JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Abstract

Le cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico (CAR) hanno mostrato risultati senza precedenti in studi clinici registrativi per pazienti con tumori maligni delle cellule B o mieloma multiplo (MM). Tuttavia, numerosi ostacoli limitano l'efficacia e vietano l'uso diffuso di terapie con cellule T CAR a causa dello scarso traffico e infiltrazione nei siti tumorali e della mancanza di persistenza in vivo. Inoltre, le tossicità potenzialmente letali, come la sindrome da rilascio di citochine o la neurotossicità, sono le principali preoccupazioni. L'imaging e il tracciamento efficienti e sensibili delle cellule T CAR consentono la valutazione del traffico, dell'espansione e della caratterizzazione in vivo delle cellule T e consentono lo sviluppo di strategie per superare gli attuali limiti della terapia con cellule T CAR. Questo documento descrive la metodologia per incorporare il symporter di ioduro di sodio (NIS) nelle cellule T CAR e per l'imaging delle cellule T CAR utilizzando la tomografia ad emissione di tetrafluoroborato-positrone [18F] tetrafluoroborato ([18F] TFB-PET) in modelli preclinici. I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio.

Introduzione

La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR T) è un approccio rapidamente emergente e potenzialmente curativo nelle neoplasie ematologiche1,2,3,4,5,6. Risultati clinici straordinari sono stati riportati dopo la terapia con cellule T CAR T (CART19) o CON l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) CAR T2. Ciò ha portato all'approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti delle cellule CART19 per il linfoma aggressivo a cellule B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblastica acuta (Tisa-Cel)5,8, linfoma a cellule del mantello (brexucabtagene autoleuce)9 e linfoma follicolare (Axi-Cel)10 . Più recentemente, la FDA ha approvato la terapia con cellule T CAR diretta da BCMA in pazienti con mieloma multiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Inoltre, la terapia con cellule T CAR per la leucemia linfocitica cronica (LLC) è in fase avanzata di sviluppo clinico e dovrebbe ricevere l'approvazione della FDA entro i prossimi tre anni1.

Nonostante i risultati senza precedenti della terapia con cellule T CAR, il suo uso diffuso è limitato da 1) insufficiente espansione in vivo delle cellule T CAR o scarso traffico verso i siti tumorali, che porta a tassi più bassi di risposta duratura12,13 e 2) lo sviluppo di eventi avversi potenzialmente letali, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS)14,15 . I segni distintivi della CRS includono non solo l'attivazione immunitaria con conseguente livelli elevati di citochine/chemochine infiammatorie, ma anche la massiccia proliferazione delle cellule T dopo infusione di cellule T CAR15,16. Pertanto, lo sviluppo di una strategia convalidata di livello clinico per l'immagine delle cellule T CAR in vivo consentirebbe 1) il tracciamento delle cellule T CAR in tempo reale in vivo per monitorare il loro traffico verso i siti tumorali e scoprire potenziali meccanismi di resistenza e 2) il monitoraggio dell'espansione delle cellule T CAR e potenzialmente prevedere le loro tossicità come lo sviluppo di CRS.

Le caratteristiche cliniche della CRS lieve sono febbre alta, affaticamento, mal di testa, eruzione cutanea, diarrea, artralgia, mialgia e malessere. Nella CRS più grave, i pazienti possono sviluppare tachicardia/ipotensione, perdita capillare, disfunzione cardiaca, insufficienza renale/epatica e coagulazione intravascolare disseminata17,18. In generale, il grado di elevazione delle citochine, tra cui interferone-gamma, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, interleuchina (IL)-10 e IL-6, ha dimostrato di essere correlato alla gravità dei sintomi clinici17,19. Tuttavia, l'ampia applicazione del monitoraggio delle citochine sieriche "in tempo reale" per prevedere la CRS è difficile a causa dell'elevato costo e della disponibilità limitata. Per sfruttare le caratteristiche benefiche della terapia con cellule T CAR, l'imaging non invasivo delle cellule T adottive può essere potenzialmente utilizzato per prevedere l'efficacia, la tossicità e la ricaduta dopo l'infusione di cellule T CAR.

