Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Riepilogo

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Abstract

Le cellule sono continuamente esposte a vari agenti dannosi per il DNA, inducendo diverse risposte cellulari. L'applicazione di approcci biochimici e genetici è essenziale per rivelare eventi cellulari associati al reclutamento e all'assemblaggio di complessi di riparazione del DNA nel sito di danni al DNA. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi potenti strumenti per indurre danni al DNA specifici del sito. Inoltre, le nuove tecniche seminali ci permettono di studiare questi processi a livello di risoluzione a cella singola utilizzando cellule fisse e viventi. Sebbene queste tecniche siano state utilizzate per studiare vari processi biologici, qui presentiamo i protocolli più utilizzati nel campo della riparazione del DNA, dell'immunosomodulazione della fluorescenza (IF) e dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che in combinazione con danni al DNA site-specific basati sull'endonucleasi rendono possibile visualizzare e quantificare l'occupazione genomica dei fattori di riparazione del DNA in modo diretto e regolamentato, rispettivamente. Queste tecniche forniscono potenti strumenti per i ricercatori per identificare nuove proteine legate al locus genomico danneggiato e le loro modifiche post-tras traslazione necessarie per la loro regolazione accurata durante la riparazione del DNA.

Introduzione

Il nostro genoma è costantemente sfidato da vari agenti dannosi per il DNA. Questi assalti possono derivare da fonti ambientali, come la luce UV o l'irradiazione, nonché da fonti endogene, come i prodotti chimici metabolici causati da stress ossidativo o errori di^{replicazione 1,2}. Queste lesioni possono influenzare l'integrità di uno o entrambi i filamenti di DNA e, se gli errori generati diventano persistenti, spesso porta a traslocazioni e instabilità del genoma, che possono causare tumorigenesi^3,4. Per mantenere l'integrità del genoma, sono stati sviluppati più sistemi di riparazione durante l'evoluzione. In base alle proprietà chimiche e fisiche di specifici tipi di danni al DNA, è possibile attivare più meccanismi di riparazione. Disallineamenti, siti di base, rotture a singolo filamento e 8-ossoguanina (8-ossoG) possono essere rimossi sia per riparazione disallineamento che per via di riparazione dell'escissione di base^5,6. Le lesioni causate da fotoprodotti indotti dai raggi UV e da addotti ingombranti possono essere riparate sia mediante riparazione nucleotidiche-escissione (NER) che con il processo di riparazione della rottura a doppio filamento del DNA (DSBR)^7,8. Il NER è costituito da due sotto pathway principali: NER accoppiato alla trascrizione (TC-NER) e NER genomico globale (GG-NER). Per quanto riguarda la fase del ciclo cellulare, a seguito dell'induzione della rottura del doppio filamento del DNA, possono essere attivate due sottopercorsi: l'unione finale non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR)^1,9. NHEJ, che è la via dominante nelle cellule a riposo, può essere attivato in tutte le fasi del ciclo cellulare, rappresentando una via più veloce ma soggetta a errori¹⁰. D'altra parte, l'HR è un percorso privo di errori, in cui i DSB vengono riparati in base alla ricerca sequenza-omologia dei cromatidi sorelle, quindi è presente principalmente nelle fasi del ciclo cellulare S e G2¹¹. Inoltre, l'unione finale mediata dalla microomologia (MMEJ) è un altro meccanismo di riparazione DSB, distinto da quelli sopra menzionati, basato su un modo indipendente da KU70/80 e RAD51 di ri-legatura di sequenze microomologhe precedentemente resettate che fiancheggiano le estremità del DNA rotte. Pertanto, MMEJ è considerato soggetto a errori e altamente mutageno¹². Durante la riparazione del DNA, i DSB possono indurre la risposta al danno al DNA (DDR), che si traduce nell'attivazione di chinasi del checkpoint che interrovono il ciclo^{cellulare durante la riparazione 13,14,15}. Il DDR viene attivato come risposta al reclutamento e all'ampia diffusione di attori chiave iniziatori del processo di riparazione intorno alle lesioni, contribuendo alla formazione di un focus di riparazione. In questa prima cascata di segnalazione, la chinasi ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) gioca un ruolo fondamentale analizzando la fosforilazione della variante istonica H2AX a Ser139 (indicata come γH2AX) intorno alla lesione¹⁶. Questo primo evento è responsabile dell'assunzione di ulteriori fattori di riparazione e dell'avvio dei processi di riparazione a valle. Sebbene l'esatta funzione delle proteine reclutate al centro di riparazione non sia stata ancora completamente caratterizzata, la formazione e la dinamica dei focolai di riparazione sono state studiate da diversi laboratori. Questi marcatori sono ampiamente utilizzati per seguire la cinetica di riparazione, ma il loro ruolo preciso durante il processo di riparazione rimane sfuggente. A causa della grande importanza ma scarsa comprensione dei processi cellulari legati alla riparazione del DNA, sono stati sviluppati diversi metodi finora per indurre e visualizzare il DDR.

