Impalcatura composita collagene-chitosano caricata di doxiciclina per la guarigione accelerata delle ferite diabetiche

Riepilogo

L'impalcatura DOX-CL preparata soddisfaceva i prerequisiti di una medicazione DW ideale in resistenza meccanica, porosità, assorbimento dell'acqua, tasso di degradazione, rilascio prolungato, proprietà antibatteriche, biocompatibilità e antinfiammatorie, che sono considerate essenziali per il recupero del tessuto danneggiato nei DW.

Abstract

Una delle principali complicanze del diabete mellito sono le ferite diabetiche (DW). La fase prolungata dell'infiammazione del diabete ostruisce le ulteriori fasi di una lesione che porta a una guarigione ritardata delle ferite. Abbiamo selezionato la doxciclina (DOX), come potenziale farmaco preferito, grazie alle sue proprietà antibatteriche insieme alle sue proprietà antinfiammatorie riportate. L'attuale studio mira a formulare impalcature dox caricate collagene-chitosano non retiche (NCL) e retille (CL) e valutare la loro capacità curativa in condizioni diabetiche. Il risultato della caratterizzazione delle impalcature rivela che l'impalcatura DOX-CL ha una porosità ideale, un basso tasso di gonfiore e degradazione e un rilascio prolungato di DOX rispetto all'impalcatura DOX-NCL. Gli studi in vitro rivelano che l'impalcatura DOX-CL era biocompatibile e ha migliorato la crescita cellulare rispetto ai gruppi di impalcatura e controllo CL. Gli studi antibatterici hanno dimostrato che l'impalcatura DOX-CL era più efficace dell'impalcatura CL contro i batteri più comuni trovati in DW. Utilizzando il modello di DW indotto dalla dieta streptozotocina e ad alto contenuto di grassi, è stato osservato un tasso significativamente (p≤0,05) più veloce di contrazione della ferita nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL rispetto a quelli nei gruppi di impalcatura e controllo CL. L'uso dell'impalcatura DOX-CL può rivelarsi un approccio promettente per il trattamento locale per le DW.

Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una condizione in cui l'incapacità del corpo di fornire insulina o reagire ai suoi esiti nella digestione anomala di zuccheri semplici porta a un aumento della glicemia ¹. L'intreccio più consecutivo e schiacciante del DM è la ferita diabetica (DW). Circa il 25% dei pazienti con DM ha l'opportunità di costruire un DW nella loro vita ¹. La guarigione ostacolata della DW è accreditata a una triopatia di DM: immunopatia, vasculopatia e neuropatia. Ogni volta che la DW non viene trattata, può provocare lo sviluppo della cancrena, provocando quindi la rimozione dell'organo ^{interessato 2}.

Molti trattamenti, come istruire i pazienti (ispezionare la ferita ogni giorno, pulire la ferita, evitare attività che creano pressione sulla ferita, monitoraggio periodico del glucosio, ecc.), controllare la glicemia, debridement delle ferite, scarico della pressione, procedura medica, ossigenoterapia iperbarica e terapie avanzate sono in pratica ^3,4. La maggior parte di questi farmaci non affronta tutti i prerequisiti vitali per la cura della DW alla luce delle condizioni patofisiotiche multifattoriali e delle spese impreviste relative a questi ^{farmaci 5}. Anche se la patogenesi DW è multifattoriale, l'infiammazione persistente con gestione inappropriata dei tessuti è dichiarata come la vera ragione della guarigione ritardata in DWs ^5,6.

I livelli aumentati di mediatori infiammatori e pro-infiammatori in DW si traducono in una diminuzione dei fattori di crescita responsabili della guarigione ritardata ^{delle ferite 2,6}. La formazione impropria di matrice extracellulare (ECM) nelle DW è accreditata per l'aumento dei livelli di metalloproteinasi matriciali (MMP) responsabili della rapida degradazione dell'ECM formato. Negli MMP, MMP-9 è segnalato come uno dei principali intermediari responsabili dell'infiammazione prolungata e della rapida degradazione dell'ECM ⁷. Si afferma che il trattamento locale con un farmaco antinfiammatorio che diminuisce i livelli elevati di MMP-9 rieche stabilisce l'omeostasi cutanea, la disposizione del quadro e richiede una migliore guarigione dei DWs ^8,9.

