Gonfiaggio dell'aria dei polmoni murini con perfusione-fissazione vascolare

Riepilogo

Viene presentato un metodo per il gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare dei polmoni che preserva la posizione delle cellule all'interno delle vie aeree, degli alveoli e dell'interstizio per le analisi struttura-funzione. La pressione costante delle vie aeree viene mantenuta con una camera di gonfiaggio dell'aria mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro. I polmoni vengono elaborati per studi istologici.

Abstract

L'istologia polmonare viene spesso utilizzata per studiare i contributi forniti dalle cellule dello spazio aereo durante l'omeostasi polmonare e la patogenesi della malattia. Tuttavia, i metodi di fissazione basati sull'instillazione comunemente usati possono spostare le cellule dello spazio aereo e il muco nelle vie aeree terminali e possono alterare la morfologia dei tessuti. In confronto, le tecniche di perfusione-fissazione vascolare sono superiori nel preservare la posizione e la morfologia delle cellule all'interno degli spazi aerei e del rivestimento della mucosa. Tuttavia, se la pressione positiva delle vie aeree non viene applicata contemporaneamente, le regioni dei polmoni possono collassare e i capillari possono gonfiarsi negli spazi alveolari, portando alla distorsione dell'anatomia polmonare. Qui, descriviamo un metodo economico per l'inflazione dell'aria durante la perfusione-fissazione vascolare per preservare la morfologia e la posizione delle vie aeree e delle cellule alveolari e dell'interstizio nei polmoni murini per gli studi istologici a valle. La pressione costante dell'aria viene erogata ai polmoni attraverso la trachea da una camera sigillata e riempita d'aria che mantiene la pressione attraverso una colonna liquida regolabile mentre il fissativo viene perfuso attraverso il ventricolo destro.

Introduzione

L'istologia polmonare rappresenta il gold standard per la valutazione dell'architettura polmonare durante la salute e la malattia ed è uno degli strumenti più comunemente usati dai ricercatori polmonari¹. Uno degli aspetti più critici di questa tecnica è il corretto isolamento e conservazione del tessuto polmonare, poiché la variabilità in questa fase può portare a una scarsa qualità dei tessuti e risultati^{errati 1,2,3}. Negli animali viventi, il volume polmonare è determinato dall'equilibrio tra il rinculo elastico verso l'interno del polmone e le forze esterne trasmesse dalla parete toracica e dal diaframma dalla tensione superficiale. Di conseguenza, quando si entra nel torace, le forze esterne vengono perse e il polmone collassa. Le sezioni istologiche preparate da polmoni collassati hanno un aspetto affollato e i confini tra i compartimenti anatomici (cioè spazi aerei, vascolarizzazione e interstizio) possono essere difficili da distinguere. Per aggirare questa sfida, i ricercatori spesso gonfiano i polmoni durante la fissazione chimica in modo da mantenere le dimensioni e l'architettura dello spazio aereo.

I polmoni possono essere gonfiati con aria o liquido. La pressione necessaria per gonfiare i polmoni allo stesso volume differisce tra gonfiaggio dell'aria e del liquido a causa delle forze intermolecolari all'interfaccia aria-liquido. Durante il gonfiaggio dell'aria è necessaria una pressione più elevata (ad esempio,₂₅cmH 2 O) rispetto al gonfiaggio del liquido (ad esempio, 12 cmH₂O) per superare la tensione superficiale e aprire gli alveoli collassati⁴. Una volta che gli alveoli sono stati reclutati, una pressione inferiore può mantenere gli alveoli aperti allo stesso volume dei plateau della curva pressione-volume, e le pressioni si equalizzano in tutto il polmone secondo la legge di Pascal^4,5,6,7,8.

Esistono due metodi principali di inflazione e fissazione polmonare per preservare i polmoni murini per l'istologia. Più comunemente, gli spazi aerei sono instillati con liquido - spesso contenente un fissativo. Il vantaggio principale di questo approccio è che è relativamente facile e richiede poca formazione. Mentre l'instillazione intratracheale di fissativo può essere preferita negli studi che si concentrano sulla vascolarizzazione, il liquido che viene instillato attraverso la trachea tende a spingere le cellule prossimali delle vie aeree e le mucina in regioni più distali dello spazio aereo mentre l'inflazione dell'aria non^{1,3,4,9,10,11.} Inoltre, il distacco involontario dei leucociti dall'epitelio durante il gonfiaggio liquido altera la loro morfologia, conferendo loro un aspetto semplice e arrotondato^4,10,11,12. Infine, il gonfiaggio dei polmoni con liquido può involontariamente comprimere l'interstizio^4,10,11. Insieme, questi fattori possono distorcere la normale anatomia e le distribuzioni cellulari all'interno dei polmoni conservati, limitando così la tecnica.

Un metodo alternativo di conservazione dei tessuti è la perfusione-fissazione vascolare. In questo metodo, il fissativo viene perfuso nella vascolarizzazione polmonare attraverso la vena cava o il ventricolo destro. Questo metodo preserva la posizione e la morfologia delle cellule nel lume dello spazio aereo. Tuttavia, a meno che i polmoni non siano gonfiati durante la fissazione della perfusione, è probabile che il tessuto polmonare collassi.

Il gonfiaggio dell'aria con perfusione-fissazione vascolare sfrutta i punti di forza di ciascuna delle tecniche di fissazione di cui sopra. Qui forniamo un protocollo per questa tecnica. I materiali e le attrezzature necessari sono relativamente economici e possono essere facilmente ottenuti e assemblati. La configurazione completata, mostrata nella Figura 1A,fornisce una pressione costante delle vie aeree ai polmoni attraverso una colonna regolabile e piena di liquido, mentre una pompa peristaltica fornisce fissativo attraverso il ventricolo destro. I polmoni con morfologia preservata possono quindi essere ulteriormente elaborati per analisi struttura-funzione.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della National Jewish Health.

NOTA: il protocollo è organizzato in tre componenti. Il primo componente descrive in dettaglio la costruzione del gonfiaggio dell'aria con apparecchiature di perfusione / fissazione. Una seconda sezione descrive come impostare l'attrezzatura per un esperimento. La sezione finale descrive come preparare l'animale ed eseguire l'esperimento.

1. Costruzione dell'apparato a colonna d'acqua (Figura 1B)

1. Rimuovere lo stantuffo da una siringa a punta antiscivolo da 60 mL.
2. Attaccare del nastro attorno alla siringa al segno di 30 ml. Impostare l'altezza della siringa su questo segno per la pressione di gonfiaggio iniziale di 25 cmH₂O. Questo è anche il punto in cui il livello dell'acqua nella colonna dovrebbe essere durante l'intera procedura. Etichettare il nastro come "25 cm" (come illustrato nella Figura 1A)o "inflazione".
   NOTA: una pressione di gonfiaggio di 25 cmH₂O viene utilizzata per garantire il reclutamento di spazi aerei collassati. Una volta reclutati gli alveoli, la pressione viene abbassata a 20 cmH₂O per garantire che gli spazi aerei non siano distesi.
3. Misurare 5 cm dal nastro verso l'estremità dello stantuffo e attaccare un altro pezzo di nastro adesivo alla siringa. Spostare la siringa verso il basso fino a questo segno per abbassare la pressione di gonfiaggio a 20 cmH₂O durante la fissazione. Etichettare il nastro come "20 cm" (come illustrato nella Figura 1A)o "fissazione".
4. Fissare il tubo 180 in polivinilcloruro (PVC) all'estremità della punta antiscivolo della siringa. La lunghezza del tubo dipende dalla distanza tra la siringa e la camera di gonfiaggio dell'aria (circa 25-30 cm).
5. Posizionare un t-shirt maschio in stile Luer (2) (1,219 pollici di lunghezza, 0,904 pollici di altezza, 0,0904 pollici di diametro interno) nell'altra estremità del tubo. Questo Luer maschio si collegherà al rubinetto della camera di gonfiaggio dell'aria (Step 2.4).

2. Costruzione della camera di gonfiaggio dell'aria (Figura 1C)

1. Praticare due fori (circa 4 mm di diametro) in un contenitore di plastica da 500 ml con tappo a vite. I fori dovrebbero avere le stesse dimensioni dei Luers femminili (1.224 pollici di lunghezza, 0.312 pollici di altezza, 0.098 pollici di diametro interno).
   NOTA: i contenitori di supporto o tampone vuoti possono essere utilizzati per la camera di gonfiaggio dell'aria.
2. Rivestire i fili di Luers femmina con produttore di guarnizioni in silicone e posizionare il lato più piccolo nei fori preforati del contenitore.
3. Aggiungere il produttore di guarnizioni in silicone attorno ai Luers femmina dove entrano nel contenitore per garantire una tenuta ermetica.
4. Avvitare un rubinetto uninodo sul Luer femmina inferiore sulla camera di gonfiaggio dell'aria.
5. Tagliare tubi della lunghezza di circa 25 cm e attaccare i Luers maschi alle estremità libere del tubo. Collegare il Luer maschio su un'estremità del tubo al Luer femmina libero sulla camera di gonfiaggio dell'aria. L'altro Luer maschio si collegherà al contenitore per la lavorazione degli animali.

3. Costruzione del contenitore per la lavorazione degli animali (Figura 1D)

1. Praticare un foro (circa 4 mm di diametro) sul lato di un grande contenitore di plastica. Il foro dovrebbe essere il diametro del Luer femmina. Il contenitore di plastica è necessario per catturare la soluzione di fissazione in eccesso.
   NOTA: è stato utilizzato un contenitore di plastica da 30 cm x 22 cm, 3,8 L.
2. Rivestire i fili di un Luer femmina con un produttore di guarnizioni in silicone e posizionare il lato più piccolo nel foro preforato del contenitore.
3. Aggiungere il produttore di guarnizioni in silicone attorno al Luer femmina dove entra ed esce dal contenitore per garantire una tenuta ermetica.
4. Avvitare un rubinetto unino sulla femmina Luer. I tubi della camera di gonfiaggio dell'aria si attaccheranno a questo rubinetto.

4. Preparazione delle soluzioni

1. Soluzione di eparina
   1. Riempire un contenitore con PBS privo di calcio ed eparina (20 U/mL). Preparare un totale di 10 ml di soluzione di eparina per ogni topo. L'eparina è un anticoagulante che impedisce la formazione di coaguli di sangue nei vasi durante la fissazione della perfusione. La soluzione di eparina sarà utilizzata per lavare il sangue dai polmoni prima della fissazione della perfusione.
2. Soluzione fissativa
   ATTENZIONE: i fissativi possono rappresentare un pericolo per la salute e devono essere utilizzati in una cappa aspirante chimica. Tutti gli apparecchi sono allestiti in una cappa chimica per impedire l'inalazione di fissativi.
   1. Riempire un contenitore con PBS privo di calcio e paraformaldeide (concentrazione finale del 4%). Preparare un totale di 50 ml di soluzione fissativa per ogni mouse.
      NOTA: Il tipo di fissativo utilizzato può variare e dipenderà da studi istologici a valle.

5.   Preparazione dell'apparecchio di perfusione

NOTA: Una pompa peristaltica è suggerita per l'erogazione di fluidi in vascolarizzazione per garantire una portata costante. Le seguenti indicazioni sono per l'impostazione della pompa peristaltica e possono essere diverse per ogni modello. In alternativa, se una pompa peristaltica non è disponibile, può essere costruito un secondo apparato a colonna d'acqua per perfondere i fluidi da un'altezza di 35 cm H₂O.

1. Per prima cosa posizionare il tubo attorno al gruppo rullo.
2. Fissare il tubo nei montanti dentellati.
3. Fissare le leve in posizione posizionando prima la leva sinistra attorno al tubo e fissandola in posizione con la parte superiore e poi con la leva destra.
4. Posizionare l'estremità prossimale del tubo nella soluzione di eparina e l'estremità distale nel contenitore di lavorazione degli animali.
5. Precaricare la soluzione di eparina nel tubo facendo funzionare la pompa per espellere l'aria dal tubo.
6. Fissare un ago da 25G x 5/8" all'estremità del lato sinistro del tubo.

6. Preparazione dell'apparato di gonfiaggio dell'aria

1. Posizionare la siringa per la colonna d'acqua in un supporto ad anello.
2. Misurare un'altezza verticale di 25 cm dalla piattaforma animale al segno del nastro "25 cm" (passo 1.2) sulla colonna d'acqua.
3. Fissare l'estremità del tubo della colonna d'acqua al rubinetto della camera d'aria.
4. Attaccare un tubo dal Luer femmina della camera d'aria al rubinetto sul contenitore di lavorazione degli animali.
   NOTA: se la camera di gonfiaggio dell'aria è costruita come illustrato nella Figura 1C,il fissaggio del tubo in ordine inverso può causare perdite d'acqua nel tubo che si collega alla cannula tracheale.
5. Assicurarsi che il tappo della camera d'aria sia ben chiuso.
6. Assicurarsi che il rubinetto all'esterno del contenitore per la lavorazione degli animali sia chiuso e che il rubinetto sul tubo che porta dalla colonna d'acqua alla camera di gonfiaggio dell'aria sia aperto.
7. Riempire la siringa con acqua fino al segno "25 cm". L'acqua lascerà la siringa attraverso il tubo nella camera d'aria. Una volta equalizzata la pressione, l'acqua smetterà di scorrere.
   1. È possibile che l'acqua fuoriesca lentamente nella camera di gonfiaggio dell'aria mentre la pressione dell'aria ambiente all'interno del cappuccio chimico fluttua. Tenere d'occhio il livello dell'acqua all'interno della siringa e aggiungerne altri se necessario. Mantenere il livello dell'acqua al segno "25 cm" durante tutta la procedura.
      NOTA: Di solito i livelli dell'acqua rimangono costanti per la prima parte del gonfiaggio dell'aria a 25 cmH₂O; tuttavia sarà probabile che più acqua debba essere aggiunta alla siringa durante la fissazione. Se l'acqua non smette di scorrere, è probabile che esista una perdita d'aria all'interno della camera di gonfiaggio dell'aria. Potrebbe essere necessario applicare più produttore di guarnizioni in silicone attorno ai Luers per evitare perdite d'aria.

7. Preparazione degli animali (Figura 2)

NOTA: questa procedura è stata modificata da Gage et al¹³. Abbiamo completato questa procedura su topi maschi e femmine adulti di varie età e non notiamo alcun pregiudizio di età o sesso.

1. Eutanasia dell'animale con pentobarbital di sodio (150 mg/kg, per via intraperitoneale). Assicurarsi che l'animale sia morto prima di iniziare la dissezione.
   NOTA: Mentre questa procedura viene eseguita su animali eutanasizzati, questa procedura può essere eseguita su animali vivi per utilizzare il cuore per pompare perfusi in tutto l'animale.
2. Fare due incisioni laterali attraverso la parete addominale. Fai la prima incisione sotto la gabbia toracica e la seconda sopra i fianchi. Tagliare lungo la linea mediana dall'incisione inferiore verso l'incisione superiore.
3. Usando forbici smussate, fai con attenzione un'incisione nel lato laterale del diaframma. I polmoni dovrebbero collassare non appena il diaframma viene perforato.
   NOTA: Bisogna fare attenzione per evitare di perforare i polmoni. Un polmone perforato ha meno probabilità di gonfiarsi durante le fasi successive.
4. Tagliare trasversalmente lungo il diaframma per aprire la cavità toracica.
5. Tagliare superiormente lungo lo sterno dal processo xifoideo alla tacca giugulare e lateralmente sopra la gabbia toracica per esporre completamente il cuore e i polmoni. Fissare i lati della gabbia toracica.
6. Fai un'incisione della linea mediana nel collo sopra la trachea. Rimuovere la pelle, i muscoli, la ghiandola tiroidea e il tessuto connettivo che circonda la trachea.
7. Usando una pinca curva, fai scorrere due pezzi di filo o sutura sotto la trachea posteriore. Usa un pezzo di sutura per tenere in posizione l'adattatore Luer-stub di gonfiaggio e usa l'altro in definitiva per legare la trachea al termine del gonfiaggio dell'aria e della fissazione della perfusione vascolare.
8. Fai un piccolo buco nella trachea usando un ago da 18G x 1 "o forbici a molla Vannas.
9. Posizionare un adattatore Luer-stub da 20 G in questo foro nella trachea.
10. Legare un filo attorno alla trachea immediatamente distale al punto in cui entra l'adattatore Luer-stub per tenerlo in posizione.
11. Trasferire l'animale nel contenitore di lavorazione degli animali.
12. Collegare l'adattatore Luer-stub alla femmina Luer all'interno del contenitore per la lavorazione degli animali.

8. Gonfiaggio dell'aria, perfusione e fissazione dei polmoni (Figura 2)

1. Posizionare l'ago 25G x 5/8" attaccato al tubo dell'apparato di perfusione nel ventricolo destro del cuore.
2. Tagliare l'aorta addominale per consentire al sangue di defluire dal cuore e per promuovere il flusso di perfusate attraverso i polmoni.
3. Aprire il rubinetto all'esterno del contenitore di lavorazione degli animali per gonfiare i polmoni.
   NOTA: potrebbe essere necessario del tempo prima che i polmoni si gonfino completamente. Guarda il livello dell'acqua nella siringa, non dovrebbe diminuire rapidamente a meno che non ci sia una perdita nei polmoni.
4. Gonfiare i polmoni a 25 cmH₂O per 5 minuti. L'inflazione a 25 cmH₂O precondiziona il polmone e aiuta a reclutare regioni polmonari atelette.
   NOTA: potrebbe essere necessario aggiungere una piccola quantità di acqua alla siringa per mantenere l'altezza di 25 cm. L'infiammazione e / o la lesione polmonare indotta sperimentalmente possono influenzare l'inflazione dei polmoni. In questo caso, potrebbe essere necessario aumentare la pressione di gonfiaggio fino a un massimo di 35 cmH₂O per aiutare a reclutare regioni atelette.
5. Durante l'ultimo minuto di gonfiaggio polmonare, accendere la pompa peristaltica a una portata di 10 ml / min. La soluzione di eparina dovrebbe fluire dalla bottiglia attraverso il tubo nell'animale.
   1. L'obiettivo dell'infusione di eparina è prevenire la formazione di trombi nei vasi. Di conseguenza, infondere eparina fino a quando i polmoni diventano bianchi e sono privi di sangue. Se i polmoni non diventano bianchi, può essere necessaria la regolazione dell'ago ventricolare destro.
6. Dopo aver gonfiato per 5 minuti, spegnere la pompa peristaltica e commutare il tubo di perfusione dalla soluzione di eparina al fissativo.
7. Abbassare la siringa della colonna d'acqua fino al segno "20 cm" (punto 1.3). È normale che le bolle d'aria si muova all'interno della colonna d'acqua quando la pressione varia da 25 a 20 cmH₂O.
   1. Controllare il livello dell'acqua nella siringa. Dovrebbe essere al segno "25 cm". Potrebbe essere necessario aggiungerne altri in questo momento.
8. Attendere 1 minuto per consentire ai polmoni di sgonfiarsi da 25 a 20 cmH₂O.
9. Riavviare la pompa di perfusione a una portata di 6,5 ml/min.
10. Correzione della perfusione vascolare per 10 - 15 minuti.

9. Estrazione dei polmoni (Figura 3)

1. Legare strettamente il secondo pezzo di filo attorno alla trachea distale all'adattatore Luer-stub. Rimuovere l'adattatore Luer-stub dalla trachea.
2. Rimuovere l'ago dal cuore.
3. Liberare i polmoni e il cuore dalla cavità toracica tagliando il tessuto connettivo posteriore al mediastino con forbici smussate. Fare attenzione ad evitare di perforare i polmoni.
4. Rimuovere con attenzione il cuore dai polmoni.
5. Posizionare i polmoni in fissativo durante la notte.
   NOTA: La durata delle variazioni fissative dipende dagli studi istologici a valle.
   1. Posizionare i polmoni in un tubo conico da 50 ml contenente 20-25 ml di fissativo. Posizionare il filo che fissa la trachea attraverso l'apertura del tubo conico e fissare per i fili del cappuccio. Invertire il tubo conico per garantire che i polmoni galleggianti e gonfiati ad aria rimangano completamente immersi in fissativo altrimenti galleggieranno verso la parte superiore del liquido.
6. Elaborare i polmoni per studi istologici.

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Risultati

In un torace intatto, i polmoni sono tenuti aperti da forze esterne applicate dalla parete toracica attraverso lo spazio^pleurico6,¹⁴. Quando il diaframma viene inserito durante la dissezione, l'integrità dello spazio pleurico viene abolita e i polmoni dovrebbero collassare (Figura 2A, 2B). Per ri-espandere i polmoni, viene eseguito il gonfiaggio dell'aria. Come primo passo, vengono applicati 25 cm di pressione dell'...

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Discussione

Sebbene comunemente usati, i metodi di fissazione intratracheali spostano i leucociti dalle vie aeree e possono alterare la normale architettura polmonare. Il metodo di gonfiaggio dell'aria con fissazione della perfusione vascolare fornito in questo protocollo supera queste insidie e preserva più accuratamente l'anatomia polmonare. Le chiavi per ottenere tessuto di alta qualità dal metodo di perfusione-fissazione vascolare includono un attento monitoraggio delle pressioni di gonfiaggio dell'aria, evitando perdite d'ari...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container