Sono stati stabiliti vari metodi e sistemi per indurre il tipo desiderato di danno al DNA. Ad esempio, alcuni agenti [come la neocarzinostatina (NCS), la fleomicina, la bleomicina, l'irradiazione γ, UV] può indurre un gran numero di rotture casuali del DNA in posizioni genomiche non predittive, mentre altre (endonucleasi, come AsiSI, I-PpoI o I-SceI, così come lo striping laser) possono indurre rotture di DNA a loci genomici^{noti 17,18,19,20,21}. Qui, ci concentriamo sulle tecniche a base di endonucleasi attualmente utilizzate per studiare il DDR nelle cellule di mammiferi e lieviti. Oltre a sottolineare i principi di queste tecniche, sottolineiamo sia i loro vantaggi che svantaggi.

Protocollo

1. Immunodetezione di proteine specifiche

1. Preparazione della coltura cellulare e configurazione sperimentale
   1. Mantenere le cellule U2OS in monostrati in mezzo di coltura DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello, 2 mM di glutammina e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
      NOTA: Per l'induzione di danni al DNA a base di endonucleasi, utilizzare un mezzo trattato con carbone o privo di steroidi per evitare perdite di sistema.
   2. Far crescere le cellule in un ambiente umidificato 5% CO₂ a 37 °C fino all'80% di confluenza, rinnovando il mezzo ogni 2-3 giorni.
   3. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 1x PBS. Staccare le celle con la soluzione Trypsin-EDTA. Quando le cellule si staccano, interrompere l'attività della tripina aggiungendo un mezzo di coltura alle celle, producendo una sospensione cellulare.
   4. Contare le celle utilizzando una camera di conteggio delle celle. Piastra 2 x 10⁴ celle/mL/pozzo su una piastra da 24 pozza, con copripasci rotondi sterili da 12 mm in ogni pozzo.
   5. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ per consentire l'attacco sui copripasci.
   6. Trattare le cellule con 10 ng/mL di neocarzinostatina (NCS) tubazionando direttamente l'agente dannoso sul mezzo coltivato. Incubare le cellule con il mezzo contenente NCS per 15 minuti, quindi lavarle con 1x PBS e aggiungere alle cellule un mezzo di coltura fresco e integrato. In caso contrario, utilizzare un agente appropriato (ad esempio 4-OHT) per indurre i DSB tramite sistemi basati sull'endonucleasi senza aggiornare^{il mezzo 22}.
      NOTA: In alternativa, utilizzare l'irradiazione per indurre danni al DNA, che vanno da 30 minuti a 8 ore di tempo di recupero utilizzando il flusso neutronico tra 2-20 Gy²³.
   7. Incubare le cellule per 1-8 ore a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ per seguire la cinetica della riparazione del DNA.
2. Fissazione delle celle
   NOTA: 300-500 μL di soluzioni/pozzo devono essere utilizzati nei seguenti passaggi (passaggi 1.2-1.5) per coprire adeguatamente tutte le cellule. Ogni fase di incubazione e lavaggio (ad eccezione dell'incubazione dell'anticorpo) deve essere eseguita su uno shaker orbitale con delicata agitazione.
   1. Dopo l'induzione e l'incubazione di cellule DSB, rimuovere il mezzo dalle cellule attaccate e lavare le cellule una volta con 1x PBS.
   2. Fissare le celle con soluzione di formaldeide-PBS al 4% per 20 min a 25 °C.
3. Permeabilizzazione delle cellule
   1. Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare le celle tre volte con 1 PBS per 5 minuti ciascuna.
   2. Rimuovere il PBS e aggiungere lo 0,2% di Tritone X-100 sciolto in PBS. Incubare i campioni per 20 minuti.
4. Blocco di siti di binding non specifici
   1. Lavare le cellule tre volte con 1x PBS.
   2. Bloccare siti di legame non specifici con 5% di BSA (bovine serum fraction V albumina) diluiti in PBST (1x PBS integrato con 0,1% Tween-20) e incubare i campioni permeabilizzati per almeno 20 minuti.
5. Colorazione ad immunofluorescenza
   1. Aggiungere la quantità corretta di anticorpo primario (cioè anti-γH2AX, anti-DNA-PKcs) diluito in soluzione BSA-PBST all'1%. Posizionare ogni coverlip capovolto su un film di paraffina su una goccia da 10 μL dell'anticorpo anti-γH2AX diluito.
      NOTA: In caso di co-immunostaining diluire in modo appropriato entrambi gli anticorpi nella stessa soluzione BSA-PBST all'1%.
   2. Incubare i campioni in una camera di umidità per 1,5 ore a 4 °C.
      NOTA: L'incubazione può essere eseguita anche a 4 °C durante la notte.
   3. Posizionare i copripavimenti di nuovo essendo laterali nella piastra a 24 pozzi e lavare tre volte per 5 minuti con 1x PBS.
   4. Aggiungere la quantità corretta di anticorpo secondario diluito in 1% BSA-PBST. Posizionare ogni coverlip capovolto su un film di paraffina su una goccia da 10 μL dell'anticorpo diluito.
   5. Incubare i campioni in una camera di umidità a 4 °C per 1 h.
   6. Posizionare i copripavimenti di nuovo essendo laterali nella piastra a 24 pozzi e lavare tre volte per 5 minuti con 1x PBS.
   7. Prima di rimuovere l'ultima soluzione di lavaggio PBS, esettare delicatamente i copripavimenti utilizzando una pinzetta e un ago e quindi posizionarli capovolti su vetrini con goccioline di mezzo di montaggio (integrato con DAPI).
      NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria. Quando il mezzo di montaggio si asciuga, si consiglia di sigillare i bordi dei copripavimenti con smalto per unghie per evitare lo avvizzimento dei campioni.

2. Immunoprecipitazione della cromatina

1. Raccolta cellulare, reti incrociate,lisi cellulare e nucleare e frammentazione del DNA
   1. Coltura circa 5 x 10⁶ celle/mL in un piatto da 150 mm per ogni campione.
   2. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con 1x PBS ghiacciato.
   3. Fissare le cellule con una soluzione di formaldeide-PBS all'1%, posizionare le piastre su uno shaker orbitale e agitare delicatamente per 20 minuti.
      NOTA: La formaldeide è volatile; preparare sempre una nuova soluzione di lavoro. In alcuni casi, la soluzione di formaldeide contiene metanolo per stabilizzarlo, ma è meglio usare una soluzione priva di metanolo per evitare interferenze con reazioni a valle.
   4. Interrompere la fissazione con glicina da 125 mM e incubare su uno shaker orbitale con agitazione delicata per 5 minuti a 25 °C.
   5. Posizionare i piatti sul ghiaccio e lavare due volte con 1x PBS ghiacciato.
   6. Raschiare le cellule in 1x PBS ghiacciato e trasferirle in tubi conici da 15 ml.
   7. Centrifugare le cellule a 2.500 x g per 5 min a 4 °C.
   8. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet in 2 mL di tampone di lisi cellulare [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC (cocktail inibitore della proteasi)] e incubare sul ghiaccio per 10 min.
   9. Centrifugare la sospensione cellulare a 2.500 x g per 5 min a 4 °C.
   10. Scartare con cura il supernatante e rimescolare il pellet in 500-1.500 μL di tampone di lisi nucleare (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.8% SDS, 1x PIC) e incubare sul ghiaccio per 30-60 min. Trasferire il llysate in un tubo conico in polistirolo adatto alla sonicazione.
       NOTA: Poiché il tampone di lisi nucleare contiene SDS, precipiterà sul ghiaccio e la soluzione diventerà bianca. La soluzione dovrebbe diventare trasparente dopo la sonicazione.
   11. Sonicare il lysate per tagliare il DNA ad una dimensione media del frammento di 300-1.000 bp.
       NOTA: I cicli e le condizioni di sonicazione appropriati devono essere impostati in base al tipo di cella e all'apparecchiatura di sonicazione. Frammenti di dimensioni inferiori a 200 bp non sono adatti per il ChIP, perché le interazioni nucleosoma-DNA possono essere interrotte.
2. Inversione del crosslinking, determinazione delle dimensioni dei frammenti sonicati
   1. Eseminare 100 μL del campione sonicato per verificare la dimensione del frammento della cromatina sonicata. La cromatina rimanente deve essere conservata a −80 °C.
   2. Aggiungere 0,5 mg/mL di RNasi A a ciascuno 100 μL del campione e incubarli a 37 °C per 20 minuti per attivare la RNasi.
   3. Incubare i campioni a 65 °C durante la notte.
   4. Il giorno successivo, aggiungere 500 μg/mL di Proteinasi K e 0,5% di SDS e incubare i campioni a 50 °C per 3 h.
   5. Aggiungere 0,5 volume di fenolo e 0,5 volume di miscela cloroformio-isoammil alcol (24:1) a ciascun campione.
   6. Vortice per 1 min.
   7. Centrifuga a 13.000 x g per 10 min.
   8. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo di microcentrifugo.
   9. Aggiungere 1 volume di miscela cloroformio-isoamile alcol (24:1) a ciascun campione.
   10. Vortice per 1 min.
   11. Centrifuga a 13.000 x g per 10 min.
   12. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo di microcentrifugo.
   13. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 96% e 0,1 volume di 3 M Na-Acetato pH 5.2.
   14. Incubare per almeno 20 min a −80 °C.
   15. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 min a 4 °C.
   16. Rimuovere l'etanolo e lavare il pellet con 400 μL di 70% di etanolo.
   17. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 min a 4 °C.
   18. Rimuovere l'etanolo e asciugare all'aria il pellet.
   19. Resuspend il pellet in 10 μL di TE.
   20. Eseguire i campioni su un gel di agarosio allo 0,8%. La dimensione della cromatina sonicata dovrebbe essere di circa 500 bp.
       NOTA: Utilizzare il tampone di carico privo di bromofenolo blu perché la dimensione di questo colorante è di circa 500 bp, il che può disturbare il corretto rilevamento dei frammenti di cromatina. Si consiglia invece di utilizzare il buffer di carico integrato con xilene-cianole, che è di circa 3.000 bp.
   21. Se la dimensione della cromatina è accettabile, diluire i campioni di cromatina congelati dal passaggio 2.1. in 3 volumi di tampone di diluizione (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) e mescolare i campioni tramite rotazione per 10 min a 4 °C.
       NOTA: Questo passaggio è necessario per diluire l'SDS presente nel tampone di lysis nucleare per evitare interferenze con le reazioni a valle, compresa la misurazione della concentrazione di cromatina.
   22. Misurare la concentrazione di DNA dei campioni di cromatina a 260/280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
3. Preparazione di perline, pre-sgombero e immunoprecipitazione
   1. Preparare perline (ovina anti-coniglio o topo IgG) per le fasi di pre-sgombero e immunoprecipitazione. Lavare le perline due volte per 10 min a 4 °C con tampone RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl e 1X PIC).
   2. Rimorsiva le perline nello stesso volume del buffer RIPA del passaggio 2.3.1.
   3. Cromatina pre-chiara da 25-30 μg di ciascun campione con 4 μL delle perline tramite rotazione per 1-2 h a 4 °C.
      NOTA: Aggiungere il buffer RIPA a ogni campione di cromatina fino a 500 μL di volume finale per lasciare che i campioni si mescolano correttamente sotto rotazione. Non dimenticare di eseminare la cromatina per NAC (No Antibody Control) e TIC (Total Input Control) nel caso di ogni set di campioni. I TEC richiedono solo un volume finale fino a 200 μL.
   4. Precipitare le perline con un magnete e trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo.
   5. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo a ciascun campione di cromatina (ad eccezione di NAC e TIC) e ruotare durante la notte a 4 °C.
   6. Il giorno successivo, aggiungere 40 μL di perline lavate a ciascun campione (ad eccezione del TIC) e incubarle durante la notte, ruotando a 4 °C.
4. Lavaggio
   1. Lavare una volta con 300 μL di tampone a basso contenuto di sale (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) per 10 min tramite rotazione a 4 °C.
   2. Lavare una volta con 300 μL di tampone ad alto sale (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) per 10 min tramite rotazione a 4 °C.
   3. Lavare una volta con 300 μL di tampone LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) per 10 min tramite rotazione a 4 °C.
   4. Lavare due volte con 300 μL di TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) per 10 min tramite rotazione, per il primo lavaggio a 4 °C e il secondo lavaggio a 25 °C.
5. Eluizione
   1. Aggiungere 200 μL del tampone di eluizione (1% SDS e 100 mM NaHCO₃) alle perline e incubare a 65 °C in un termo-shaker per 15 minuti con scuotimento continuo (circa 400 RPM). Trasferire nuovamente il supernatante su un nuovo tubo ed elute perline in 200 μL di tampone di eluizione. Unire gli eluati (volume finale di 400 μL).
   2. Aggiungere nacl a una concentrazione finale di 200 mM in ogni campione. Integrare i campioni TIC con 200 μL di tampone di eluizione e aggiungere anche nacl.
      NOTA: Da questo passaggio, il TIC deve essere maneggiato nelle stesse condizioni degli altri campioni.
   3. Incubare i campioni a 65 °C (senza tremare) per almeno 6 ore.
   4. Aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 100% a ciascun campione, ruotare i tubi due volte per mescolare e precipitare il DNA durante la notte a -80 °C.
   5. Il giorno dopo, centrifuga per 30 min a 13.000 x g a 4 °C.
   6. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 70% EtOH.
   7. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 min a 4 °C.
   8. Scartare il supernatante e asciugare all'aria i pellet.
   9. Resuspendare il pellet in 100 μL di TE e aggiungere 0,5 mg/mL di RNasi A a ciascun campione. Incubare a 37 °C per 20 minuti per attivare la RNasi.
6. Inversione del crosslinking
   1. Aggiungere 500 μg/mL di Proteinasi K e 0,5% di SDS, quindi incubare i campioni a 50 °C per 2 ore.
      NOTA: Se si procede verso chIP-seq, evitare l'estrazione fenolo-cloroformio, in quanto inibisce il processo NGS a valle. Si consiglia invece di utilizzare un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
   2. Aggiungere 0,5 volume di fenolo e 0,5 volume di miscela cloroformio-isoammil alcol (24:1) a ciascun campione.
   3. Vortice per 1 min.
   4. Centrifuga a 13.000 x g per 10 min.
   5. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo di microcentrifugo.
   6. Aggiungere 1 volume di miscela cloroformio-isoammil alcol (24:1) a ciascun campione.
   7. Vortice per 1 min.
   8. Centrifuga a 13.000 x g per 10 min.
   9. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo di microcentrifugo.
7. Estrazione del DNA
   1. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 96% e 0,1 volume di 3 M Na-Acetato pH 5.2.
   2. Incubare per almeno 20 min a −80 °C.
   3. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 min a 4 °C.
   4. Rimuovere l'etanolo e lavare il pellet con 400 μL di 70% di etanolo.
   5. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 min a 4 °C.
   6. Rimuovere l'etanolo e asciugare all'aria il pellet.
   7. Resuspend il pellet in 50 μL di TE.

Risultati

Lo studio dei processi di riparazione indotti dal DSB diretti in loco nelle cellule può essere ottenuto tramite trasfezione stabile o transitoria. Tuttavia, va notato che la trasfezione stabile garantisce una popolazione cellulare omogenea, che fornisce una risposta cellulare unificata e quindi più affidabile. Nel caso della transitoria transitoria, solo una piccola parte della popolazione cellulare occupa e mantiene il plasmide, che introduce la diversità nell'esperimento. La creazione di sistemi cellulari basati sul...

Discussione

Sebbene la riparazione del DNA sia un campo di ricerca relativamente recente, le nostre conoscenze si stanno rapidamente espandendo con l'aiuto di vari metodi biochimici e microscopici. Preservare le informazioni genetiche è fondamentale per le cellule poiché le mutazioni che si verificano nei geni coinvolti nei processi di riparazione sono tra le principali cause di tumorigenesi e quindi è essenziale chiarire le fasi chiave delle vie di riparazione del DNA.

Le tecniche biochimiche (ad esem...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody	Abcam	ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine	Lonza	12-707F
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Ethanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved	Gibco	ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Isoamyl alcohol	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbate 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054