La doxiciclina (DOX), un inibitore dell'MMP-9, è stata scelta per sopprimere i livelli elevati di MMP-9, un importante mediatore infiammatorio responsabile dell'infiammazione persistente in DWs ^10,11,12. Inoltre, dox possiede antiossidanti (producono radicali idrossi e fenossidici liberi in grado di legarsi con specie ^{reattive dell'ossigeno) 13} e anti-apoptotico (inibire l'espressione della caspasi e la stabilizzazione mitocondriale) ¹⁴ attività essenziali per il trattamento della DW. È stata scelta la disposizione di quadri contenenti DOX, collagene (COL) e chitosano (CS). La scelta del COL dipende dal modo in cui aiuta a fornire il quadro necessario responsabile della resistenza meccanica e della rigenerazione tissutale ¹⁵. D'altra parte, CS è strutturalmente omologo al glicosaminoglicano, associato a diverse fasi di guarigione delle ferite. È anche riportato che CS detiene una significativa proprietà antibatterica ¹⁵. Pertanto, l'impalcatura COL / CS di DOX è formulata per sopprimere l'infiammazione prolungata, seguita dal supporto della formazione della matrice per una guarigione efficace delle ferite in condizioni di DM.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali eseguite sono state approvate dal comitato etico istituzionale per gli animali del JSS College of Pharmacy, Ooty, India.

1. Preparazione di impalcature porose caricate con DOX con metodo di liofilizzazione

1. Aggiungere 1,2 g di COL a 100 mL di acqua (ad esempio Millipore) e tenere da parte per il gonfiore.
2. Mescolare la dispersione gonfia del COL a 2000 giri/min durante la notte per garantire la completa dissoluzione del COL.
3. Preparare la soluzione CS sciogliendo circa 0,8 g di CS in 100 mL di acido acetico all'1%.
4. Mescolare la soluzione CS durante la notte a 2000 giri/min per garantire una dispersione uniforme.
5. Mescolare DOX (1% w/v), seguito dalla soluzione CS, alla soluzione COL e mescolare per 30 min.
6. Filtrare la miscela fisica ottenuta utilizzando un panno di mussola per rimuovere il particolato.
7. Congelare in profondità il filtrato ottenuto a -85 °C ± 4 °C per circa 24 ore.
8. Liofilizzare la miscela di congelamento profondo a -85 °C ± 4 °C per 72 h.
9. Conservare le impalcature ottenute in un essiccatore per ulteriori ^{analisi 16,17}.

2. Collegamento incrociato di impalcature

1. Sciogliere mes (0,488 g) in 50 mL di acqua.
2. Immergere 50 mg dell'impalcatura caricata dox in 20 mL del tampone MES per 30 minuti.
3. Mescolare 19,5 mL di buffer MES con 0,1264 g di EDC e 0,014 g di NHS in un becher separato.
4. Immergere l'impalcatura nella miscela tampone per 4 ore per ottenere il crosslinking ¹⁶.
5. Conservare le impalcature a reti incrociate (CL) e non retiche DOX (NCL) per un'ulteriore valutazione.

3. Caratterizzazione delle impalcature

1. Esame morfologico mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)
   1. Caratterizzare le impalcature per l'analisi morfologica utilizzando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
   2. Macchiare la sezione trasversale e la superficie esterna dell'impalcatura con il delicato strato d'oro (~ 150 Å).
   3. Cattura l'immagine fotografica alla tensione di eccitazione di 5 kV e 10 kV.
   4. Posizionare i campioni in stub di alluminio e racchiuderli con l'oro a circa 9 V.
   5. Misurare l'impalcatura utilizzando SEM con una risoluzione aumentata a 10 kV.
2. Determinazione della porosità
   1. Misurare la porosità delle impalcature utilizzando il metodo di spostamento del liquido (etanolo) ¹⁸.
   2. Calcolare la porosità delle impalcature utilizzando le formule seguenti.
      
