D tutorials". Drishti non può leggere direttamente pile di file TIFF, quindi devono essere convertiti prima nel formato nativo "pvl.nc".
    1. Eseguire lo strumento "drishtiimport.exe", che si trova nella cartella di installazione di Drishti: File | Carica | File | scegli "File immagine TIFF in scala di grigi e carica uno stack 3D a canale singolo, come salvato da Fiji / ImageJ. Nel caso di uno stack composito multicanale, dividere i canali in Fiji/ImageJ e salvarli singolarmente. Il tipo Voxel è "ushort"; "File"..."Salva come"..."TIF", rispondi "y" a tutte le domande. Nella finestra Informazioni aggiuntive che richiede la dimensione del voxel, assicurati di aggiungere le dimensioni corrette del voxel "X Y Z".
    2. Caricamento di file *.pvl.nc in Drishti e rendering: nella finestra principale di Drishti, File | Carica | Carica 1 ( - 4 ) volumi a seconda del numero di canali disponibili (come file separati). Dopo il caricamento, premere F2 per un rendering di alta qualità. Questa azione richiede una potente scheda GPU. Informazioni per gestire i parametri di rendering, Editor di funzioni di trasferimento, ricerca sui tutorial online. Una volta soddisfatti delle proprietà di rendering procedere alla generazione di un rendering animato.
    3. Vai a Visualizza e attiva l'editor dei fotogrammi chiave. Maneggiare l'embrione e posizionarlo nella posizione di partenza desiderata. Usa il pulsante destro del mouse per "trascinare" l'embrione al centro, se necessario, o lo scorrimento del mouse per ingrandire. Premi imposta fotogramma chiave nell'editor fotogrammi chiave, quindi scegli un'altra posizione, angolo o zoom, trascina l'indicatore della linea temporale su un punto temporale diverso e imposta di nuovo il fotogramma chiave . Ora ci sono 2 fotogrammi chiave in cui l'embrione è rappresentato in 2 diverse posizioni / angoli / zoom e un numero di fotogrammi nel mezzo. Premendo il pulsante Play , Drishti può interpolare le condizioni mancanti e riprodurle come animazione. Vai a File | Salvate la sequenza di immagini per salvare la sequenza animata di tutti i fotogrammi. Questa sequenza di fotogrammi può essere successivamente aperta in Fiji / ImageJ e salvata come AVI (File | Importare | Sequenza di immagini ... | dei file Salva con nome | Compressione JPEG con un frame rate ragionevole (suggeriamo 15 - 30).
      NOTA: Sebbene Drishti consenta il salvataggio di *.wmv video, è consigliabile invece salvare come fotogrammi separati e solo successivamente convertire la serie in formato video AVI o MOV (questo può essere fatto usando Fiji / ImageJ).
  2. Ricostituzioni 3D e segmentazione manuale dei tessuti utilizzando Amira
    NOTA: Questo software commerciale consente, manualmente o automaticamente/semi-automaticamente, la segmentazione 3D dei tessuti embrionali in set di dati 3D. C'è un "Learning Center" online per questo software con più tutorial disponibili 41. Di seguito sono descritti i passaggi di base necessari per segmentare manualmente i tessuti embrionali da embrioni colorati con immunofluorescenza (fase 1.2). La segmentazione manuale è molto più semplice dopo che l'embrione è stato posizionato correttamente in un asse A-P/D-V standard (vedere la sezione "Image dataset preprocessing", passaggio 4.3).
    1. Caricare un set di dati TIFF 3D. Assicurati di specificare le dimensioni corrette del voxel, quando richiesto. Creare e collegare un modulo di visualizzazione (ad esempio, "Orthoslice" o "Volren") e ispezionare il set di dati in 3D.
    2. Collegare il campo Etichetta (o Modifica campo Nuova etichetta nelle versioni più recenti di Amira). In questo software, i risultati della segmentazione manuale sono memorizzati in "materiali", quindi crea un materiale per ogni tessuto di interesse. Utilizzare lo strumento "lazo" per la segmentazione manuale. Sono disponibili diversi tutorial che spiegano come eseguire questa operazione (cerca online "Amira Segmentation Editor tutorial").
    3. Al termine della segmentazione di tutti i tessuti di interesse, uscire dall'Editor di segmentazione tornando alla modalità Progetto . Aver creato una nuova versione del dataset (il "campo etichette", che ora è allegato al modulo dataset originale) in cui i pixel appartenenti a ciascun materiale hanno lo stesso valore.
    4. Converti questi "materiali" in oggetti 3D generando modelli di superficie 3D dal set di dati "Etichette". Questo può essere fatto collegando un modulo "Genera superficie", regolando i parametri secondo necessità (attivare le opzioni "compatta", "bordo", "Regola coord" e "Smoothing non vincolato"). Fare clic su Applica e viene generato un nuovo modulo *.surf.
    5. Visualizzazione degli oggetti di superficie, estrazione ed esportazione singolarmente come file *obj. Collegare un | di visualizzazione SurfaceView al modulo *.surf e ispezionare nel visualizzatore principale. Nel pannello "proprietà" del modulo "SurfaceView", nella proprietà "Materiali" selezionare Tutto + Tutto e fare clic su Rimuovi, in modo che il buffer dello spettatore venga svuotato. Quindi nel secondo pull down della proprietà Materiali selezionare un solo materiale e fare clic su Aggiungi al buffer; solo quel materiale dovrebbe essere visibile.
    6. Nella proprietà Stile disegno fare clic su più opzioni | creare superficie e un nuovo modulo *.surf viene creato e aggiunto al progetto. Rinominarlo con il nome del tessuto (premere F2 sulla tastiera) e File | Esporta i dati come... e Salva come tipo: Wavefront (*.obj). Ripetere l'operazione per ogni materiale.
      NOTA: Questi file *.obj, ciascuno contenente uno dei tessuti segmentati in Amira, possono essere utilizzati da altri strumenti (plugin "3Dviewer" di Fiji/ImageJ e SimLab).
  3. Visualizzazione 3D interattiva all'interno in formato PDF (Portable Document Format) utilizzando SimLab Composer
    NOTA: questo software di computer grafica 3D facilita la creazione di immagini, animazioni e simulazioni renderizzate in superficie. Utili tutorial sono disponibili sulla linea 42. Qui descriviamo come questo software consente la creazione di illustrazioni interattive PDF 3D, utilizzando i file di superficie 3D wavefront (*.obj) creati con Amira (Step 2.3; Sezione "Rendering, visualizzazione e analisi 3D").
    1. Vai a File | Nuovo e creare una scena vuota. Quindi File | importare e importare il 1 ° file *.obj salvato da Amira. Tenere deselezionate tutte le opzioni della finestra Importa file e fate clic su OK.
    2. Se nella finestra di visualizzazione del compositore non viene visualizzato nulla, fare clic su CTRL+F o sull'icona Adatta a tutti. Ora l'oggetto segmentato dovrebbe apparire al centro della finestra. Ripetere il processo per aggiungere un altro oggetto segmentato e confermare la sua posizione rispetto al 1 ° (ad esempio, 2 somiti adiacenti).
    3. Selezionare uno degli oggetti nella finestra di visualizzazione facendo clic con il pulsante sinistro del mouse, modificarne il nome in modo che rifletta il nome della struttura anatomica o del tessuto, quindi passare alla rappresentazione "3DGeom~1" e, utilizzando il pannello Materiali , modificare il colore modificando i valori R, G, B.
    4. Ripetere l'operazione per tutti gli oggetti fino a quando l'illustrazione 3D non è completamente assemblata. Si noti che alcuni materiali possono anche essere resi trasparenti manipolando il canale "Alpha", accanto ai valori RGB, e quindi consentire l'osservazione di oggetti interni o occlusi.
    5. Con questo software l'illustrazione dell'embrione assemblato può essere esportata come file "PDF 3D", che può essere incluso nelle pubblicazioni. Per prima cosa crea un "modello" con testo e collegamenti attivi per modificare "Stati scena" per poter includere istruzioni e tre diverse fasi nella stessa illustrazione. Questo può essere fatto passando dalla modalità "Costruzione scena" alla modalità "Condivisione" (pulsanti a sinistra della finestra del Compositore), quindi facendo clic su Mostra impostazioni PDF e creando un nuovo modello di pagina. Per creare una semplice figura interattiva da includere in un manoscritto, non utilizzare un modello e semplicemente Esporta PDF.
      NOTA: utilizzare il software Adobe Acrobat Reader per interagire con i PDF 3D (l'operabilità delle funzioni nell'illustrazione PDF 3D interattiva può variare a seconda delle versioni di Acrobat Reader disponibili). La maggior parte degli altri visualizzatori non è compatibile con il formato PDF 3D, inclusi i browser Web. Tali illustrazioni interattive PDF 3D possono essere incluse nelle pubblicazioni; chiedi in anticipo agli editori di questa possibilità.
  4. Visualizzazione e analisi 3D con Imaris
    NOTA: questo software consente la visualizzazione, l'analisi e l'interpretazione complete di set di dati di microscopia 2D-4D, con interfaccia e flussi di lavoro intuitivi. Ci sono diversi tutorial utili online su come iniziare con questo software, disponibili sul sito Web (https://imaris.oxinst.com/tutorials). Per caricare e interagire in modo più efficace con set di dati di grandi dimensioni in Imaris (in genere, quelli più grandi della memoria GPU) è consigliabile convertire prima il set di dati in "*.ims", utilizzando il programma "ImarisFileConverter.exe" installato nella cartella di installazione di Imaris. ImarisFileConverter è in grado di leggere molti formati di immagini al microscopio, inclusi i file OME e "h5" salvati da BigDataViewer delle Fiji.
    1. Visualizzazione 3D
      1. Questo software può eseguire il rendering di una visualizzazione 3D del set di dati utilizzando la modalità "3D View" e l'utente è in grado di apportare diverse modifiche al modo in cui il set di dati viene visualizzato [ad esempio, scegliere tra MIP (Maximum intensity Projection) o modalità di fusione (rendering migliore con segnali di profondità e ombre)].
      2. Vista ortogonale" - Con il corretto posizionamento dell'embrione (Step 4.3; Sezione "Image dataset pre-processing") si può usare la scheda "Sezione" e navigare attraverso l'intero embrione e vedere sezioni ottiche dai piani normali (trasversale, coronale e sagittale). Se gli embrioni non vengono riposizionati correttamente, interpretare la loro anatomia con piani ortogonali è estremamente difficile (vedi Figura supplementare 3). Sebbene Imaris abbia una funzione nota come "quadro di riferimento" per aggirare questo problema quando si analizzano embrioni 3D, è preferibile riposizionare i set di dati a priori.
    2. Analisi 3D
      NOTA: Questo software ha anche diversi strumenti per analizzare la morfologia e le intensità di fluorescenza. Ad esempio, qui descriviamo un semplice flusso di lavoro per analizzare le variazioni di intensità della fluorescenza tissutale nel tempo utilizzando lo strumento "Macchie" di Imaris, in cui l'utente posiziona manualmente le regioni sferiche di interesse (ROI) nell'embrione in 3D e Imaris può quindi misurare la fluorescenza tissutale all'interno di questi ROI sferici.
      1. Carica un set di dati 3D o 4D in Imaris e aggiungi un nuovo spot nella modalità di visualizzazione 3D . Quindi, è possibile selezionare punti specifici dell'embrione (anche durante diversi punti temporali se si utilizza un set di dati 4D) e quantificare all'interno di quei punti, ad esempio la media dell'intensità.
        NOTA: Questo software consente anche di tracciare l'intensità nel tempo. Ciò consente all'utente di rispondere facilmente a domande come: "come cambia la fluorescenza all'interno di un somite nel tempo?".
      2. Aggiungi il modulo spot facendo clic sul pulsante Aggiungi nuovo spot o selezionando vista 3D | Macchie nel menu Imaris. Scegli Salta reazione automatica, modifica manualmente. Cambia la modalità puntatore Imaris da Naviga a Seleziona (questo può essere fatto anche premendo il tasto ESC sulla tastiera).
      3. Nella finestra delle proprietà Spot , selezionate il canale specifico a cui verrà collegato lo spot (ad esempio, "Canale 1") e attivate in Monitoraggio manuale le opzioni Connessione automatica allo spot selezionato e Abilita ritardo prima dell'avanzamento automatico .
      4. Spostare il cursore del mouse sulla finestra di visualizzazione e il cursore dovrebbe trasformarsi in una sfera di filo giallo cava. Vai al punto temporale 1 e aggiungi un punto (=sfera) facendo clic nel tessuto di interesse. La sfera ("Spot") viene aggiunta solo se si fa clic tenendo premuto il tasto Maiusc . Ripeti per tutti i punti temporali desiderati assicurandoti di tracciare la stessa porzione di tessuto nel tempo.
      5. Nella finestra Proprietà Spot , passa alla scheda Statistiche e all'interno della finestra Statistiche passa da Statistiche generali a Statistiche dettagliate . Dal primo pulldown scegliere Valori specifici, e dal secondo pulldown scegliere "Intensità media Ch=*...", dove Ch* è il canale in cui verrà eseguita la misurazione. Un pulsante a destra del pannello "Clicca per aprire il time-plot" si trova in basso a sinistra nella finestra delle proprietà degli spot. Cliccando su questo pulsante si apre un grafico con l'intensità mediana di fluorescenza all'interno delle "macchie", tracciate nel tempo. Questi valori possono anche essere esportati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.

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Risultati

I risultati rappresentativi mostrati in questo documento sia per l'imaging vivo che per l'imaging a immunofluorescenza, sono stati ottenuti utilizzando un sistema a due fotoni, con un obiettivo acquatico da 20 × 1,0 NA, il laser di eccitazione sintonizzato su 960 nm e fotorivelatori GaAsP (come descritto in Dias et al. (2020) 43. La tomografia a proiezione ottica è stata eseguita utilizzando uno scanner OPenT costruito su misura (come descritto in Gualda et al. (2013)28.<...

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Discussione

L'allungamento assiale e la segmentazione sono due dei processi più complessi e dinamici che si verificano durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati. L'uso dell'imaging 3D e 4D con tracciamento monocellulare è stato applicato, da tempo, per studiare questi processi sia negli embrioni di zebrafish che di pollo, per i quali l'accessibilità e le condizioni di coltura facilitano l'imaging complesso 19,44,45,46,47,48,49

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare Olivier Pourquié e Alexander Aulehla per il ceppo reporter LuVeLu, il laboratorio SunJin per il campione di test RapiClear, Hugo Pereira per l'aiuto con BigStitcher, Nuno Granjeiro per aver contribuito a configurare l'apparato di imaging dal vivo, la struttura per animali IGC e i membri passati e presenti del laboratorio Mallo per commenti utili e supporto nel corso di questo lavoro.

Ringraziamo il supporto tecnico dell'Advanced Imaging Facility di IGC, che è supportato dal finanziamento portoghese ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanziato dal Programma operativo regionale di Lisbona (Lisboa 2020), nell'ambito dell'accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) e Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portogallo). Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato supportato dalle sovvenzioni LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portogallo) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portogallo) a M.M., l'infrastruttura di ricerca Congento, il progetto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e la borsa di dottorato PD / BD / 128426/2017 ad A.D.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose low gelling temperatureSigmaA9414Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira softwareThermofisher-Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)SigmaL9393 RRID:AB_477163For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albuminBiowestP6154For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0(any)-100um thick
Coverglass 20x20 mm #1(any)-170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5(any)-To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)Life TechnologiesD3571For immunofluorescence
Drishti software(open source)-Free software tool
EDTASigmaED2SSFor demineralization
Fiji/ImageJ software(open source)-Free software tool
GlycineNZYtechMB01401For immunofluorescence
Huygens softwareScientific Volume Imaging-Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serumGE Healthcare#HYCLSH30070.03For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %Milipore1085971000For clearing
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commerial software tool
iSpacersSunJin Lab(varies)Use as spacers for preparations
L-glutamineGibco#25030–024For live imaging medium
Low glucose DMEMGibco11054020For live imaging medium
M2 mediumSigmaM7167To dissect embryos
MethanolVWRVWRC20847.307For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylateSigmaM6752Used to clear embryos
ParaformaldehydeSigmaP6148Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycinSigma#P0781For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambersSigmaC5474Use as spacers for preparations
simLab softwareSimLab soft-Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm(any)-To mount thick embryos.
Triton X-100SigmaT8787For immunofluorescence

Riferimenti

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