Diversi ricercatori hanno sviluppato strategie per utilizzare l'imaging a base di radionuclidi con tomografia ad emissione di positroni (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT), che fornisce alta risoluzione e alta sensibilità20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 per il visualizzazione e monitoraggio in vivo del traffico di cellule T CAR. Tra queste strategie di imaging basate su radionuclidi, il symporter di ioduro di sodio (NIS) è stato sviluppato come modalità sensibile per l'immagine di cellule e virus utilizzando scansioni PET31,32. L'imaging delle cellule T NIS+CAR con [18F]TFB-PET è una tecnologia sensibile, efficiente e conveniente per valutare e diagnosticare l'espansione, il traffico e la tossicità delle cellule T CAR30. Questo protocollo descrive 1) lo sviluppo di cellule T NIS+CAR attraverso la doppia trasduzione ad alta efficacia e 2) una metodologia per l'imaging di cellule T NIS+CAR con scansione [18F]TFB-PET. Le cellule T BCMA-CAR per MM sono utilizzate come modello proof-of-concept per descrivere NIS come reporter per l'imaging delle cellule T CAR. Tuttavia, queste metodologie possono essere applicate a qualsiasi altra terapia con cellule T CAR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic, del Comitato istituzionale per la biosicurezza e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.

1. Produzione di cellule T NIS+ BCMA-CAR

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 17-008762) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).

  1. Produzione di BCMA-CAR, NIS e lentivirus codificanti per la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP).
    NOTA: Un costrutto BCMA-CAR di seconda generazione è stato sintetizzato de novo (vedi la Tabella dei materiali) e clonato in un vettore lentivirale di terza generazione sotto il controllo di un promotore alfa (EF-1α) del fattore di allungamento-1. Il costrutto BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) includeva la costimulazione 4-1BB e un frammento variabile a catena singola (scFv) derivato da un clone di anticorpi BCMA anti-umani C11D5.333,34. Il NIS è sotto il controllo del promotore EF-1α e si lega al gene di resistenza alla puromicina tramite peptidi auto-scissioni (P2A). Il vettore lentivirale che codifica per la luciferasi-GFP (vedi la Tabella dei materiali) viene utilizzato per trasdurre le cellule tumorali, che poi esprimono GFP e luciferasi.
    1. Preparare plasmidi vettori lentivirali: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOTA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contengono il gene della resistenza alla puromicina. Pertanto, le cellule trasdotte da NIS o luciferasi-GFP possono essere selezionate con 1 μg/mL o 2 μg/mL di puromicina dicloridrato, come descritto in precedenza14,35.
    2. Seminare 20 × 106 di cellule 293T in un matraccio T175 e incubare per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2. Confermare che le cellule 293T sono distribuite uniformemente sul pallone al 70-90% di confluenza mediante visualizzazione diretta al microscopio.
    3. Preparare un mix principale di 15 μg del vettore di espressione (ad esempio, CAR, NIS o DNA lineare luciferasi-GFP), 7 μg del vettore di inviluppo (VSV-G) e 18 μg del vettore di imballaggio (gag, pol, rev e tat). Diluire la miscela master di DNA in 4,5 mL del mezzo di trasfezione, quindi aggiungere 111 μL del reagente pre-complessante (Miscela A).
    4. Preparare un nuovo tubo e diluire 129 μL del reagente di trasfezione liposomiale in 4,5 mL del mezzo di trasfezione (Miscela B).
    5. Unire le miscele A e B e scorrere il tubo per mescolare il contenuto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
    6. Dopo l'incubazione, è sufficiente aspirare il surnatante cellulare senza staccare le cellule e aggiungere 16 ml di un mezzo di crescita contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina-glutammina. Quindi, aggiungere la miscela di miscele A e B su celle 293T a goccia. Infine, incubare le cellule trasfettate a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
    7. Nei giorni 1 e 2 post-trasfezione, raccogliere il surnatante di 293T, girare a 900 × g per 10 minuti e filtrare attraverso un filtro in nylon da 0,45 μm. Concentrare il filtrato a 24 e 48 ore per ultracentrifugazione a 112.700 × g per 2 ore e congelare a -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolamento delle cellule T (Figura 1)
    NOTA: Eseguire tutti i lavori di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare utilizzando la tecnica asettica e i dispositivi di protezione individuale. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono raccolte dal sangue di un donatore volontario sano raccolto durante l'aferesi36. Lo screening dei patogeni è stato eseguito su cellule umane utilizzate in questo studio.
    1. Utilizzare la tecnica del gradiente di densità standard per isolare i PBMC.
      1. Aggiungere delicatamente 15 mL di gradiente di densità medio (densità di 1,077 g/mL) (contenente alfa-D-glucopiranoside, beta-D-fruttofuranosil omopolimero e 3-(acetilammino)-5-(acetilmetilammino)-sale monosodico dell'acido alfa-D-4,6-triodobenzoico) a un tubo di separazione a gradiente di densità di 50 ml senza creare bolle d'aria (vedere la tabella dei materiali).
      2. Per evitare l'intrappolamento cellulare, diluire il campione di sangue con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 0,2 g/L di cloruro di potassio, 0,2 g/L di fosfato di potassio monobasico, 8 g/L di cloruro di sodio e 1,15 g/L di fosfato di sodio bibasico) contenente il 2% di FBS con un rapporto di volume 1:1. Trasferire delicatamente il sangue diluito sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità senza rompere l'interfaccia tra i due. Spin down a 1.200 × g per 10 minuti a RT.
        NOTA: un tubo di separazione del gradiente di densità di 50 mL può essere utilizzato per l'isolamento di 4-17 mL di un campione di sangue. Il tubo di separazione del gradiente di densità di 50 ml (vedi tabella dei materiali) utilizzato in questo protocollo non richiede il "brake off" durante la centrifugazione. Tuttavia, quando si utilizzano tubi standard da 50 ml, il freno deve essere spento e richiede una centrifugazione di 30 minuti.
      3. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico da 50 mL, lavare con PBS + 2% FBS riempiendo fino a 50 mL, quindi girare verso il basso a 300 × g per 8 minuti a RT.
      4. Aspirare il surnatante e risospendere le celle pellettate in 50 ml di PBS + 2% FBS. Contare il numero di celle e quindi girare verso il basso a 300 × g per 8 minuti a RT. Ripetere il passaggio precedente per un totale di 2 lavaggi.
    2. Aspirare il surnatante e risospesciare le cellule pellettate ad una concentrazione di 50 × 106 cellule/ml con PBS + 2% FBS.
    3. Eseguire l'isolamento delle cellule T dai PBMC utilizzando un kit di perline magnetiche a selezione negativa.
      NOTA: Un kit di selezione negativo ideale include perline magnetiche attaccate agli anticorpi contro gli antigeni espressi su cellule diverse dalle cellule T. Un kit comunemente usato contiene anticorpi coniugati a perline magnetiche contro CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 e CD16 (vedi Tabella dei materiali).
      1. Trasferire i PBMC in un tubo a fondo tondo in polistirene da 14 mL. Quindi, posizionare i PBMC e il cocktail di anticorpi di selezione negativa in un separatore cellulare completamente automatizzato ed eseguire l'isolamento delle cellule T secondo il protocollo del produttore.
  3. Stimolazione delle cellule T ed espansione delle cellule T (Figura 1)
    1. Per coltivare le cellule T isolate, preparare il mezzo di espansione delle cellule T (MTC) realizzato con mezzo cellulare ematopoietico privo di siero integrato con il 10% di albumina sierica umana e l'1% di penicillina-streptomicina-glutammina14. Dopo l'isolamento delle cellule T, contare le cellule e la coltura ad una concentrazione di 2 × 106 cellule / mL con MTC.
    2. Lavare le perline anti-CD3/CD28 tre volte con TCM prima di coltivarle con cellule T.
      1. Mescolare il flaconcino contenente le perline ruotando. Quindi, pipettare il volume richiesto di perline (3:1 perline:cellule) (ad esempio, quando si stimolano 1,0 × 106 cellule di cellule T, utilizzare 3,0 × 106 di perline anti-CD3/CD28) in un tubo microcentrifuga sterile (1,5 ml) e risospesso in 1 mL di MTC.
    3. Posizionare il tubo microcentrifuga con le perline su un magnete per 1 minuto e aspirare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospesciare le perline lavate in 1 mL di MTC. Ripetere i due passaggi precedenti per un totale di 3 lavaggi.
    4. Risospendare le perline in 1 mL di MTC e trasferirle alle cellule T. Quindi, diluire le cellule T ad una concentrazione finale di 1,0 × 106 cellule / mL con MTC. Trasferire la sospensione di cellule T/perline in una piastra a 6 pozzetti trattata con colture tissutali e posizionarla nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
  4. Titolazione dei lentivirus (Figura 2)
    1. Preparare le cellule T per il test di titolazione. Assicurarsi che siano disponibili circa 1,0 x 106 cellule per titolare un tipo di virus.
    2. Stimolare le cellule T come descritto al paragrafo 1.3.2.
    3. La piastra 1.0 × 105 cellule di cellule T stimolate in una piastra a 96 pozzetti (piastra del titolo) e incubare a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore (Figura 2A). Isolare e stimolare le cellule T come descritto al paragrafo 1.2.
    4. Preparare una piastra di diluizione (piastra a 96 pozzetti) aggiungendo 100 μL di MTC nei pozzetti delle colonne designate e dei pozzetti di controllo non trasdotti (Figura 2B).
    5. Scongelare una fiala di particelle lentivirali sul ghiaccio e pipettare delicatamente su e giù per mescolare bene. Trasferire 50 μL del surnatante virale nei pozzetti della colonna 6 della piastra a 96 pozzetti (diluizione 3) (Figura 2B). Pipetta su e giù per mescolare bene.
    6. Eseguire diluizioni seriali (diluizione seriale 2 volte): trasferire 50 μL dal pozzo A6 al pozzo B6 e poi 50 μL dal pozzo B6 al pozzo C6; ripetere fino a G6. Quindi, aggiungere 50 μL del virus diluito alla piastra del titolo (Figura 2B).
    7. Incubare la piastra del titolo a 37 °C, 5% CO2 per 48 ore e determinare le percentuali di cellule CAR-, NIS-, o GFP-positive mediante citometria a flusso (Figura 2C).
      1. Lavare i pozzetti ruotando la piastra del titolo due volte a 650 × g a 4 °C per 3 minuti.