      W_w = Peso umido dell'impalcatura
      W_d = Peso secco dell'impalcatura
      W_v = Volume dell'impalcatura
3. Determinazione della capacità di assorbimento dell'acqua
   1. Misurare il peso secco dell'impalcatura.
   2. Incubare l'impalcatura pesata a 37 °C per 24 ore in tampone fosfato saline (PBS) pH 7.4.
   3. Rimuovere il PBS in eccesso sull'impalcatura utilizzando carta da filtro.
   4. Misurare la capacità di assorbimento dell'acqua utilizzando le formule ^{seguenti 17}.
      
      W_S = Percentuale di assorbimento d'acqua
      W₁=Peso umido dell'impalcatura
      W₀= Peso secco dell'impalcatura
4. Degradazione dell'impalcatura
   1. Incubare l'impalcatura (1 cm x 1 cm) a 37 °C per 7 giorni in un PBS di pH 7.4 contenente lisozima.
   2. Lavare l'impalcatura per rimuovere eventuali ioni aderenti sulla superficie.
   3. Congelare asciugare l'impalcatura ^{lavata 17}.
   4. Calcolare la velocità di degradazione utilizzando le formule.
      
      Ww = Peso iniziale dell'impalcatura
      Wd = Peso dell'impalcatura dopo la liofilizzazione
5. Studi sul rilascio in vitro
   1. Determinare il comportamento di rilascio del DOX dall'impalcatura utilizzando il metodo del sacco dialisi.
   2. Disperdere l'impalcatura in alcuni millilitri di liquido avvolto simulato (pH 7.4) e trasferirla in un sacchetto di dialisi.
   3. Chiudere saldamente le estremità del sacchetto a membrana e immergersi nei 500 mL della soluzione di fluido avvolto simulato.
   4. Mescolare la soluzione di fluido avvolto contenente il sacchetto di dialisi a 200-250 giri/min.
   5. Raccogliere la soluzione supernatante e sostituirla con una quantità uguale di soluzione tampone fresco a intervalli di tempo definiti.
   6. Determinare la percentuale di rilascio DOX dalle impalcature nella soluzione supernatante utilizzando uno spettrometro visibile ai raggi UV a 240 nm.

4. Studi antibatterici in vitro

1. Determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) delle impalcature CL e DOX-CL contro il S. aureus, S. epidermide, E. coli, P. aeruginosa utilizzando il metodo di diluizione del micro-brodo.
2. Preparare le colture batteriche usando brodo di Mueller-Hinton con un rapporto di 1:1000 per ottenere 0,5 torbidità McFarland.
3. Aggiungere D-glucosio (800 mg/dL) alle colture batteriche per l'iperglicazione ^19,20.
4. Tritare e solubilizzare cl e DOX-CL in DMSO (controllo negativo).
5. Diluire in serie la sospensione batterica iperglicata (100 μL) e i campioni di prova (100 μL di soluzione di impalcature) in 96 piastre di pozzo.
6. Incubare la piastra a 37 °C per 20-24 ore.
7. Registrare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 600 nm ²¹.

5. Studi di biocompatibilità in vitro

1. Valutate la biocompatibilità delle impalcature preparate utilizzando il saggio MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazolo-2 yl) -2, 5-difenil tetrazolo bromuro)]
2. Sterilizzare le impalcature di dimensioni standard e posizionarle in 24 piastre di pozzo.
3. Aggiungere 3T3-L1 cellule alla piastra del pozzo 24 e incubare per 72 ore.

6. Studi sugli animali in vivo

1. Induzione di DM e ferita da escissione
   1. Nutrire l'animale con una dieta ricca di grassi per due settimane e somministrare una singola dose di streptozotocina (STZ) (50 mg/kg di peso corporeo) in soluzione tampone di citrato intraperitonealmente ai ratti albini Wistar (180-200 g) per l'induzione del diabete di tipo 2.
   2. Scegli gli animali con una glicemia costante di 250 mg / dL per lo studio.
   3. Randomizzare gli animali selezionati per l'induzione delle ferite da escissione.
   4. Anestetizzare i ratti diabetici usando etere dietile (5 mL sono stati aggiunti alla camera di anestesia precedentemente satura) e confermare l'uso del metodo del dito del piede e del colore della mucosa.
   5. Radere l'area dorsale (toracico dorsale, regione lombare) usando un trimmer asettico e lame (A40).
   6. Sterilizzare l'area rasata con un tampone alcolico.
   7. Asportare la pelle (2 x 2 cm² e una profondità di 1 mm) con una lama chirurgica asettica A40 sulla zona rasata per creare una ferita aperta.
   8. Dividere gli animali in tre gruppi (Gruppo 1- Controllo malattie (Controllo), Ponteggio Gruppo 2- CL (Placebo), Gruppo 3- PONTE CL DOX), ogni gruppo composto da 6 ratti.
   9. Apporre le impalcature CL e DOX CL utilizzando nastro chirurgico e coprire il gruppo di controllo con garza sterile per 21 giorni.
   10. Tracciare l'area della ferita su un foglio OHP sterile e misurare la riduzione percentuale della ferita utilizzando il metodo della griglia nei giorni 0, 7, 14 e 21 per tutti i gruppi.
   11. Calcola la percentuale di riduzione della ferita usando le formule seguenti.
       

7. Studi istopatologici

1. Isolare l'area ferita guarita nei giorni 7, 14 e 21, conservare in soluzione di formalina (10%).
2. Se sezionere i tessuti utilizzando un microtomo per ottenere uno spessore di 6 μm.
3. Montare le sezioni su uno scivolo di vetro e macchia utilizzando ematossilina ed eosina ¹⁷.
4. Cattura le immagini con ingrandimento 40x utilizzando un microscopio digitale.

8. Stima dell'idrossiprolina

1. Isolare l'area ferita guarita nei giorni 0, 7, 14 e 21 per la valutazione.
2. Stimare il contenuto di idrossiprolina secondo la procedura descritta da Reddy G et al., 1996 ²².

9. Test di Elisa

1. Stimare i livelli MMP-9 utilizzando il kit Elisa secondo le istruzioni del produttore.
2. Isolare i campioni di tessuto dall'area della ferita guarita il giorno 21 e tritare utilizzando un omogeneizzatore tissutale.
3. Centrifugare l'omogeneato ottenuto e raccogliere il supernatante.
4. Diluire il supernatante a 100 volte utilizzando il tampone di dosaggio.
5. Scansionare la piastra utilizzando un lettore di lastre multiple.

10. Analisi statistica

1. Rappresentare i risultati ottenuti come SD ± media.
2. Eseguire l'analisi statistica utilizzando il prisma del pad Graph v5.01.
3. Raggiungi la significatività statistica usando l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) e il test post hoc di Dunnet.
4. Considerare significativi i valori con p≤0.05.

Risultati

Caratterizzazione dell'impalcatura NCL e CL caricata da DOX
All'esame visivo, l'impalcatura NCL e CL è stata trovata di colore crema. Inoltre, entrambe le impalcature sembrano essere come una spugna, rigida e anelastica se esaminate fisicamente. Le immagini SEM delle impalcature NCL e CL sono mostrate nella figura 1. Dalla figura, era chiaro che c'era una diminuzione delle dimensioni dei pori dopo il collegamento incrociato formando collegamenti intermolecolari. Inoltre,...

Discussione

L'obiettivo principale di questo studio era determinare l'effetto dell'impalcatura COL-CS caricata da DOX sulla guarigione della DW nei ratti. CL e NCL sono stati preparati e valutati in termini di morfologia, indice di gonfiore, cinetica di rilascio in vitro e biocompatibilità.

Caratterizzazione dell'impalcatura NCL e CL caricata da DOX
Le impalcature preparate sono state trovate porose con pori interconnessi. Questi pori interconnessi assicurano la natura porosa e spugno...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu