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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo documento descrive i metodi per la preparazione dei tessuti, la colorazione e l'analisi di intere papille gustative fungiformi, circumvallate e palato che producono costantemente papille gustative intere e intatte (comprese le fibre nervose che le innervano) e mantengono le relazioni tra le strutture all'interno delle papille gustative e la papilla circostante.

Abstract

Le papille gustative sono raccolte di cellule che trasducono il gusto specializzate per rilevare sottoinsiemi di stimoli chimici nella cavità orale. Queste cellule trasduttrici comunicano con le fibre nervose che trasportano queste informazioni al cervello. Poiché le cellule che trasducono il gusto muoiono continuamente e vengono sostituite durante l'età adulta, l'ambiente delle papille gustative è sia complesso che dinamico, richiedendo analisi dettagliate dei suoi tipi di cellule, delle loro posizioni e di eventuali relazioni fisiche tra di loro. Le analisi dettagliate sono state limitate dall'eterogeneità e dalla densità lingua-tessuto che hanno ridotto significativamente la permeabilità degli anticorpi. Questi ostacoli richiedono protocolli di sezionamento che si traducono nella divisione delle papille gustative tra le sezioni in modo che le misurazioni siano solo approssimate e le relazioni cellulari vadano perse. Per superare queste sfide, i metodi qui descritti comportano la raccolta, l'imaging e l'analisi di intere papille gustative e singoli pergole terminali da tre regioni del gusto: papille fungiformi, papille circumvallate e palato. La raccolta di papille gustative intere riduce i pregiudizi e la variabilità tecnica e può essere utilizzata per riportare numeri assoluti per caratteristiche tra cui il volume delle papille gustative, l'innervazione totale delle papille gustative, la conta delle cellule trasduttrici e la morfologia dei singoli pergole terminali. Per dimostrare i vantaggi di questo metodo, questo documento fornisce confronti tra le papille gustative e i volumi di innervazione tra le papille gustative fungiformi e circumvallate utilizzando un marcatore generale delle papille gustative e un'etichetta per tutte le fibre gustative. Viene inoltre fornito un flusso di lavoro per l'uso dell'etichettatura genetica a cellule sparse dei neuroni del gusto (con sottoinsiemi etichettati di cellule che trasducono il gusto). Questo flusso di lavoro analizza le strutture dei singoli pergolati del nervo del gusto, i numeri di tipo cellulare e le relazioni fisiche tra le cellule utilizzando un software di analisi delle immagini. Insieme, questi flussi di lavoro forniscono un nuovo approccio per la preparazione dei tessuti e l'analisi sia di intere papille gustative che della morfologia completa dei loro pergole innervanti.

Introduzione

Le papille gustative sono raccolte di 50-100 cellule epiteliali specializzate che legano sottoinsiemi di stimoli chimico-gustativi presenti nel cavo orale. Si ritiene generalmente che le cellule che trasducono il gusto esistano come tipi1,2,3,4,5,6,7,8,9,inizialmente sulla base di criteri di microscopia elettronica che sono stati successivamente correlati con marcatori molecolari. Le cellule di tipo II esprimono fosfolipasi C-beta 2 (PLCβ2)2 e canale cationico potenziale del recettore transitorio, sottofamiglia M membro5 1 e comprendono cellule che trasducono dolce, amaro e umami1,10. Le cellule di tipo III esprimono anidrasi carbonica 4 (Car4)11 e proteina 258 associata sinaptosomiale e denotano cellule che rispondono principalmente al gusto aspro11. Le cellule che trasducono la salsedine non sono state così chiaramente delineate12,13,14,ma potrebbero potenzialmente includere le cellule di tipo I, tipo II e III15,16,17,18,19. L'ambiente gustativo è complesso e dinamico, dato che le cellule che trasducono il gusto si trasformano continuamente per tutta l'età adulta e sono sostituite da progenitori basali3,20,21. Queste cellule che trasducono il gusto si collegano alle fibre nervose pseudo-unipolari dai gangli genicolati e petrosali, che passano le informazioni sul gusto al tronco cerebrale. Questi neuroni sono stati principalmente classificati in base al tipo di informazioni sul gusto che portano22,23 perché le informazioni sulla loro morfologia sono state sfuggenti fino a poco tempo fa24. Le cellule di tipo II comunicano con le fibre nervose tramite la proteina ionica modulatore dell'omeostasi del calcio1 canali ionici 25,mentre le cellule di tipo III comunicano tramite le sinapsi classiche8,26. Un'ulteriore caratterizzazione delle cellule delle papille gustative, compresi i lignaggi di tipo cellulare trasduttore, i fattori che influenzano la loro differenziazione e le strutture dei pergole di collegamento sono tutte aree di indagine attiva.

Gli studi sulle papille gustative sono stati ostacolati da diverse sfide tecniche. I tessuti eterogenei e densi che compongono la lingua riducono significativamente la permeabilità anticorpale per l'immunoistochimica27,28,29. Questi ostacoli hanno reso necessari protocolli di sezionamento che si traducono nella divisione delle papille gustative tra le sezioni in modo che le misurazioni siano approssimate in base a sezioni rappresentative o sommate tra sezioni. In precedenza, le sezioni sottili rappresentative sono state utilizzate per approssimare sia i valori di volume che i conteggi delle celle trasduttori30. Il sezionamento seriale più spesso consente l'imaging di tutte le sezioni di papille gustative e la somma delle misurazioni di ciascuna sezione31. Tagliare sezioni così spesse e selezionare solo papille gustative intere distorce il campionamento verso papille gustative più piccole32,33,34. Le stime di innervazione nervosa delle papille gustative sezionate sono state basate su analisi dei numeri di pixel13,35,se quantificati in tutto36,37,38. Queste misurazioni ignorano completamente la struttura e il numero di singoli pergole nervose, perché i pergole sono divisi (e di solito scarsamente etichettati). Infine, sebbene la desquamazione dell'epitelio consenta di macchiare intere papille gustative39,40,rimuove anche le fibre nervose delle papille gustative e potrebbe interrompere le normali relazioni tra le cellule. Pertanto, le indagini sulle relazioni strutturali all'interno delle papille gustative sono state limitate a causa di questa interruzione causata dagli approcci di colorazione.

La raccolta dell'intera struttura elimina la necessità di sezioni rappresentative e consente la determinazione di misurazioni a valori assoluti di volumi, conteggi cellulari e morfologie della struttura41. Questo approccio aumenta anche l'accuratezza, limita i pregiudizi e riduce la variabilità tecnica. Quest'ultimo elemento è importante perché le papille gustative mostrano una notevole variabilità biologica sia all'internodi 34,42 che tra le regioni43,44e le analisi delle papille gustative intere consentono di confrontare i numeri assoluti delle cellule tra condizioni di controllo e sperimentali. Inoltre, la capacità di raccogliere papille gustative intatte consente l'analisi delle relazioni fisiche tra le diverse cellule trasducenti e le fibre nervose associate. Poiché le cellule che trasducono il gusto possono comunicare tra loro45 e comunicare con le fibre nervose46, queste relazioni sono importanti per la normale funzione. Pertanto, le condizioni di perdita di funzione potrebbero non essere dovute a una perdita di cellule, ma piuttosto a cambiamenti nelle relazioni cellulari. Qui è fornito un metodo per raccogliere intere papille gustative per ottenere i benefici delle misurazioni assolute per perfezionare le analisi del volume sia per le papille gustative che per le loro innervazioni, i conteggi e le forme delle cellule gustative e per facilitare le analisi delle relazioni trasduttore-cellula e delle morfologie nervo-pergolato. Due flussi di lavoro sono anche presentati a valle di questo nuovo metodo a monte intero per la preparazione dei tessuti: 1) per l'analisi del volume delle papille gustative e dell'innervazione totale e 2) per l'etichettatura genetica a cellule sparse dei neuroni del gusto (con sottoinsiemi di cellule che trasducono il gusto etichettate) e successive analisi della morfologia del pergolato del nervo del gusto, del numero di tipi di cellule del gusto e delle loro forme e l'uso di software di analisi delle immagini per analizzare le relazioni fisiche tra le cellule trasducenti e quelle trasduttori cellule e i loro pergole nervose. Insieme, questi flussi di lavoro forniscono un nuovo approccio alla preparazione dei tessuti e per l'analisi di intere papille gustative e la morfologia completa dei loro pergole innervanti.

Protocollo

NOTA: Tutti gli animali sono stati curati in conformità con le linee guida stabilite dalla politica del servizio sanitario pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio e dalla guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I topi Phox2b-Cre (ceppo MMRRC 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) o i topi TrkBCreER (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) sono stati allevati con topi reporter tdTomato (Ai14). AdvillinCreER47 sono stati allevati con Phox2b-flpo48 e Ai65. Per le iniezioni di 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU), l'EdU è stata preparata e le dosi calcolate secondo Perea-Martinez et al.49.

1. Preparazione dei materiali

  1. Preparazione di soluzioni
    1. Sciogliere 5,244 g di fosfato di sodio monobasico e 23,004 g di fosfato di sodio bibasico in acqua a doppio distillato (ddH2O) su una piastra di agitazione. Regolare il pH a 7,4 e portare il volume totale ad ottenere 1 L di tampone fosfato di sodio (PB) da 0,2 M.
    2. Sciogliere la paraformaldeide in ddH2O in una cappa aspirante riscaldando mescolando su una piastra di agitazione fino a quando la soluzione raggiunge i 90 °C. Aggiungere 4 M di soluzione di NaOH a goccia per eliminare la paraformaldeide e filtrare la soluzione utilizzando un matraccio Erlenmeyer sottovuoto e un filtro ceramico con carta da filtro. Aggiungere un volume uguale di 0,2 M PB e regolare il pH a 7,4 per ottenere il 4% di PFA in 0,1 M PB.

2. Preparazione dei tessuti

  1. Raccolta del tessuto
    1. Sacrificare topi che usano un sovradosaggio anestetico con una soluzione di lavoro contenente 10 mL di soluzione salina sterile e 0,25 mL di una soluzione madre contenente 5 g di 2,2,2-tribromoetanolo e 5 ml di alcool terz-amilico. Perfondere transcardialmente con il 4% di PFA in 0,1 M PB; rimuovere le lingue e il palato.
    2. Isolare le papille gustative circumvallate utilizzando un taglio coronale che separa la lingua posteriore, dietro l'eminenza intermolare; tagliare le papille gustative con una lama di rasoio; e poi tagliare in due la lingua anteriore sulla linea mediana. Post-fix durante la notte a 4 °C con il 4% di PFA in 0,1 M PB.
    3. Crioproteggere il tessuto in saccarosio al 30% durante la notte a 4 °C.
      NOTA: Il tessuto può essere congelato in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzando 2-metilbutano refrigerato in un becher su ghiaccio secco e conservato a -80 °C se la procedura deve essere sospesa qui.
  2. Papille gustative fungiformi
    1. Raffreddare il 2-metilbutano in un becher su ghiaccio secco in preparazione della fase 2.2.8.
    2. Scongelare e risciacquare la lingua in 0,1 M PB. Posizionare metà della lingua anteriore contenente le papille fungiformi su un vetrino sotto un microscopio sezionante.
    3. Utilizzare pinze smussate e forbici di dissezione per rimuovere il muscolo. Utilizzare pinze smussate per tenere aperto il tessuto mentre l'epitelio linguale è curvo e garantire un orientamento piatto mantenendo le lame delle forbici di dissezione grossolana parallele all'epitelio.
    4. Scartare l'epitelio ventrale non cheratinizzato della lingua in quanto non contiene papille gustative.
    5. Utilizzare forbici di dissezione fine per una dissezione più vicina alla parte inferiore dell'epitelio cheratinizzato.
      NOTA: È importante sezionare vicino all'epitelio in modo che il muscolo rimanente sia di spessore uniforme e la superficie sia liscia per garantire una penetrazione uniforme degli anticorpi. La conseguenza dello spessore non uniforme del muscolo rimanente sarà la sezione irregolare sul criostato, con esposizione dell'epitelio in aree con meno muscoli e uno strato muscolare più spesso per altre aree, che impedisce la penetrazione degli anticorpi.
    6. Usa la pinza smussata per posare un pezzo di epitelio in uno stampo tissutale (lato muscolare verso il basso) e assicurati che sia piatto. Una volta che il tessuto è piatto, aggiungere una goccia di OCT al tessuto.
      NOTA: Dato che la punta della lingua è curva, potrebbe essere necessario effettuare un taglio nell'epitelio dove è curvato in modo che il tessuto possa essere fatto posare piatto.
    7. Posizionare lo stampo del tessuto su una base metallica (precedentemente raffreddata in ghiaccio secco) sotto l'ambito di dissezione. Continuare a picchiettare leggermente il tessuto con la pinza fino a quando l'OCT non si è congelato per garantire che il tessuto si congeli il più piatto possibile.
    8. Una volta che l'OCT si è congelato, aggiungere rapidamente un ulteriore OCT e posizionare lo stampo in un becher di 2-metilbutano (raffreddato in ghiaccio secco) fino a quando non viene congelato.
    9. Sezionamento criostato
      NOTA: Il criostato viene utilizzato per la rimozione fine del tessuto sottocutaneo rimanente, che può inibire la penetrazione degli anticorpi (Figura 1).
      1. Montare gli stampi OCT sul criostato e tagliare sezioni da 20 μm. Raccogli ogni sezione e visualizzala al microscopio ottico per valutarne la vicinanza alla base dell'epitelio (Figura 1E - H).
      2. Dopo che il tessuto è stato rasato dalla parte inferiore dell'epitelio, scongelare l'epitelio e risciacquarlo due volte in 0,1 M PB su uno shaker.
  3. Papille gustative circumvallate
    1. Usando un taglio coronale con una lama di rasoio, separare la papilla circumvallata dalla lingua anteriore. Utilizzare due tagli parasagittali con la stessa lama di rasoio per rimuovere il tessuto laterale alla papilla sotto un cannocchiale di dissezione. Posizionare la papilla in uno stampo di tessuto usando una pinza in modo che un bordo laterale della papilla circumvallata sia rivolto verso il fondo della muffa del tessuto.
      NOTA: Il tessuto può essere congelato in OCT utilizzando 2-metilbutano refrigerato in un becher su ghiaccio secco e conservato a -80 °C se la procedura deve essere sospesa qui.
    2. Tagliare il tessuto in sezioni galleggianti da 90 μm sul criostato.
  4. Papille gustative al palato
    1. Tagliare il palato duro anteriormente alla giunzione del palato molle e duro (Figura 2). Utilizzare le forbici per separare il palato molle dal tessuto sottostante, assicurandosi che eventuali frammenti ossei rimanenti vengano tagliati. Rimuovere ulteriori muscoli e tessuto connettivo.
      NOTA: Una volta rimosso, tutto il tessuto che rimane sarà costituito da ghiandole e tessuto connettivo sciolto, che sono leggermente aderenti alla parte inferiore del palato.
    2. Tenere il palato con una pinza smussata e rimuovere le ghiandole rimanenti e il tessuto connettivo sciolto raschiandoli delicatamente con una lama di rasoio.
      NOTA: Il tessuto può essere congelato in OCT utilizzando 2-metilbutano refrigerato in un becher su ghiaccio secco e conservato a -80 °C se la procedura deve essere sospesa qui.

3. Colorazione immunoistochimica

  1. Lavare i fazzoletti con 0,1 M PB, 3 x 15 min. Posizionare i tessuti in tubi da 1 mL con soluzione bloccante (3% siero d'asino, 0,5% tensioattivo non ionico (vedi Tabella dei Materiali),0,1 M PB) a 4 °C durante la notte.
  2. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare il tessuto in anticorpo primario (coniglio anti-PCLβ2) in soluzione anticorpale (0,1 M PB, tensioattivo non ionico allo 0,5%) per 5 giorni a 4 °C.
  3. Lavare con 0,1 M PB, 4 x 15 minuti ogni lavaggio e incubare in anticorpo secondario asino anti-coniglio 488 (1:500) in soluzione anticorpale per 2 giorni a 4 °C.
  4. Lavare con 0,1 M PB, 4 x 15 minuti ogni lavaggio e bloccare con siero di coniglio normale al 5% in soluzione anticorpale.
  5. Lavare con 0,1 M PB, 4 x 15 min. Incubare con anticorpo anti-coniglio asino (20 μg/mL) in soluzione anticorpale per 2 giorni a 4 °C.
  6. Lavare con 0,1 M PB, 4 x 15 minuti ogni lavaggio, quindi incubare con l'anticorpo primario dsRed (coniglio) coniugato su un'etichetta fluorescente (secondo le istruzioni del produttore) in una soluzione anticorpale per 5 giorni a 4 °C.
  7. Lavare con 0,1 M PB, 4 x 15 minuti ogni lavaggio, quindi incubare con anticorpo primario (capra anti-Car4 (1:500)) in soluzione anticorpale per 5 giorni a 4 °C.
  8. Lavare con 0,1 M PB, 4 x 15 minuti ogni lavaggio. Incubare con l'anticorpo secondario asino anti-capra 647 (1:500) in soluzione anticorpale per 2 giorni a 4 °C.
  9. Lavare con PB 0,1 M, 4 x 15 minuti ogni lavaggio e montare (lato epiteliale verso l'alto) in un supporto di montaggio acquoso e posizionare una copertura sulla sezione del tessuto.
    NOTA: Se si utilizzano anticorpi di specie diverse, come nel caso della cheratina-8 e solo dsRed, aggiungere tutti gli anticorpi primari alla soluzione anticorpale nella fase 3.2 e tutti gli anticorpi secondari nel passaggio 3.3 prima di procedere al passaggio 3.9.

4. Imaging confocale e deconvoluzione

  1. Cattura immagini confocali utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 60x (apertura numerica = 1,40), 4 ms / pixel, zoom di 3, Kalman di 2 e dimensioni di 1024 x 1024. Selezionate una dimensione del passo di 0,47 mm lungo l'asse Z. Per catturare l'innervazione alla papilla, utilizzare uno zoom di 2,5 se il campo visivo con uno zoom di 3 è troppo stretto per catturare tutta l'innervazione alla papilla.
  2. Per deconvolure le immagini, si noti che alcune impostazioni verranno automaticamente importate con l'immagine; pertanto, inserisci i dettagli rimanenti per modalità, obiettivo, apertura numerica, mezzo di immersione, mezzo campione e fluorofori catturati nell'immagine. Quindi, selezionare Deconvoluzione 3D.

5. Analisi delle immagini

  1. Papille gustative e volume di innervazione
    1. Importa pile di immagini decovolute in un software di analisi delle immagini basato su pixel (vedi la Tabella dei materiali)per determinare il volume delle papille gustative e il volume dell'innervazione totale all'interno della papilla gustativa.
      1. Deseleziona Volume nel menu Oggetto principale.
      2. Selezionate Aggiungi nuove superfici dal menu Oggetto (Object). Selezionare Ignora creazione automatica, modifica manualmentee quindi Contorno.
      3. Fai clic su Seleziona e osserva la freccia che appare come un + per aiutare a tracciare il bordo della papilla gustativa. Spostare l'affettatrice e delineare la papille gustativa in ogni sezione ottica. Una volta completati i contorni, fate clic su Crea superficie (Create Surface).
      4. Osservate l'oggetto volume della papilla gustativa che ora appare nel menu Principale Oggetto. Individua il volume della papilla gustativa in Strumenti.
    2. Volume di innervazione all'interno della papilla gustativa
      1. Seleziona l'icona a forma di matita sotto l'oggetto papille gustativa, quindi seleziona Maschera tutto.
      2. Nel menu a discesa, selezionare il canale fluorescente che corrisponde all'etichetta della fibra nervosa. Selezionare Crea canale duplicato.
      3. Selezionate Imposta voxel superficie esterna su:, quindi immettete 0 nella casella.
      4. Osservate il nuovo canale che appare nella finestra Regolazione schermo, che è un duplicato inalterato del canale fluorescente selezionato all'interno della papille gustativa.
      5. Nel menu Oggetto principale, selezionate Crea nuova superficie ( Create New Surface) . Deseleziona Salta creazione automatica, modifica manualmente.
      6. Fare clic due volte sulla freccia blu per procedere al passaggio successivo.
      7. Clicca su Elimina,quindi clicca sulla doppia freccia verde per completare la superficie, che rappresenta il volume delle fibre nervose presenti all'interno della papilla gustativa. Per trovare il valore del volume, selezionare Strumenti nel menu Oggetto fibra nervosa e selezionare Volume dal menu a discesa.
    3. Volume di innervazione alla papilla
      1. Creare un volume della papille gustativa come descritto al paragrafo 5.1.
      2. Seleziona l'icona a forma di matita sotto l'oggetto papille gustative, quindi seleziona Maschera tutto.
      3. Nel menu a discesa, selezionare il canale fluorescente che corrisponde all'etichetta della fibra nervosa. Selezionare Crea canale duplicato.
      4. Selezionate Imposta voxel all'interno della superficie su: e digitate 0 nella casella. Fare clic su OK.
      5. Generate una superficie facendo clic su Aggiungi nuova superficie (Add New Surface). Selezionare Segmenta solo una regione di interesse.
      6. Fai clic sulla freccia blue aumenta il valore Z in modo che la regione di interesse inizi alla base della papilla gustativa.
      7. Fare clic due volte sulla freccia blu per procedere al passaggio successivo.
      8. Fare clic su Elimina, quindi fare clic sulla doppia freccia verde per completare la superficie, che rappresenta il volume dell'innervazione alla papilla. Per trovare il valore del volume, selezionare Strumenti nel menu Oggetto fibra nervosa e selezionare Volume dal menu a discesa.
    4. Analisi del contatto del pergolato terminale
      1. Preparazione dell'immagine
        1. Vai al menu Modifica e seleziona Ritaglia 3D. Ritaglia l'immagine su tutti i lati, rimuovendo lo spazio al di fuori della papilla gustativa.
          NOTA: ritaglia il più vicino possibile alla papilla gustativa senza rimuovere alcuna struttura pertinente: qualsiasi immagine in eccesso allungherà il tempo di elaborazione.
        2. Selezionare Modifica dal menu principale, fare clic su Cambia tipo di dati. Selezionare A: 32 bit float dal menu a discesa.
        3. Selezionate Aggiungi nuove superfici dal menu Oggetto (Object). Fare clic su Salta creazione automatica, modifica manualmente, selezionare Contornoe quindi trascinare la posizione della sezione verso destra per trovare il numero totale di sezioni ottiche.
        4. Genera voxel isometrici e assicurati che invece dei voxel che sono rettangoli (0,0691 x 0,0691 x 0,474) come XxYxZ, rispettivamente, i voxel siano 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 dividendo i rettangoli in cubi con valori identici per intensità di fluorescenza al voxel rettangolare originale. Selezionare Proprietà immagine. Quindi, dividere il valore Z per Voxel Size per il valore X o Y (= 0,474/0,0691) e moltiplicare tale valore per il numero di sezioni (sezioni ottiche) trovate nel passaggio precedente.
        5. Torna a Modifica nel menu principale e seleziona Ricampiona 3D.
        6. Sostituite il valore Z (numero di sezioni) con il valore appena calcolato.
      2. Creazione di superfici automatiche basate sulla fluorescenza
        1. Fate nuovamente clic su Aggiungi nuova superficie (Add New Surface) per aggiungere una nuova superficie, deselezionate Segmenta solo una regione di interessee fate clic su Avanti (Next).
        2. Dal menu a discesa Canale sorgente, selezionare il canale per uno dei tipi di cella che trasducono il gusto. Deselezionate Liscia (Smooth) e continuate con il passaggio successivo.
        3. Non alterare nulla nella schermata successiva che mostra l'intervallo di intensità fluorescenti presenti nell'immagine. Fai di nuovo clic sulla freccia blu in basso per passare al passaggio successivo.
        4. Fare clic su Elimina, quindi fare clic sulla doppia freccia verde per completare la superficie.
        5. Vai al menu Oggetto sulla sinistra dello schermo dove apparirà la superficie cellulare completata e verrà chiamata qualcosa di generico come Surface 2. Fare doppio clic sul nome della superficie per denominarla in base a ciò che rappresenta l'etichetta.
          NOTA: in questo caso, la superficie generata si basa sulla cella etichettata PLCß2.
        6. Se invece di una superficie sono presenti punti, sotto il menu nell'angolo in basso a sinistra, fate clic su Superficie anziché su Punto centrale ( Center point) . Quindi, fare clic su OK quando richiesto.
        7. Ripetere i passaggi 5.3.2.1-5.3.2.5 per gli altri marcatori cellulari che trasducono il gusto e il marcatore delle fibre nervose.
        8. Salva (esporta) l'avanzamento.
        9. Fate clic su un tipo di cella Superficie (Surface) nel menu principale. Dal menu di quell'oggetto, fai clic su Strumenti, quindi fai clic su Trasformazione a distanza.
        10. Attendi che venga visualizzata una finestra pop-up intitolata XTDistanceTransformation. Selezionate Oggetto superficie esterna ( Outside Surface Object) . Prendete nota del nuovo canale visualizzato nel menu Regolazione schermo (Display Adjustment) denominato Nome distanza dalla superficie.
        11. Selezionate la superficie Fibra nervosa (Nerve Fiber surface) dal menu Oggetto (Object). Fare clic sull'icona a forma di matita e quindi su Maschera tutto.
        12. Dal menu a discesa visualizzato, selezionate il nuovo nome distanza dal canale distanza alla superficie. Prendete nota del nuovo canale visualizzato nella finestra Regolazione schermo denominato Distanza mascherata dal nome della superficie.
        13. Creare un nuovo oggetto utilizzando il menu Oggetto principale. Deselezionate Segmenta solo una regione di interesse e fate clic sulla freccia blu. Selezionare la distanza mascherata dal canale PLCß2 e deselezionare Liscia.
        14. Nella schermata successiva, controlla se ci sono regioni in cui le cellule che trasducono il gusto si trovano alla più piccola distanza dalle fibre nervose distinguibili da questo software. Per fare questo, impostare un limite di 0,01-0,11 μm per verificare la presenza di qualsiasi fluorescenza delle cellule recettrici così vicino alle fibre nervose.
        15. Digitare 0.01 nella casella verde sul lato sinistro per impostare la soglia inferiore, premere TAB. Quindi fare clic sul pulsante rosso e digitare 0.11 per impostare la soglia superiore. Premere TAB e quindi fare clic sulla freccia blu in basso per passare al passaggio successivo.
        16. Fare clic su Elimina e quindi sulla doppia freccia verde per terminare.
        17. Rinominate questa superficie entro 0,01-0,11 di PLCß2 nel menu Oggetto (Object). Selezionate Entro 0,01 - 0,11 della superficie PLCß2 nel menu Oggetto (Object).
        18. Seleziona la matita quindi fai clic su Maschera tutto. Selezionate il canale rosso (fibra nervosa) dal menu a discesa e fate clic su OK. Prendete nota del nuovo canale visualizzato nella finestra regolazione dello schermo denominato MASKED CHS2.
        19. Clicca sul nome del canale; rinominare il canale entro 0,01 - 0,11 di PLCß2.
          NOTA: si tratta di un canale fluorescente che rappresenta un duplicato del canale fluorescente rosso presente all'interno della superficie creata.
        20. Fare clic sul bianco al centro del selettoredel colore . Selezionare un colore che contrasti con i colori delle strutture.
        21. Esporta (cioè salva) il file in questa fase.
        22. Ripetere i passaggi 5.4.2.9-5.4.2.21 per altri marcatori cellulari che trasducono il gusto.
        23. Esporta (cioè salva) il file in questa fase.
          NOTA: Per analizzare la vicinanza di un tipo di cellula etichettato a un altro, è sufficiente sostituire la superficie della fibra nervosa nel passaggio 5.4.2.11 (e nei passaggi seguenti) con l'oggetto di interesse e i componenti equivalenti che riguardano ogni passaggio successivo.

6. Ricostruzione del pergolato neuronale e quantificazione del numero assoluto di cellule

  1. Tracciamento e analisi del pergolato terminale
    1. Aprire il file immagine deconvoluto in un software di analisi delle immagini vettoriale 3D (vedi tabella dei materiali),selezionare Traccia,fare clic su Neurone,quindi fare clic su Dendrite.
    2. Scorri fino alla base della papilla gustativa nella pila di immagini. Traccia ogni fibra fino alla fine mentre scorri la pila di immagini.
    3. All'estremità del ramo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla fine e selezionare Fine. Nei punti di diramazione, fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Nodo biforcante ( Bifurcating Node.
      NOTA: questo consente di tracciare un ramo fino alla fine e quindi di tornare al punto di biforcazione e tracciare l'altro ramo con il programma che riconosce che questo tracciamento è ancora dello stesso neurone.
    4. Salvare il file di dati come file . DAT, che può quindi essere aperto per l'analisi nel software di analisi delle immagini vettoriale 3D.

7. Quantificazione del numero di celle

  1. Quantificare le cellule delle papille gustative etichettate in qualsiasi pacchetto software di analisi delle immagini, purché marcatori distinti per la trasduzione di tipi di cellule ancorati alla posizione z possano essere posizionati a livello nucleare.

Risultati

Colorazione dell'epitelio linguale con anticorpi contro dsRed e cheratina-8 (un marcatore generale delle papille gustative) etichettato sia come papille gustative intere che con tutta l'innervazione delle papille gustative nei topi Phox2b-Cre:tdTomato50,51 (Figura 3A). L'imaging di queste papille gustative dai pori alle loro basi ha fornito immagini del piano x-y a più alta risoluzione (Figura 3A

Discussione

Lo sviluppo di un approccio per raccogliere e macchiare costantemente intere papille gustative da tre regioni del gusto della cavità orale (fungiforme, circumvallato e palato) fornisce miglioramenti significativi per l'analisi delle cellule che trasducono il gusto, il monitoraggio delle cellule appena incorporate, l'innervazione e le relazioni tra queste strutture. Inoltre, facilita la localizzazione di un potenziale marcatore neuronale secondario sia all'interno che all'esterno di una popolazione etichettata

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Kavisca Kuruparanantha per i suoi contributi alla colorazione dei tessuti e all'imaging delle papille gustative circumvallate, Jennifer Xu per la colorazione e l'imaging dell'innervazione alla papilla, Kaytee Horn per la cura degli animali e la genotipizzazione e Liqun Ma per la colorazione dei tessuti delle papille gustative del palato molle. Questo progetto è stato supportato da R21 DC014857 e R01 DC007176 a R.F.K e F31 DC017660 a L.O.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolACROS OrganicsAC421430100
2-MethylbutaneACROS126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-007-00315.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson Immuno Research712-605-150(1:500)
AutoQuant X3 software Media Cybernetics
Blunt End ForcepsFine Science Tools FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation KitMolecular ProbesC10637Follow kit instructions 
CoverglassMarienfeld107242
Cytokeratin-8Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826) Troma1 supernatant(1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse)RobozRS-5619
Dissection Scissors (fine)MoriaMC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21206(1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555ThermoFisher ScientificA31572(1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgGJackson Immuno Research805-477-008(1:500)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides)12-550-15
Goat anti-Car4R&D Systems AF2414(1:500)
Imaris Bitplane pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + ExplorerMBF Biosciences3D vector based image analysis software
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-121
Normal Rabbit Serum Equitech-Bio, IncSR30
Olympus FV1000(multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
ParaformaldehydeEMDPX0055-34% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRedLiving Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)632496(1:500)
Rabbit anti-PLCβ2 Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-206(1:500)
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP330-500
tert-Amyl alcoholAldrich Chemical Company8.06193
Tissue MoldsElectron Microscopy Sciences70180
Tissue-Tek® O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100BIO-RAD#161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling KitThermoFisher ScientificZ25305Follow kit instructions 

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