      2. Macchiare le cellule T trasdotte come descritto nei passaggi da 1.5.3 a 1.5.9.
      3. Determinare i titoli in base alle percentuali di cellule CAR-, NIS- o GFP-positive usando la formula (1):
        Titoli = Percentuale di cellule T BCMA-CAR+ o NIS+ × conta delle cellule T alla trasduzione × diluizione / volume specifico (1)
  5. Trasduzione di lentivirus e NIS+Espansione delle cellule T BCMA-CAR
    1. Da ventiquattro a 48 ore dopo la stimolazione delle cellule T, eseguire la trasduzione lentivirale sulle cellule T stimolate (le cellule T dovrebbero formare cluster).
      1. Scongelare i lentivirus congelati che codificano CAR o NIS a 4 °C.
      2. Mescolare bene le cellule T stimolate per rompere i cluster e aggiungere semplicemente il virus appena scongelato a una molteplicità di infezione (MOI) di 5,0 (quando si trasducono 1,0 × 106 cellule T, utilizzare 5,0 × 106 di lentiviri). Incubare le cellule trasdotte a 37 °C, 5% CO2.
      3. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T trasdotte utilizzando un ematocitometro37 o un contatore cellulare completamente automatizzato38 e regolare la concentrazione cellulare a 1,0 × 106 cellule / mL aggiungendo MTC fresca e preriscaldata. Per le cellule T trasdotte da NIS che trasportano il gene di resistenza alla puromicina, trattare le cellule con 1 μg / mL di puromicina dicloridrato nei giorni 3, 4 e 5.
    2. Il giorno 6, rimuovere le perle anti-CD3/CD28 dalle cellule T trasdotte (dal passo 1.3.4) mescolando bene per rompere i cluster di cellule T e mettendole in un magnete per 1 minuto. Quindi, è sufficiente riposizionare le cellule T trasdotte raccolte in coltura ad una concentrazione di 1,0 × 106 cellule / ml. Dopo aver rimosso le perline dalle cellule T, valutare l'espressione di CAR e NIS mediante citometria a flusso.
      NOTA: Poiché il frammento variabile a catena singola del BCMA-CAR è derivato dal topo, può essere colorato con IgG anti-topo di capra (H + L) coniugato con Alexa Fluor 647. I NIS possono essere rilevati utilizzando ETNL anti-umano [peptide sintetico corrispondente ad aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Questo anticorpo riconosce il C-terminus citosolico di NIS. Pertanto, le cellule T devono essere permeabilizzate prima dell'incubazione con un anticorpo anti-umano NIS.
    3. Eseguire la colorazione superficiale di BCMA-CAR utilizzando IgG anti-topo di capra (H + L).
      1. Prelevare un'aliquota della coltura (ad esempio, 50.000 cellule T) e lavare con tampone di flusso (PBS, 1% FBS e 1% azide di sodio). Successivamente, risospese le cellule con 50 μL di tampone di flusso e colorare le cellule con 1 μL di anticorpo anti-topo di capra per rilevare l'espressione di CAR e 0,3 μL di acqua morta viva per escludere le cellule morte.
      2. Incubare per 15 minuti al buio a RT, lavare le cellule aggiungendo 150 μL di tampone di flusso e centrifugare le celle a 650 × g per 3 minuti a 4 °C.
    4. Dopo la colorazione CAR superficiale, fissare e permeabilizzare le cellule aggiungendo 100 μL di mezzo di fissazione (PBS con formaldeide al 4,21%) e incubare per 20 minuti a 4 °C. Lavare le cellule due volte con 100 μL di un tampone che contiene un agente permeabilizzante cellulare come la saponina (650 × g per 3 minuti a 4 °C).
    5. Risospendare le cellule fisse/permeabilizzate in 50 μL di tampone permeabilizzante. Quindi, aggiungere 0,3 ng di anticorpo anti-umano ETNL NIS in 50 μL di tampone di flusso e incubare per 1 ora a 4 °C.
    6. Aggiungere 150 μL di flow buffer e centrifugare le celle a 650 × g per 3 min a 4 °C. Incubare le cellule con 2,5 μL di anticorpo secondario anti-coniglio in 50 μL di flow buffer per 30 min a 4 °C, lavare le cellule aggiungendo 150 μL di flow buffer e centrifugare a 650 × g per 3 min a 4 °C.
    7. Infine, sospendere 200 μL di tampone di flusso ed eseguire la citometria a flusso per determinare l'efficienza di trasduzione (Figura 3A,B).
    8. Il giorno 8, contare e far girare le cellule T a 300 × g per 8 minuti a 4 °C. Risospendare le cellule T con mezzo di congelamento (90% FBS + 10% dimetilsolfossido [DMSO]) ad una concentrazione di 10 × 106/mL, quindi trasferire 1 mL ciascuna a crioviali marcate.
    9. Mettere i flaconcini in un congelatore a -80 °C per 48 ore. Dopo 48 ore (ed entro il giorno 10), trasferire le cellule T in azoto liquido.
      NOTA: vedere la Figura 1 per una panoramica della produzione di cellule T NIS+ CAR. La Figura 3D rappresenta esempi di espansione ex vivo delle cellule T da tre diversi donatori.

2. Imaging delle cellule T NIS+ BCMA-CAR con scansione [ 18F]TFB-PET

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB e IBC (Bios00000006.04). OPM-2 è una linea cellulare BCMA+ MM, che viene spesso utilizzata come linea cellulare target per le cellule T BCMA-CAR39,40.

  1. Stabilire cellule di luciferasi + BCMA + OPM-2.
    1. Semina 500.000 cellule OPM-2 in una piastra a 24 pozzetti trattata con colture tissutali. Scongelare il lentivirus che codifica per la luciferasi-GFP a 4 °C.
    2. Aggiungere il virus appena scongelato a un MOI di 3.0 alle cellule OPM-2 e mescolare bene mediante pipettaggio. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
    3. Quarantotto ore dopo la trasduzione, aggiungere 2 μg/mL di puromicina per selezionare le cellule trasdotte. Quattro giorni dopo la trasduzione, valutare le cellule GFP-positive (luciferasi-positiva) mediante citometria a flusso (Figura 3E).
  2. Stabilire modelli murini di xenotrapianto BCMA+ OPM-2 (Figura 4).
    1. Contare le cellule di luciferasi + OPM-2 e ruotarle due volte per rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare. Risospese le cellule OPM-2 ad una concentrazione di 10 × 106 cellule/mL con PBS.
    2. Il giorno -21, iniettare 100 μL (1,0 × 106 cellule) di cellule di luciferasi + OPM-2 nelle code di topi IMMUNOCOMPROMESSI NOD-SCID IL2rγnull (NSG) di 8-12 settimane (Figura 4).
    3. Il giorno 20 dopo l'iniezione di cellule OPM-2 (giorno -1 dell'iniezione di cellule T CAR), controllare il carico tumorale tramite imaging a bioluminescenza (BLI) (Figura 4).
      NOTA: le cellule OPM-2 formano un tumore a crescita lenta, che di solito richiede 2-3 settimane per attecchirsi.
    4. Somministrare 10 μL/g di D-luciferina a topi xenotrapianto OPM-2 tramite iniezione intraperitoneale (IP). Dopo 10 minuti, eseguire BLI sui topi sotto il 2% di gas isoflurano (Figura 5A). Dopo aver confermato l'attecchimento del tumore, randomizzare i topi in base al carico tumorale.
    5. Il giorno -1 dell'iniezione delle cellule T CAR, scongelare le cellule T NIS+BCMA-CAR e rimuovere il mezzo di congelamento mediante centrifugazione (300 × g, 8 min, 4 °C). Quindi, le cellule risospese con MTC a 2,0 × 106 cellule / mL e incubano durante la notte (37 ° C, 5% CO2).
    6. Il giorno 0, contare e centrifugare le cellule T NIS+BCMA-CAR (300 × g, 8 min, 4 °C). Sospendere le cellule T NIS+BCMA-CAR a 50 × 106 cellule/mL con PBS.
    7. Somministrare 100 μL (5,0 × 106 cellule) di cellule T NIS+BCMA-CAR tramite iniezione della vena della coda ai topi xenotrapianto OPM-2. Nei giorni 7 e 15, immagina i topi usando una scansione PET.
  3. Imaging in vivo delle cellule T NIS+BCMA-CAR utilizzando il modello murino con xenotrapianto BCMA+OPM-2.
    1. Pesare i mouse prima dell'imaging e rimuovere eventuali marchi auricolari metallici per eliminare gli artefatti relativi al metallo.
    2. Preparare [18F]TFB come descritto in precedenza41.
      NOTA: [18F]TFB deve essere prodotto il giorno del suo utilizzo. La purezza radiochimica deve essere >99% e l'attività molare >5 GBq/mmol.
    3. Iniettare 9,25 MBq [18F]TFB per via endovenosa tramite iniezione della vena della coda. Consentire un periodo di assorbimento di ~ 40 minuti per la distribuzione del radiotracciante nel corpo e liberare il sangue.
    4. Anestetizzare il topo usando l'inalazione di isoflurano (2%).
      NOTA: L'isoflurano è l'anestetico inalato preferito in quanto ha un esordio e un recupero rapidi e affidabili.
    5. Prima di anestetizzare il mouse, pulire tutte le superfici della macchina per anestesia con detergenti disinfettanti.
    6. Posizionare il mouse all'interno della camera di induzione. Ruotare il quadrante del vaporizzatore al 2% e attendere che il mouse diventi reclinato e non reattivo entro 1-2 minuti.
    7. Monitorare il mouse per evitare un'anestesia insufficiente o un'eccessiva depressione delle funzioni respiratorie. In breve, pizzicare la punta per confermare l'anestesia insufficiente.
      NOTA: la frequenza respiratoria normale è fino a 180 / min e il tasso di caduta accettabile è del 50%.
    8. Applicare unguento oftalmico per evitare l'essiccazione corneale e traumi.
    9. Acquisire immagini PET/CT 45 minuti dopo l'iniezione con il mouse anestetizzato in una workstation di imaging micro PET/CT (vedere la Tabella dei materiali). Successivamente, acquisire immagini PET statiche per 15 minuti seguite dall'acquisizione di immagini CT per 5 minuti con rotazione a 360 ° e 180 proiezioni a 500 μA, 80 keV e 200 ms di esposizione.
  4. Analisi dei dati di imaging acquisiti
    1. Analizzare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini PET (Figura 5B e Video supplementare S1).
    2. Definire il volume di interesse (VOI).
    3. Calcola il valore di assorbimento standardizzato (SUV) utilizzando la formula (2).
      SUV in VOI = Concentrazione di attività in VOI (MBq/mL) × peso corporeo (g) / dose somministrata (MBq) (2)
  5. Conferma del traffico di cellule T NIS+BCMA-CAR verso i siti tumorali con la citometria a flusso
    1. Dopo l'imaging [18F]TFB-PET, riposizionare il mouse nella gabbia. Dopo la cessazione dell'anestesia, monitorare gli animali fino a quando non sono in grado di muoversi in modo mirato e assicurarsi che abbiano accesso al cibo e all'acqua.
    2. Monitorare i topi fino al decadimento del [18F]TFB iniettato. Una volta che il radioisotopo non è rilevabile, eutanasizzare i topi con CO2.
    3. Per l'eutanasia, metti i topi nella gabbia (non più di 5 topi per gabbia).
    4. Esporre i topi alla CO2 fino alla completa cessazione della respirazione in circa 5-10 minuti.
      NOTA: Questo metodo di eutanasia deve essere coerente con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali (edizione 2020).
    5. Per garantire la morte dei topi, eseguire la lussazione cervicale afferrando la parte posteriore della testa e la base della coda dell'animale, quindi allontanando le mani l'una dall'altra.
    6. Raccogliere il midollo osseo per confermare che le cellule T NIS+BCMA-CAR trafficano in modo efficiente verso il sito tumorale.
    7. Trasferire i femori e le tibie raccolti in una piastra a 6 pozzetti contenente 5 ml di terreno di coltura cellulare. Rimuovere i muscoli e i tendini dai femori e dalla tibia e tagliare semplicemente entrambe le estremità (sopra le articolazioni) dei femori e della tibia.
    8. Riempire una siringa da insulina con il terreno di coltura cellulare e lavare il midollo osseo sulla piastra a 6 pozzetti. Per i femori, utilizzare aghi da 22 G e siringhe da 5 ml perché il diametro del femore è maggiore di quello della tibia.
    9. Utilizzare l'estremità piatta dello stantuffo per macinare il midollo osseo. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo conico sterile da 50 ml e filtrare il midollo osseo macinato. Quindi, riempire il tubo con il tampone di flusso e centrifugare il tubo a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
    10. Aspirare il surnatante e risospesciare il midollo osseo con 5 ml di tampone di flusso. Trasferire 200 μL di midollo osseo in una piastra a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 300 × g per 3 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospescere le cellule con 50 μL di tampone di flusso.
    11. Macchiare il midollo osseo con anticorpi di flusso contro 0,25 μg di CD45 di topo, 0,03 μg di CD45 umano, 0,06 μg di CD3 umano, 0,24 μg di BCMA umano e 0,3 μL di acqua viva / morta. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
    12. Centrifugare la piastra a 300 × g per 3 min a 4 °C. Quindi, aggiungere 200 μL di buffer di flusso ed eseguire sul citometro a flusso (Figura 5C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

La Figura 1 illustra le fasi di generazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Il giorno 0, isolare i PBMC e quindi isolare le cellule T mediante selezione negativa. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28. Il giorno 1, trasdurre le cellule T con lentivirus NIS e BCMA-CAR. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T e nutrirsi con i mezzi per regolare la concentrazione in modo che sia 1,0 × 106 / ml. Per le cellule T trasdotte da NIS, aggiungere 1 μg/mL di...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Questo documento descrive una metodologia per incorporare NIS nelle cellule T CAR e l'imaging infuso di cellule T CAR in vivo attraverso [18F] TFB-PET. Come prova di concetto, le cellule T NIS + BCMA-CAR sono state generate tramite doppia trasduzione. Abbiamo recentemente riferito che l'incorporazione di NIS nelle cellule T CAR non compromette le funzioni e l'efficacia delle cellule T CAR in vivo e consente il traffico e l'espansione delle cellule T CAR30. P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

SSK è un inventore di brevetti nell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis) e Mettaforge (attraverso Mayo Clinic). RS, MJC e SSK sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen. SSK riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen. Le figure sono state create con BioRender.com.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso la pipeline Mayo Clinic K2R (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e la Predolin Foundation (RS). Le figure 1, 2 e 4 sono state create con BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Riferimenti

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973(2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064(2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629(2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209(2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Cancer ResearchCAR T cellNIS reporter18F TFB PETimaging non invasivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati