Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

Riepilogo

In questo protocollo viene descritto un metodo di coltivazione e analisi funzionale in vitro per le cellule staminali muscolari, che conserva la maggior parte delle loro interazioni con la loro nicchia endogena.

Abstract

Il tessuto muscolare scheletrico adulto ospita una popolazione di cellule staminali indispensabile per la sua capacità di rigenerarsi. In caso di danno muscolare, le cellule staminali muscolari lasciano il loro stato quiescente e attivano il programma miogenico che alla fine porta alla riparazione del tessuto danneggiato in concomitanza con il rifornimento del pool di cellule staminali muscolari. Vari fattori influenzano l'attività delle cellule staminali muscolari, tra cui stimoli intrinseci ma anche segnali provenienti dall'ambiente diretto delle cellule staminali muscolari, la nicchia delle cellule staminali. L'isolamento e la coltura di singole miofibre con le loro cellule staminali muscolari associate preserva la maggior parte dell'interazione della cellula staminale con la sua nicchia ed è, quindi, la possibilità più vicina per studiare la funzionalità delle cellule staminali muscolari ex vivo. Qui viene fornito un protocollo per l'isolamento, la coltura, la trasfezione di siRNA e l'immunocolorazione delle cellule staminali muscolari sulle rispettive miofibre dai muscoli EDL (extensor digitorum longus) del topo. Le condizioni sperimentali qui delineate consentono lo studio e la manipolazione di cellule staminali muscolari ex vivo, compresa l'indagine sull'attività miogenica senza la necessità intrinseca di esperimenti su animali in vivo.

Introduzione

Il muscolo scheletrico nell'adulto è un tessuto postmitotico composto principalmente da miofibre multinucleate, che sono le cellule effettrici per i movimenti volontari. Ha una notevole capacità di rigenerarsi, un processo che ricorda la miogenesi embrionale e subisce menomazioni nell'età e nella malattia¹. Questa sorprendente capacità rigenerativa del muscolo scheletrico dipende dalle cellule staminali muscolari (MuSC), che sono anche definite cellule satelliti a causa della loro posizione tra il sarcolemma e la lamina basale delle miofibre^2,3. In condizioni di riposo i MuSC sono quiescenti e caratterizzati dall'espressione del fattore di trascrizione Pax7 e marcatori di quiescenza come Sprouty1^4,5,6,7,8. Al momento dell'attivazione, ad esempio, dopo un infortunio, le MuSC lasciano lo stato quiescente e sovraregolano il fattore regolatore miogenico MyoD⁹. I MuSC doppi positivi Pax7 / MyoD proliferano e si differenziano generando così cellule precursori miogeniche, che sono anche spesso indicate come mioblasti. Questi mioblasti si differenziano ulteriormente in miociti allungati, un processo che coincide con cambiamenti molecolari e morfologici, ad esempio la perdita di Pax7 e la sovraregolazione dell'espressione di miogenina¹⁰. I miociti alla fine si fondono tra loro o con le miofibre esistenti, riparando così il tessuto danneggiato. È importante sottolineare che una piccola frazione di cellule staminali muscolari ripristina la sovraregolazione myoD ed è in grado di auto-rinnovarsi¹¹. Lo stato della differenziazione muSC e della progressione miogenica può essere facilmente osservato studiando marcatori miogenici come Pax7, MyoD e Myogenin¹⁰.

La coltura di singole miofibre con i loro MuSC adiacenti è un metodo eccellente per studiare la funzionalità MuSC in un ambiente ex vivo poiché i MuSC rimangono nella loro nicchia endogena^12,13. Il comportamento dei MuSC è regolato da segnali intrinseci e segnali estrinseci forniti dalla nicchia, una posizione anatomica specializzata che comprende componenti della matrice extracellulare (ECM) che circonda i MuSC e la miofibra stessa. Ad esempio, uno dei regolatori estrinseci della quiescenza MuSC è la segnalazione Notch. Qui, i segnali di segnalazione vengono ricevuti dai MuSC sia dalla miofibra che dall'ECM^14,15,16. Inoltre, la nicchia MuSC è importante per controllare l'asse di divisione dei MuSC regolando così il destino cellulare delle cellule figlie MuSC^17,18. Ragionevolmente, parametri come le divisioni MuSC asimmetriche, la progressione miogenica e l'auto-rinnovamento possono essere valutati in modo univoco in questa configurazione sperimentale. Ad esempio, un cluster multicellulare può formarsi derivante da un MuSC dopo un periodo di coltura di 72 ore, che può essere studiato per la presenza e la percentuale di popolazioni miogeniche distinte come MuSCs auto-rinnovanti, proliferanti e ulteriormente differenziate^8,19,20,21. Lo stato di differenziazione delle MuSC può essere determinato dallo studio dell'espressione/co-espressione di Pax7, MyoD e Myogenin. Dopo 72 ore di coltura le cellule in un cluster possono essere discriminate dai seguenti parametri: solo le cellule Pax7 sono MuSC auto-rinnovanti, mentre le cellule Pax7/MyoD doppie positive stanno proliferando/attivando MuSC e ulteriormente le cellule miogeniche differenziate sono Myogenin^{positive 22}. Inoltre, i numeri di MuSC o il rientro nel ciclo/attivazione cellulare possono essere studiati in aggiunta alla progressione miogenica, ad esempio attraverso analisi basate sull'immunofluorescenza basate sui parametri sopra descritti.

Qui vengono descritte le caratteristiche uniche del protocollo di isolamento e coltura della miofibra, ad esempio la conservazione dell'interazione del MuSC con la sua nicchia. I muscoli EDL interi di topo (extensor digitorum longus) vengono accuratamente sezionati, digeriti dalla collagenasi e triturati fisicamente per ottenere singole miofibre con i loro MuSC associati per un'ulteriore coltura. Inoltre, il protocollo delinea i passaggi per trasfettare MuSC con siRNA per analisi funzionali di geni candidati e analisi consecutive basate sull'immunofluorescenza senza la necessità di animali transgenici.

Protocollo

Il sacrificio di animali deve essere effettuato in conformità con le normative nazionali per la sperimentazione animale. Il protocollo qui descritto è stato eseguito in conformità con le linee guida del Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute e la direttiva dell'Unione Europea (UE) 2010/63 / UE (numero di licenza per il prelievo di organi: O_JvM_18-20). I passaggi essenziali del protocollo sono riassunti nella Figura 1.

1. Preparazione di piastre di coltura, supporti e pipette Pasteur

NOTA: Tutti i materiali e le attrezzature necessarie per isolare e coltivare singole miofibre devono essere il più sterili possibile. Pertanto, si raccomanda di isolare singole miofibre sotto un cappuccio di dissezione semi-sterile.

1. Utilizzare HS sterile (siero di cavallo) per rivestire le piastre di coltura dei tessuti. Il rivestimento impedisce l'attaccamento di singole miofibre alla superficie plastica. Per ogni topo sono necessari 4 pozzetti di una piastra da 12 pozzetti per l'isolamento e un numero dedicato di pozzetti di una piastra da 24 pozzetti per la coltivazione. Incubare i pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con 1 mL e i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con 0,5 mL di HS per 5 minuti a RT (temperatura ambiente), quindi rimuovere l'HS e lasciare asciugare le piastre per altri 5 minuti.
   NOTA: HS può essere raccolto e riutilizzato per scopi di rivestimento più volte, se mantenuto sterile.
2. Preparare il mezzo di isolamento della miofibra integrando DMEM (il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio) con il 20% di FBS (siero bovino fetale), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Aggiungere il mezzo alle piastre di isolamento preverniciate (piastra a 12 pozzetti, 2-4 mL di terreno di isolamento per pozzetto) circa 30 minuti prima dell'isolamento ed equilibrare in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO_2.
3. Preparare il terreno di coltura della miofibra integrando dmEM (mezzo dell'aquila modificato di Dulbecco con 4,5 g / L di glucosio e piruvato di sodio) con il 20% di FBS (siero bovino fetale) e l'1% di estratto di embrione di pollo, filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Aggiungere 0,5 mL di terreno a ciascun pozzetto delle piastre di coltura preverniciate (piastra a 24 pozzetti) circa 30 minuti prima dell'isolamento ed equilibrare in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO_2.
4. Preparare la soluzione di digestione della collagenasi sciogliendo lo 0,2% (p/v) di collagenasi di tipo 1 (da Clostridium histolyticum)in DMEM (il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Per due muscoli EDL (extensor digitorum longus) utilizzare 2,5 mL di soluzione di collagenasi in un tubo di reazione sterile da 15 mL. Inoltre, preriscaldare la soluzione ~10 min in un bagno d'acqua circolante a 37 °C prima di iniziare l'isolamento.
5. Preparare pipette Pasteur sterili per la triturazione dei muscoli digeriti dalla collagenasi. Usa una penna diamantata per tagliare le pipette Pasteur.
   1. Per ogni mouse, utilizzare una pipetta di grande diametro con un'apertura di circa 0,3 cm e una lunghezza di circa 10-12 cm e una seconda pipetta di vetro con una piccola apertura di circa 0,1 cm e una lunghezza di circa 22 cm (Figura 2F).
   2. Levigare i bordi di entrambe le pipette lucidando a caldo con la fiamma di un bruciatore Bunsen. Tenere la punta della pipetta per 5-10 s nella fiamma con un movimento delicato per consentire un'equa distribuzione del calore fino a quando i bordi taglienti del vetro non si levigano.
   3. Immediatamente prima dell'uso, rivestire entrambi i tipi di pipette di vetro con HS sterile riempiendo l'intera pipetta con ~ 2 mL di HS per 5 minuti, successivamente, espellere l'HS e lasciare asciugare le pipette per 5 minuti a RT.

2. Isolamento muscolare EDL e digestione della collagenasi

1. Spruzzare tutte le apparecchiature con etanolo al 70% per evitare la contaminazione.
2. Sacrificare il topo in conformità con le normative nazionali per la sperimentazione animale.
3. Spruzzare gli arti posteriori del topo con etanolo al 70%. Utilizzare forbici curve sottili indurite (tagliente da 24 mm) e pinze sottili (Dumont 7, curve o dritte) per rimuovere la pelle ed esporre i muscoli sottostanti. Evitare qualsiasi contatto dei muscoli sottostanti con la pelliccia (aumenta il rischio di contaminazione).
4. Rimuovere la fascia circostante con una pinza curva fine senza danneggiare i muscoli sottostanti (Figura 2A). Chiudere la pinza per evitare di piegarsi.
5. Utilizzare pinze curve per esporre i tendini distali del muscolo TA(tibiale anteriore)e EDL. Per rimuovere il TA, afferrare il tendine TA distale con una pinza e tagliare con forbici a molla Vannas fini (tagliente da 5 mm, diametro punta 0,35 mm). Mentre si tiene l'AT al tendine, tirarlo verso il ginocchio e tagliare il muscolo vicino al ginocchio (Figura 2B), il muscolo EDL è ora esposto.
   NOTA: assicurarsi che in questo passaggio venga afferrato solo il tendine TA, altrimenti l'EDL sottostante potrebbe danneggiarsi. Quando si taglia il muscolo TA assicurarsi che i tendini del ginocchio possano essere visti facilmente in seguito.
6. Sollevare il tendine EDL distale con una pinza finemente curva e tagliare con forbici a molla Vannas fini (Figura 2C). Esporre il tendine EDL prossimale tirando con cura l'EDL verso il ginocchio. Tagliare il tendine prossimale con le forbici a molla Vannas fini. Trasferire il muscolo EDL ai 2,5 mL preriscaldati a 37 °C di soluzione di digestione della collagenasi nel tubo di reazione da 15 mL dal passaggio 1.4. (Figura 2D).
   NOTA: Fare una piccola incisione sul tessuto connettivo esterno del ginocchio per esporre completamente il tendine EDL prossimale. Assicurati di afferrare solo i tendini e di non allungare troppo l'EDL.
7. Ripetere i passaggi 2.3. al 2.6. con il secondo EDL. Aggiungere entrambi i muscoli EDL allo stesso tubo di reazione da 15 ml riempito con 2,5 mL di soluzione di digestione della collagenasi.
8. Incubare i muscoli EDL nel tubo di reazione a 37 °C in un bagno d'acqua circolante.
   NOTA: Il tempo di incubazione dipende da diversi fattori, come l'attività della collagenasi, l'età del topo e la quantità di tessuto fibrotico. Il tempo di incubazione tipico per i muscoli EDL dei topi adulti (2-6 mesi di età) è di 1-1,5 ore e per i topi anziani (18 mesi di età) 1,5-2 ore.
9. Per evitare un'eccessiva digestione dei muscoli, controllare i muscoli durante il tempo di digestione. Interrompere la digestione quando i muscoli si allentano e sono visibili singole miofibre (Figura 2E). Trasferire accuratamente i muscoli con la pipetta di grande diametro al primo pozzetto della piastra a 12 pozzetti preribalizzata contenente il mezzo di isolamento in miofibra (Figura 2G).

3. Dissociazione e cultura di Myofiber

1. Per i passaggi successivi utilizzare un microscopio binoculare stereo, preferibilmente dotato di piastra riscaldante (37 °C). Utilizzare la pipetta di grande diametro per lavare i muscoli con un mezzo di isolamento caldo fino a quando le singole miofibre non vengono rilasciate. Dissociare i muscoli con la pipetta di grande diametro fino a quando il numero desiderato di miofibre fluttua liberamente nella soluzione.
   NOTA: Evitare un'eccessiva triturazione per ridurre il rischio di miofibre danneggiate. L'uso di una piastra riscaldante per la dissociazione della miofibra è fortemente consigliato poiché la temperatura scende durante il processo di isolamento, il che comporterà la morte della miofibra.
2. Trasferire le miofibre non contratte (Figura 2H) con la pipetta di vetro di piccolo foro rivestita HS al secondo pozzo riempito con mezzo di isolamento per lavare via detriti e miofibre contratte (danneggiate) (Figura 2I).
   NOTA: Per evitare movimenti eccessivi di miofibre isolate, possono essere trasferite al secondo pozzo e quindi il processo di triturazione può essere continuato.
3. Trasferire le miofibre non contratte al successivo (3^°)ben riempito con mezzo di isolamento per lavare di nuovo.
4. Utilizzare la pipetta di vetro di piccolo diametro, rivestita con HS, per trasferire circa 50-100 miofibre non contratte alla piastra a 24 pozzetti contenente il terreno di coltura in miofibra.
5. Incubare le miofibre a 37 °C, 5% CO₂ per il tempo dedicato (si consiglia un massimo di 96 h).
   NOTA: I MuSC si dividono una volta planari o apicali-basali dopo 42 ore di coltura. Inoltre, dopo 72 ore di coltura, le MuSC formano cluster multicellulari costituiti da MuSC auto-rinnovanti, proliferanti o impegnati (differenziati).

4. trasfezione di siRNA

1. 4 ore dopo l'isolamento della miofibra, trasfettare le MuSC associate alla miofibra (50-100 miofibre non contratte in un pozzetto della piastra a 24 pozzetti riempita con terreno di coltura da 500 μL) con reagente di trasfezione a base lipidica, ad esempio RNAiMAX secondo il protocollo del produttore con una concentrazione finale di siRNA a 5 pmoli. Pertanto, aggiungere 25 μL di Opti-MEM con il rispettivo volume di siRNA a 25 μL Opti-MEM contenente 1,5 μL del reagente di trasfezione. Incubare la miscela di reazione per 5 minuti e aggiungerla poi ai 500 μL di terreno di coltura.
   NOTA: una seconda trasfezione dopo 24 ore o 48 ore è consigliata per periodi di coltura più lunghi, ad esempio più di 48 ore. Non è necessario un cambio di mezzo dopo la trasfezione.

5. Fissazione e colorazione IF

1. Per l'immunocolorazione utilizzare un microscopio binoculare stereo. Tutti i volumi nei passaggi seguenti sono regolati su un pozzo di una piastra a 24 pozzetti. Eseguire tutti i passaggi seguenti utilizzando una pipetta di piccolo foro rivestita HS.
2. Scartare con attenzione il terreno di coltura della miofibra lasciando una soluzione nel pozzo (circa 100 μL per 24 pozzetti). Fallo per tutti gli ulteriori passaggi, se non diversamente specificato, per consentire il galleggiamento delle miofibre. Aggiungere 500 μL di PFA al 2% per fissare le miofibre con i muSC adiacenti, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Rimuovere accuratamente il surnatante e lavare le miofibre tre volte con PBS (pH 7,4, 500 μL per 5 minuti a RT ciascuna).
4. Aggiungere una soluzione di permeabilizzazione da 500 μL (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glicina in PBS, pH 7,4), incubare per 10 minuti a RT.
5. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e aggiungere una soluzione bloccante da 500 μL (5% HS in PBS, pH 7,4) per 1 ora a RT.
   NOTA: Controllare la soluzione di blocco raccomandata per gli anticorpi primari per evitare legami non specifici.
6. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 300 μL di diluizione anticorpale primaria (ad esempio, anti-Pax7 (PAX7, DSHB, non diluito), anti-MyoD (clone G-1, Santa Cruz, 1:200)) per pozzetto. Incubare a 4 °C durante la notte.
7. Lavare tre volte con 500 μL di PBS per pozzetto (5 min a RT).
8. Rimuovere PBS e aggiungere 300 μL di diluizione anticorpale secondaria (ad esempio, anti-mouse-IgG1-546 e anti-mouse-IgG2b-488 1:1000) per pozzetto. Incubare 1 ora a RT al riparo dalla luce. Per i seguenti passaggi, si raccomandano condizioni di riduzione della luce.
9. Lavare due volte con 500 μL di PBS per pozzetto (5 min a RT).
10. Eseguire la colorazione DAPI utilizzando 500 μL della soluzione per pozzetto (concentrazione finale DAPI 10 μg/mL) per 5 minuti a RT.
11. Lavare due volte con 500 μL di PBS per pozzetto (5 min a RT).
12. Utilizzare una penna idrofoba per disegnare un cerchio su un microscopico vetrino per creare una barriera idrorepellente che impedirà la fuoriuscita di liquidi contenenti miofibre. Trasferire le miofibre nel minor volume possibile sul microscopico vetrino e disperderle sul vetrino.
    NOTA: Evitare la trazione fisica delle miofibre sul vetrino microscopico poiché ciò potrebbe causare attrito con conseguente distacco di grappoli dalle miofibre.
13. Rimuovere il liquido residuo con la pipetta Pasteur di piccolo diametro o una pipetta da 200 μL.
14. Utilizzare due gocce di mezzo di montaggio acquoso e coprire le miofibre con un coperchio. Lasciare asciugare le diapositive per il tempo consigliato dal produttore. Conservare i vetrini a 4 °C al buio.

Risultati

Questo protocollo fornisce istruzioni per la derivazione e la coltura di successo di singole miofibre con le muSC associate dai muscoli EDL murini. I passaggi essenziali del protocollo sono riassunti nella Figura 1. Un'attenta dissezione tendine-tendinea dei muscoli EDL (Figura 2A-C) è fondamentale per un'alta resa di miofibre vitali. La dissociazione muscolare si ottiene prima dalla digestione della collagenasi (Figura 2D) seguita dalla triturazione fisica (Figura 2G). Le miofibre intatte (Figura 2H) sono coltivate, mentre le miofibre ipercontratturate e morte (Figura 2I) dovrebbero essere escluse dalla coltura e dall'analisi.

I MuSC rimangono associati alla miofibra durante il processo di isolamento. La colorazione di immunofluorescenza per il fattore di trascrizione Pax7 identifica e distingue 7-9 nuclei MuSC dalla pletora di mionuclei per miofibra quando fissati direttamente dopo il completamento del processo di isolamento (Figura 3A). La Figura 3B mostra un'area ingrandita dalla Figura 3A con il canale di campo luminoso aggiuntivo, che espone la struttura miofibrillare subcellulare del miotubo e dimostra il segnale di immunofluorescenza Pax7 nel nucleo di un MuSC.

L'attivazione e la progressione miogenica delle MuSC associate alla miofibra possono essere analizzate mediante l'espressione di marcatori miogenici. Associate a miofibre appena isolate (0 h), si possono trovare per lo più MuSC quiescenti, che sono caratterizzate dall'espressione di Pax7 e dall'assenza di espressione di MyoD, simile quindi a una condizione omeostatica in vivo(Figura 4, 0 h). A causa della procedura di dissezione/dissociazione e della composizione del terreno di coltura della miofibra, i MuSC attivano e sovraregolano rapidamente il fattore di trascrizione MyoD per facilitare la proliferazione come si può osservare a 42 ore, quando i MuSC hanno subito la loro prima divisione(Figura 4,42 h). Dopo 72 ore di coltura, i MuSC formano gruppi di progenie con diversi destini miogenici che sono paralleli ai modelli di espressione di diversi marcatori miogenici (Figura 4, 72 h). Solo le cellule Pax7+ resistono alla differenziazione e diventano cellule staminali auto-rinnovanti. Le cellule pax7+ e myoD+ doppie positive sono proliferative, mentre solo le cellule MyoD+ sono ulteriormente progredite lungo il lignaggio miogenico e si differenzieranno.

Il sistema di coltura della miofibra consente un'interferenza efficiente dell'attività muSC da parte di vari interventi, uno dei quali è la trasfezione di siRNA come descritto in dettaglio in questo protocollo. Per monitorare l'efficienza di trasfezione delle MuSC associate alla miofibra è stato trasfettato un siRNA non mirato marcato fluorescentemente. I MuSC positivi di Pax7 hanno accumulato siRNA citoplasmatico in modo simile a un granulo, indicando un assorbimento efficiente (Figura 5A). Non sono stati osservati granuli fluorescenti nel citoplasma delle miofibre suggerendo una barriera naturale all'assorbimento nelle miofibre a 4 ore dopo l'isolamento e che la trasfezione di siRNA si rivolge specificamente alle MuSC. La quantificazione delle cellule Pax7+ trasfettate positivamente per miofibra ha rivelato che più della metà di tutte le MuSC aveva assorbito quantità visibili di siRNA marcata fluorescentmente poco prima del completamento del primo ciclo di divisione a 24 ore. Il numero di cellule Pax7+ trasfettate è aumentato ulteriormente fino al 74% dopo 30 ore (Figura 5B). Inoltre, non vi è stata alcuna differenza nel numero di cellule Pax7+ per miofibra di condizioni trasfettate o non trasfettate in entrambi i punti temporali, dimostrando che non ci sono effetti avversi sul numero di cellule staminali dovuti alla procedura di trasfezione (Figura 5C).

In sintesi, il protocollo fornisce una descrizione dettagliata dell'isolamento e della coltura di singole miofibre EDL con le loro cellule staminali muscolari adiacenti. Consente lo studio dell'attività delle cellule staminali muscolari associate alla miofibra ex vivo, ad esempio mediante analisi basate sull'immunofluorescenza. La manipolazione delle cellule staminali muscolari mediante trasfezione di siRNA è efficiente e fornisce una base metodologica per le analisi funzionali.

Figura 1: Riepilogo schematico dei passaggi essenziali. I passaggi essenziali della procedura di isolamento e immunocolorazione sono riassunti in questa figura. Abbreviazioni: DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium; FBS, Siero bovino fetale; CEE, Estratto di embrione di pollo; TA, tibiale anteriore; EDL, extensor digitorum longus Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dissezione EDL del topo e isolamento della singola miofibra. (A) La pelle dell'arto posteriore del topo viene rimossa e il muscolo circostante la fascia viene allontanato per esporre il muscolo TA (tibiale anteriore). (B) Il muscolo TA viene rimosso per esporre il muscolo EDL (extensor digitorum longus), contrassegnato dalla freccia bianca. (C) Il muscolo EDL viene sezionato tagliando i suoi tendini. (D) Due muscoli EDL sono collagenasi digerita. (E) Comparsa di collagenasi muscolare digerita con miofibre singole visibili che si allentano dal nucleo del tessuto. (F) Pipetta Pasteur di grandi e piccoli fori con scala. (G) I muscoli EDL (contrassegnati da frecce nere) sono fisicamente triturati utilizzando una pipetta Pasteur di grande diametro. (H) Le singole miofibre intatte sono sottili e lucide e possono essere raccolte individualmente per la coltura e l'analisi. ( I )Lemiofibre ipercontrattuate e morte non sono adatte alla cultura e all'analisi. Le immagini microscopiche di 2H e 2I sono state catturate con un microscopio utilizzando un obiettivo N-Achroplan 5x. Le barre di scala sono 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagine microscopica di un'intera singola miofibra con i muSC associati. Sono state preparate singole miofibre da EDL di giovani topi C57BL/6 e fissate con PFA dopo l'isolamento (0 h). (A) La colorazione di immunofluorescenza Pax7 e DAPI identifica le cellule staminali muscolari associate alla miofibra (MuSC, contrassegnate da frecce). L'immagine microscopica è stata catturata utilizzando le piastrelle e la funzione z-stack di un microscopio dotato di un obiettivo ad olio Plan-Apochromat 40x. La barra della scala è di 200 μm. (B) Ingrandimento da (A) che mostra i mionuclei, un nucleo positivo Pax7 e il modello chiaro-scuro delle strutture miofibrillari in campo luminoso. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini di immunofluorescenza dell'attivazione di MuSC e della progressione miogenica durante la coltura di una singola miofibra. Le cellule staminali muscolari (MuSC) di miofibre appena isolate (0 h) rappresentano uno stato omeostatico vicino alla quiescenza in vivo, caratterizzato dall'espressione di Pax7 e dalla mancanza di espressione di MyoD. Durante la coltura di una singola miofibra la maggior parte dei MuSC sovraregola MyoD e rientra nel ciclo cellulare per dividersi e proliferare (42 h). Dopo 72 ore di coltura il destino di MuSC può essere discriminato in base all'espressione del marcatore miogenico. Le cellule con espressione solo Pax7 si auto-rinnoveranno (freccia rossa) mentre le celle doppie positive Pax7 e MyoD (freccia rossa / verde) continueranno a proliferare. Solo le cellule myoD positive (freccia verde) si sono impegnate nella differenziazione miogenica. Le immagini microscopiche sono state catturate utilizzando un microscopio con un obiettivo Plan-Apochromat 20x (0 h, 42 h) o un obiettivo LD Plan-Neofluar 40x (72 h). Le barre della scala sono di 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Trasfezione fluorescente di SiRNA di MuSC e analisi dell'assorbimento. Le miefibre singole EDL sono state preparate e trasfettate con siRNA marcato fluorescentemente (siGLO) seguendo i passaggi previsti da questo protocollo. (A) Accumulo citoplasmatico di granuli siGLO in particolare in una cellula staminale muscolare Pax7 positiva (MuSC) su una singola miofibra a 30 ore di coltura. L'immagine microscopica è stata catturata utilizzando la funzione z-stack e apotome di un microscopio con un obiettivo ad olio Plan-Apochromat 100x. Le barre di scala sono 5 μm. (B) Quantificazione dell'assorbimento di siRNA da parte delle cellule staminali muscolari positive Pax7 a 24 o 30 ore di coltura. (C) Numero di cellule Pax7 positive per singola miofibra che confrontano le condizioni non trasfettate e trasfettate a 24 o 30 ore di coltura. I dati sono mostrati come medi con deviazione standard di n = 4 topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, viene presentato un metodo per studiare funzionalmente il ruolo di un gene specifico nelle MuSC utilizzando un approccio in vitro. È importante sottolineare che nel sistema qui descritto i MuSC sono coltivati in condizioni che assomigliano il più possibile alla situazione in vivo preservando la maggior parte delle interazioni dei MuSC con la loro nicchia. Ciò si ottiene coltivando miofibre isolate con i loro MuSC adiacenti in condizioni galleggianti e trasfezione consecutiva di siRNA. Vengono descritte le procedure di isolamento della miofibra, la trasfezione di siRNA e l'indagine delle popolazioni muSC durante 72 ore di coltura attraverso analisi di immunofluorescenza. Inoltre, è stato dimostrato che circa il 74% di tutte le MuSC sono state trasfettate con un siRNA di controllo marcato fluorescentemente dopo 30 ore di coltura.

Particolare attenzione dovrebbe essere focalizzata sull'attenta dissezione del muscolo EDL poiché lo stretching esteso, il pizzicamento o la spremitura porteranno alla contrazione e alla morte consecutiva delle miofibre. Inoltre, è importante studiare gruppi di MuSC da almeno 20 diverse miofibre per replicazione per condizione. Ciò è necessario poiché i numeri e le proprietà MuSC variano a causa dell'esistenza di sottopopolazioni MuSC. Quando si studia l'effetto di un siRNA specifico sui MuSC utilizzando il metodo di coltura della miofibra fluttuante, è necessario eseguire un confronto della condizione con il siRNA mirato al controllo non mirato all'interno dello stesso topo e muscolo. Questo è raccomandato per evitare differenze specifiche del topo che potrebbero coprire o amplificare gli effetti del siRNA. L'efficienza di abbattimento può essere determinata da analisi di immunofluorescenza con anticorpi diretti contro il gene bersaglio utilizzando singole miofibre con le loro MuSC adiacenti. Se questa non è un'opzione, si può testare l'efficienza di abbattimento del siRNA nei mioblasti primari seguiti da analisi quantitative RT-PCR o immunoblot. L'efficienza del siRNA deve essere determinata prima di analizzare l'effetto del siRNA sui MuSC su singole miofibre. L'uso di un pool intelligente composto da 4 diversi siRNA rispetto a uno singolo aumenta l'efficienza di abbattimento ma aumenta anche il rischio di targeting non specifico. Un siRNA non mirato dovrebbe essere usato come controllo. Per monitorare direttamente l'efficienza della trasfezione, si può usare un siRNA non mirato marcato fluorescente come eseguito qui. Il punto temporale per la trasfezione con il siRNA è di circa 4 ore dopo l'isolamento, un punto temporale in cui la lamina basale che circonda i MuSC è già permeabile per il siRNA. Se si dovesse studiare l'effetto di un siRNA specifico sui MuSC dopo 72 o 96 ore, si raccomanda di eseguire una seconda trasfezione di siRNA dopo 24 ore o 48 ore per mantenere un'elevata efficienza di abbattimento.

Il test di coltura myofiber mostra diversi vantaggi rispetto allo studio delle MuSC con metodi di coltura cellulare convenzionali. I MuSC rimangono attaccati alle miofibre durante l'intero processo di isolamento, preservando così l'interazione cruciale del MuSC con la sua nicchia^19,23,24,25. L'interazione preservata dei MuSC con la miofibra è un prerequisito per lo studio degli effetti dipendenti dalla nicchia sulla funzionalità MuSC, che non possono essere ricapitolati nelle colture di mioblasti 2D convenzionali. Ad esempio, durante l'invecchiamento i MuSC mostrano una ridotta capacità miogenica con conseguente ridotta efficienza per rigenerare il tessuto muscolare dopo il danno^20,26. Tale svalutazione è almeno in parte attribuibile a variazioni della nicchia MuSC, in particolare variazioni della composizione ECM^27,28. Il protocollo di coltura myofiber consente lo studio e l'interferenza con questi aberranti cambiamenti di nicchia.

In contrasto con il metodo qui descritto, la purificazione dei MuSC mediante tecniche di immunolabeling e selezione come FACS (fluorescence activated cell sorting) o MACS (magnetic cell sorting) comporta la rimozione dei MuSC dalla loro nicchia. È interessante notare che le colture 2D di MuSC isolati da muscoli invecchiati perdono i loro segnali estrinseci e si comportano in modo simile ai MuSC isolati dai muscoli giovani, non ricapitolando in modo appropriato la situazione in vivo²⁹. Inoltre, la completa dissociazione del tessuto muscolare e l'etichettatura dei MuSC con marcatori superficiali provoca cambiamenti trascrittomici e attivazione delle cellule^30,31,32. Un altro vantaggio del sistema di coltura myofiber è la possibilità di interferire con la funzionalità MuSC a vari livelli. La manipolazione delle MuSC sulle miofibre in coltura può essere efficacemente ottenuta mediante knockdown genico mediato da siRNA, come descritto qui in dettaglio. Allo stesso modo, l'applicazione di composti chimici o la somministrazione di proteine ricombinanti è molto efficace per interferire con le vie delle cellule staminali^20,28. Inoltre, i vettori di espressione retro- o lentivirale permettono l'introduzione di geni esogeni, cioè mutanti attivi costitutivi³³. Inoltre, l'influenza dei fattori estrinseci sulla funzionalità MuSC può essere esplorata nel sistema qui descritto, ad esempio, le condizioni di coltura possono essere integrate con surnatante da diverse fonti fisiologiche o patologiche per modellare diversi stati come la cachessia del cancro^34,35.

Una limitazione del metodo qui descritto è il fatto che il singolo sistema di coltura della miofibra non può ricapitolare completamente l'impatto di tutti i fattori sistemici o l'influenza di altri tipi di cellule sui MuSC. Inoltre, il tempo in cui le miofibre possono essere mantenute vitali in coltura è limitato e quindi lo studio dei processi correlati al MuSC si concentra su eventi precoci come l'attivazione e l'impegno miogenico. Inoltre, lo studio dell'interazione MuSC con altre cellule di nicchia come le cellule immunitarie o le cellule progenitrici fibro-adipogeniche non è possibile. Per studiare gli effetti sistemici sulla funzionalità MuSC si possono eseguire esperimenti di lesione muscolare seguiti dall'analisi della rigenerazione muscolare in vivo o eseguire esperimenti di trapianto^36,37.

Nel loro insieme, il protocollo di isolamento e coltura della miofibra offre una grande opportunità per studi genetici o meccanicistici su MuSC adulti senza la necessità di modelli murini transgenici e può potenzialmente ridurre la sperimentazione animale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b	ThermoScientific	A-21141	use 1:1000 for IF
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1	ThermoScientific	A-21123	use 1:1000 for IF
chicken embryo extract	Seralab	CE-650-J	chicken embryo extract containing growth factors etc.
collagenase type 1	Sigma	C0130
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate)	GibCo	41966029	cell culture medium
fetal bovine serum	Gibco	10270-106	fetal bovine serum
horse serum	Gibco	26050-088
Lipofectamine RNAiMax	ThermoScientific	13778150	transfection reagent
MyoD antibody clone G-1	Santa Cruz	sc-377460	dilute 1:200 for IF
Pax7 antibody	DSHB	PAX7	use undiluted
siGLO Red Transfection Indicator	horizon discovery	D-001630-02-05	non targeting siRNA