Imaging 3D delle fibre di collagene PDL durante il movimento ortodontico dei denti nel modello murino mandibolare

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per generare movimento ortodontico dei denti nei topi e metodi per la visualizzazione 3D delle fibre di collagene e dei vasi sanguigni del legamento parodontale senza sezioni.

Abstract

Il movimento ortodontico dei denti è un complesso processo biologico di rimodellamento alterato dei tessuti molli e duri come risultato di forze esterne. Per comprendere questi complessi processi di rimodellamento, è fondamentale studiare i tessuti dentali e parodontali all'interno del loro contesto 3D e quindi ridurre al minimo qualsiasi sezionamento e artefatti tissutali. I modelli di topo sono spesso utilizzati nella biologia dello sviluppo e strutturale, così come nella biomeccanica a causa delle loro piccole dimensioni, alto tasso metabolico, genetica e facilità di manipolazione. In linea di principio questo li rende anche modelli eccellenti per studi relativi all'odontoiatria. Tuttavia, un grosso impedimento è la loro piccola dimensione del dente, i molari in particolare. Questo documento ha lo scopo di fornire un protocollo passo dopo passo per generare il movimento ortodontico dei denti e due metodi per l'imaging 3D del componente fibroso legamento parodontale di un molare mandibolare del topo. Il primo metodo presentato si basa su una configurazione micro-CT che consente l'imaging di miglioramento della fase dei tessuti di collagene fresco. Il secondo metodo è un metodo di compensazione ossea che utilizza cinnamato etilico che consente l'imaging attraverso l'osso senza sessare e preserva la fluorescenza endogena. Combinando questo metodo di compensazione con topi reporter come Flk1-Cre; TdTomato ha fornito una prima opportunità nel suo genere di immagine della vascuola 3D nel PDL e nell'osso alveolare.

Introduzione

Il processo biologico di base nel movimento ortodontico dei denti (OTM) è il rimodellamento osseo. Il trigger per questo processo di rimodellamento è attribuito a cambiamenti nella struttura del legamento parodontale (PDL) come lo stress della matrice extracellulare (ECM), la necrosi, la distruzione e la formazione dei vasi^{sanguigni 1,2,3}. Altri possibili fattori scatenanti per il rimodellamento osseo alveolare sono correlati al rilevamento della forza da parte degli osteociti nell'osso, così come alla deformazione meccanica dell'osso alveolare stesso; tuttavia il loro ruolo in OTM non è ancora del tutto chiarito^4,5.

Nonostante molti studi volti a rivelare le relazioni struttura-funzione del PDL durante l'OTM, un chiaro meccanismo funzionale deve ancora essere^{definito 6,7}. La ragione principale di ciò è la sfida nel recupero dei dati di un tessuto molle (PDL) situato tra due tessuti duri (cemento e osso alveolare). I metodi accettati per raccogliere informazioni strutturali di solito richiedono fissazione e sezionamento che interrompono e modificano la struttura PDL. Inoltre, la maggior parte di questi metodi fornisce dati 2D che, anche se non distorti, forniscono solo informazioni parziali e localizzate. Poiché il PDL non è uniforme nella sua struttura e funzione, è giustificato un approccio che affronta la struttura 3D intatta dell'intero complesso dentale-PDL-osso.

Questo documento descriverà un metodo per generare un OTM nei topi e due metodi che consentono la visualizzazione 3D delle fibre di collagene nel PDL senza alcuna sezione del campione.

I modelli murini sono ampiamente utilizzati per esperimenti in vivo in medicina, biologia dello sviluppo, somministrazione di farmaci e studi strutturali. Possono essere geneticamente modificati per eliminare o migliorare proteine e funzioni specifiche; forniscono un controllo dello sviluppo rapido, ripetibile e prevedibile; sono anche facili da immaginare grazie alle loro piccole dimensioni⁸. Nonostante i loro numerosi vantaggi, i modelli di topo nella ricerca dentale non vengono utilizzati frequentemente, specialmente quando le manipolazioni cliniche sono giustificate, principalmente a causa dei denti di piccole dimensioni. Modelli animali come ratti^9,10,11,cani^12,13,maiali^{14,15,16 e scimmie 17 sono} usati più spesso dei topi. Con il recente sviluppo di tecniche di imaging ad alta risoluzione, i vantaggi dell'utilizzo di un modello di mouse per decifrare i processi contorti in OTM sono numerosi. Questo articolo presenta un metodo per generare un movimento mesiale del dente molare nella madibola con livelli di forza costanti che innescano il rimodellamento osseo. La maggior parte degli esperimenti OTM sui roditori sono fatti nella mascella, poiché la mobilità della mattiglia e la presenza della lingua aggiungono un altro livello di complessità. Tuttavia, la madibola ha molti vantaggi quando si desidera l'integrità strutturale 3D. Può essere facilmente sezionato come un osso intero; in alcune specie può essere separato in due emi-madibole attraverso la sifisi fibrosa; è compatto, piatto e contiene solo i denti senza spazi seno. Al contrario, la mascella è una parte del cranio e strettamente correlata ad altri organi e strutture, quindi è necessaria una sezione estesa per sezionare l'osso alveolare con i denti associati.

Utilizzando una camera di umidità interna accoppiata a un sistema di carico all'interno di una micro-TAC ad alta risoluzione che consente il miglioramento della fase, abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare tessuti fibrosi freschi in 3D come^{precedentemente descritto 9,18,19,20,21,22,23.} I tessuti freschi vengono scansionati immediatamente dopo che l'animale è stato sacrificato senza alcuna colorazione o fissazione, il che riduce i manufatti tissutali e le alterazioni delle proprietà biomeccaniche. Questi dati 3D possono essere utilizzati per analisi di distribuzione e direzione delle fibre come descritto altrove¹⁹.

Il secondo metodo di imaging 3D di tessuti interi qui presentato si basa sulla pulizia ottica della madibola che consente l'imaging delle fibre PDL attraverso l'osso senza alcuna sezione. È interessante notare che consente anche la visualizzazione delle fibre di collagene dell'osso stesso, tuttavia questo non sarà discusso qui. In generale, ci sono due metodi per la pulizia dei tessuti. Il primo è la radura a base acquosa in cui il campione è immerso in una soluzione acquosa con un indice di rifrazione maggiore di 1,4 attraverso una semplice immersione, iperidratazione o immersione di idrogel. Tuttavia, questo metodo è limitato nel livello di trasparenza e nella conservazione strutturale del tessuto e quindi richiede la fissazione del tessuto. Il secondo metodo che produce campioni altamente trasparenti e non richiede fissazione è il metodo di compensazione a base di^{solventi 24,25}. Abbiamo generato un metodo di compensazione modificato a base di solventi basato sull'etil-3-fenilprop-2-enoato (etil cinnamato, ECi) per i campioni mandibolari. Questo metodo ha i vantaggi di utilizzare agenti di compensazione non tossici per uso alimentare, restringimento minimo dei tessuti e conservazione delle proteine fluorescenti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Linee guida del NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Harvard (protocollo n. 01840).

1. Movimento ortodontico dei denti

1. Per generare un letto per topi, utilizzare una piattaforma di plastica piatta con un poggiacapo angolato a forma di cuneo a 45°. Il poggiacapo può essere generato tagliando una scatola di plastica.
   1. Elevare l'estremità della testa della piattaforma per generare un angolo di circa 30° tra il poggiacapo e il piano del tavolo. Attaccare una graffetta spessa piegata (0,036" di diametro) all'estremità laterale della testa per tenere gli incisivi superiori.
   2. All'estremità della coda, generare una superficie elevata a cui è possibile attaccata una catena di potenza ortodontica per contenere gli incisivi inferiori. Vedere la figura 1 per una piattaforma di esempio.
2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di xiazina a 10 mg/kg e chetamina 100 mg/kg utilizzando una siringa da 1 ml e un ago calibro 27.
3. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma su misura e immobilizzare la mascella superiore agganciando gli incisivi superiori sul loop della graffetta. Aprire la mascella inferiore del mouse con la catena di potenza ortodontica agganciata agli incisivi inferiori. Tenere le guance retrattili con il retrattile per bocca mini-colibri.
4. Posizionare la piattaforma al microscopio chirurgico o a qualsiasi altro stereoscopio che possa raggiungere un ingrandimento di 5-6x.
5. Applicare 50 μL di soluzione salina (circa 1 goccia) sugli occhi del topo per evitare la disidratazione corneale. Reintegrare la soluzione salina ogni 20 minuti.
6. Tagliare un pezzo di un filo di alluminio (0,08 mm di diametro) di 1 cm di lunghezza. Far scorrere il filo dal lato buccale lingualmente nell'area interprossimale soffiare il punto di contatto tra il primo e il secondo molare utilizzando un portaaghi microchirurgici. Lasciare il bordo libero di 2 mm davanti al primo molare per essere infilato nell'estremità della molla.
7. Tagliare un pezzo di bobina di nichel titanio (NiTi), di circa 7-9 fili di lunghezza.
   NOTA: Le proprietà elastiche della bobina forniranno forza costante per il movimento ortodontico. La lunghezza totale non tesa della bobina deve essere più corta dello spazio tra l'incisivo e il molare. Tieni presente che sono necessari altri 2 fili su ogni estremità per ancorare la bobina al dente. Il filo di alluminio viene selezionato al fine di ridurre i manufatti di scansione come l'indurimento del fascio durante la scansione micro-CT.
8. Inserire la molla della bobina NiTi (diametro del filo di 0,15 mm, diametro della bobina interna di 0,9 mm; eroga una forza di 10 g) tra il primo molare inferiore e l'incisivo inferiore. Utilizzare la legatura del filo inserita attorno al primo molare nel passaggio 1.6, ruotare saldamente il filo intorno a 2 fili della molla della bobina per fissare la bobina sul lato molare.
9. Per garantire un livello di forza uniforme, utilizzare esattamente 3 fili attivi tra il primo molare e l'incisivo. Rimuovere temporaneamente la catena di alimentazione dall'incisivo e avvolgere da 2 a 3 fili non tesi sull'incisivo per ancorare la bobina. Far scorrere i fili verso il basso fino al margine gengivale libero incisore.
10. Posizionare uno strato di resina composita scorrevole sul bordo incisale della bobina e curarlo con luce di polimerizzazione dentale. Sostituire la catena di alimentazione dopo aver polimerizzato la resina.
11. Utilizzando la stessa luce di polimerizzazione, riscaldare la bobina NiTi per 20 s. Questo stringerà la bobina NiTi. Il posizionamento finito viene mostrato figura 1C.
12. Lasciare intatto il lato contralaterale o inserire una farsa come il filo tra il primo e il secondo molare.
13. Posizionare il mouse anestetizzato sotto una luce riscaldata per mantenere il mouse caldo fino al recupero.
14. Riposizionare il mouse in una gabbia individuale e monitorare quotidianamente. Non è necessario alcun cambiamento dietetico durante il movimento ortodontico.
    NOTA: Il dispositivo OTM da un lato causa qualche disagio ma non compromette l'alimentazione. Tuttavia, i dispositivi di inserimento su entrambi i lati non sono consigliati a causa della quantità aggiunta di disagio. I farmaci antidolorifici non sono necessari a meno che non si vedono segni esteriori di dolore.

2. Micro-TAC di fibre PDL in emi-madibole fresche

1. Montaggio dell'emi-madibola(Figura 2)
   1. Dopo la durata desiderata del movimento ortodontico, sacrificare il topo tramite lussazione cervicale. Rimuovere la mattiere e separarsi in emi-madibole.
      NOTA: Poiché il campione non verrà fissato, è fondamentale eseguire la dissezione della mascella e il montaggio il prima possibile, idealmente entro 30 minuti.
   2. Rimuovere delicatamente il tessuto molle circostante con una salvietta pulita senza pelucchi.
   3. Rimuovere il dispositivo ortodontico utilizzando forbici e pinzette microchirurgiche al microscopio stereo con almeno 4 volte l'ingrandimento.
   4. Mantenere il campione umido in un volume di 1,5 ml, tubo di micro-centrifuga insieme a un pezzo di salvietta priva di pelucchi inumidita con acqua.
   5. Posizionare la resina composita dentale impacchettabile nello slot del campione sul palco, quindi posizionare l'emi-mandibola fresca nel composito. Prima del montaggio assicurarsi che la superficie ossea a contatto con il composito dentale sia priva di tessuti molli e asciutta, altrimenti il composito dentale non si polimerizza correttamente.
   6. Regolare la posizione dell'emi-madibola fino a quando il primo molare non è centrato sulla scanalatura della linea mediana dello stadio. Assicurarsi che la superficie occlusione sia orizzontale. Curare il composito se soddisfatto del posizionamento.
      NOTA: Ulteriori piccole quantità di compositi dentali possono essere posizionate sui lati dell'emi-madibola e/o attraverso l'incisivo per aiutare a stabilizzare il campione.
   7. Posizionare la salvietta inumidita senza pelucchi all'interno delle piscine di umidità nella fase del campione. Posizionare il composito dentale sulla superficie occlusale del primo molare. Prima di chiudere la camera, assicurarsi che nulla blocchi il percorso dei raggi X a livello del campione.
   8. Apporre la camera nella micro-TAC. Avvitare la camera nello stadio del campione micro-CT in modo da ridurre al minimo il movimento durante l'imaging.
   9. Accendi i raggi X e scatta immagini 2D abbassando verticalmente l'incudine, fino a quando la punta dell'incudine non è circondata dal composito ma non viene rilevato alcun aumento della forza.
   10. Una volta che l'incudine è incorporata nel composito, chiudere la sorgente di raggi X. Quindi, aprire la camera micro-CT e polimeri il composito attraverso la finestra in plexiglass trasparente.
2. Impostazioni micro-CT
   1. Impostare la tensione di sorgente su 40 kV e la corrente su 200 μA. Utilizzando un rilevatore di ingrandimento 10x, posizionare il campione all'interno del frame di visualizzazione. Usa l'binning di 2 per le immagini acquisite.
      NOTA: Poiché il PDL è significativamente meno denso dell'osso e del dente, la visualizzazione del PDL richiede una maggiore potenza e tempo di esposizione. Questo protocollo fornirà le impostazioni per la visualizzazione del PDL.
   2. Impostare il tempo di esposizione di una singola immagine su 25 s. Impostare la rotazione dello stadio campione su un intervallo di 183 gradi o più. Impostare la scansione per 2500 proiezioni. Non utilizzare alcun filtro sorgente a raggi X, le scansioni risultanti hanno una dimensione voxel di 0,76 μm su ciascun lato.
   3. Raccogliere una scansione di riferimento per una corretta ricostruzione secondo le linee guida micro-CT. Utilizzare 1/3 di numero di immagini di riferimento come proiezioni totali. Ricostruire il volume senza un binning aggiuntivo, utilizzando un algoritmo filtrato di proiezione posteriore.

3. Metodo di compensazione (figura 3)

1. Preparare cinque tubi di microcentrofuga da 1,5 ml.
2. Preparare 1,4 ml delle seguenti soluzioni in tubi di micro-centrifuga da 1,5 ml: 4% di paraformaldeide (PFA) in salina tamponata fosfato (PBS), 50% di etanolo (EtOH) in acqua deionizzata (DI), 70% EtOH in acqua DI e due tubi del 100% EtOH.
   NOTA: pfa viene utilizzato per la fissazione del campione. La compensazione ECi funzionerà anche su campioni non con prefisso. Per cancellare i campioni non con prefisso, è sufficiente saltare il passaggio PFA.
3. Posizionare l'emi-madibola sezionata nel 4% di PFA. Coprire con un foglio di alluminio e posizionare sul rocker su un'impostazione delicata a temperatura ambiente per 6 ore.
4. Spostare l'emi-madibola al 50% di EtOH. Posizionarlo sul rocker coperto di luce per 16 ore.
5. Spostare l'emi-madibola al 70% etoh. Posizionarlo sul rocker coperto di luce per 16 ore.
6. Spostare l'emi-madibola al 100% EtOH. Posizionarlo sul rocker coperto di luce per 16 ore.
7. Ripetere 3.6. nel secondo tubo EtOH al 100%.
8. Preparare 5 ml di ECi in un tubo di vetro o polipropilene.
   NOTA: ECi scioglie il polistirolo, ma non il polipropilene. Inoltre, se non si utilizza un tessuto con proteine fluorescenti, il campione può essere esposto alla luce durante la procedura di compensazione.
9. Spostare l'emi-madibola nel tubo ECi. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e posizionarlo sul rocker su un ambiente delicato per un minimo di 12 ore.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione disidratato può essere conservato in ECi a temperatura ambiente. Il punto di congelamento o fusione di ECi è da 6,5 a 8,0 °C. Non conservare a 4 °C.
10. L'emi-madibola è pronta per l'imaging con microscopio a fluorescenza.
    NOTA: Durante l'imaging, il campione deve essere immerso nell'ICE per rimanere otticamente trasparente.

Risultati

Questo articolo presenta un metodo per produrre OTM e due metodi per l'imaging 3D di fibre di collagene all'interno del PDL senza alcuna sezione. Ai fini della ricerca animale, quando l'allineamento dei denti non è necessario, un movimento del dente è considerato ortodontico se genera rimodellamento dell'osso alveolare a tutti i livelli delle radici. È necessario un livello di forza costante applicato sui denti per generare un OTM affidabile. Qui, una bobina NiTi a memoria di forma attivata viene utilizzata per genera...

Discussione

La generazione di OTM nei topi è altamente desiderata a causa delle dimensioni, della genetica e dei vantaggi di gestione. L'uso della mattiere fornisce una facile manipolazione sia in termini di dissezione tissutale che di preparazione e imaging del campione. Qui abbiamo presentato un metodo per generare OTM con movimento trascizionale del dente all'interno dell'osso entro 7 giorni da OTM. Utilizzando questo protocollo, la durata complessiva del movimento del dente può essere estesa, poiché la bobina attivata fornisc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2