Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

Riepilogo

Qui presentiamo procedure chirurgiche raffinate sull'esecuzione con successo del trapianto intraportale di isole, una procedura chirurgica clinicamente rilevante ma tecnicamente impegnativa, nei topi.

Abstract

Sebbene il fegato sia attualmente accettato come sito di trapianto primario per le isole umane in contesti clinici, le isole vengono trapiantate sotto la capsula renale nella maggior parte degli studi di trapianto di isole precliniche di roditori. Questo modello è comunemente usato perché il trapianto di isole intraepatiche murine è tecnicamente impegnativo e un'alta percentuale di topi potrebbe morire per complicazioni chirurgiche, in particolare sanguinamento dal sito di iniezione post-trapianto. In questo studio, vengono dimostrate due procedure che possono ridurre al minimo l'incidenza di sanguinamento della vena porta post-infusione. Il primo metodo applica una spugna di gelatina emostatica assorbibile al sito di iniezione, e il secondo metodo prevede la penetrazione dell'ago per iniezione dell'isolotto attraverso il tessuto adiposo prima e poi nella vena porta utilizzando il tessuto adiposo come barriera fisica per fermare il sanguinamento. Entrambi i metodi potrebbero prevenire efficacemente la morte del topo indotta dal sanguinamento. Sono state presentate l'intera sezione epatica che mostra la distribuzione delle isole e l'evidenza di trombosi delle isole post-trapianto, una caratteristica tipica per il trapianto di isole intraepatiche. Questi protocolli migliorati perfezionano le procedure di trapianto intraepatico di isole e possono aiutare i laboratori a impostare la procedura per studiare la sopravvivenza e la funzione delle isole in contesti pre-clinici.

Introduzione

Il trapianto intraportale di isole (IIT) attraverso la vena porta è il metodo più comunemente usato per il trapianto di isole umane in contesti clinici. Il modello IIT murino offre una grande opportunità per studiare il trapianto di isole e testare approcci interventistici promettenti che possono migliorare l'efficacia del trapianto di ^isole1. IIT è stato descritto per la prima volta nel 1970 e utilizzato da diversi gruppi1,2,3,4,5. Ha riacquistato popolarità dopo la svolta nel trapianto di isole umane nell'anno 20006,7. Tuttavia, la maggior parte degli studi sul trapianto di isole ha utilizzato la capsula renale come sito preferito per il trapianto sperimentale di isole grazie al suo facile successo. Al contrario, l'IIT è più tecnicamente impegnativo e meno frequentemente utilizzato per gli studi sui trapianti di ^isole8,9. A differenza dell'IIT, tuttavia, le isole trapiantate sotto la capsula renale non soffrono della reazione infiammatoria immediata mediata dal sangue caratterizzata da trombosi, infiammazione e ischemia del tessuto epatico, e quindi hanno una funzione migliore rispetto alle isole trapiantate nel fegato. Il modello di capsula renale, quindi, potrebbe non imitare completamente gli stress incontrati dalle isole nel trapianto di isole umane10,11,12.

Una delle principali complicanze dell'IIT nei topi è il sanguinamento dal sito di iniezione dopo il trapianto, che potrebbe causare il 10-30% della mortalità tra diversi ceppi di ^topo12. In questo articolo, sono stati sviluppati due approcci raffinati per fermare il sanguinamento in modo più rapido e sicuro e per ridurre la mortalità dei topi dopo un IIT. La dimostrazione visiva di questi dettagli raffinati aiuterà i ricercatori a identificare i passaggi chiave di questa procedura tecnicamente impegnativa. Inoltre, la posizione degli innesti di isole nel fegato del ricevente è stata determinata dall'esame istologico del tessuto epatico colorato di ematossilina ed eosina (H & E) (intera sezione) recante isole trapiantate.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte con l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso la Medical University of South Carolina e il Ralph H Johnson Medical Center di Charleston.

1. Induzione del diabete con streptozotocina (STZ)

1. Preparazione dei topi riceventi:
   1. Pesare tutti i topi individualmente.
   2. Controllare i livelli di glucosio nel sangue da un campione di sangue della vena della coda utilizzando un glucometro.
2. Determinazione della dose STZ per tre diversi scenari:
   1. Per i topi con steatosi epatica iniettare una dose di STZ [40 mg/kg/die, iniezione intraperitoneale (i.p.)] per 5 giorni consecutivi.
   2. Per i topi NOD-SCID iniettare 125 mg/kg di STZ, iniezione singola, cioè dopo digiuno notturno.
   3. Per i topi C57BL/6 iniettare 225 mg/kg di STZ, iniezione singola, i.p.
3. Calcoli per STZ (13,5 mg/mL):
   NOTA: Questo calcolo è per cinque topi C57BL/6 con pesi corporei di 30 g:
   1. Pesi corporei totali: 5 topi x 30 g/mouse = 150g
   2. STZ necessario: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
4. Preparazione STZ:
   1. Pesare l'STZ seguendo la dose precalcolata.
   2. Trasferire la polvere STZ pesata in un becher da 10 ml su ghiaccio.
   3. Aggiungere 3 mL di soluzione di citrato di sodio al becher per sciogliere l'STZ.
   4. Mescolare bene, filtrare sterilizzare attraverso un poro di 0,22 μm e utilizzare la soluzione STZ entro 10 minuti dalla preparazione.
5. Iniezione STZ:
   1. Caricare la quantità desiderata di soluzione STZ (sufficiente per un mouse) in una siringa da 1 mL.
   2. Eseguire l'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore destro dell'addome del topo.
   3. Osservare i topi per 5 minuti dopo l'iniezione e verificare eventuali segni di disagio durante questo periodo di tempo prima di rimetterli nelle gabbie.
   4. Monitorare il livello di glucosio nel sangue da un campione di sangue della vena della coda utilizzando un glucometro ogni giorno dopo l'iniezione di STZ.
      NOTA: In questo esperimento, i topi sono considerati diabetici quando la glicemia non a digiuno è > 350 mg / dL per due giorni consecutivi.

2. Preparazione dell'isolotto

NOTA: le isole umane sono state coltivate in mezzi CMRL-1066 integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) ad una densità di 10.000 isole equivalenti (IEQ) per piatto di coltura cellulare da 100 ^mm9. Le isole di topo sono state coltivate in DMEM con il 10% di FBS e l'1% di P/S con la stessa ^densità13. I topi maschi NOD-SCID e C57BL/7 tra le 6-10 settimane di età sono stati ottenuti da fonti commerciali.

1. Staccare gli isolotti coltivati dal piatto di coltura cellulare con un leggero graffio.
2. Selezionare a mano il numero desiderato di isole (ad esempio, 300-350 isole) utilizzando una siringa da 1 cc e metterle in tubi microcentrifuga sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.
3. Ruotare il tubo per 10 secondi usando la microcentrifuga.
4. Rimuovere il surnatante, lasciando un po' di liquido per evitare di perdere il pellet.
5. Sospendere il pellet in 200 μL di HBSS con lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA).
6. Aspirare le isole risospese in una siringa da insulina da 0,5 ml.
7. Posizionare la siringa in posizione verticale. Lascia che gli isolotti affondino per 1 minuto.
8. Spingere la siringa per rimuovere tutte le bolle, lasciando circa 100-150 μL di liquido contenente isole.
9. Posizionare la siringa a testa in giù e picchiettare delicatamente il lato della siringa per consentire alle isole di distribuirsi equamente in tutto il liquido. Le isole sono ora pronte per l'iniezione.

3. Trapianto di isole

1. Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con il 2% di isoflurano. Controllare la mancanza di riflessi del pedale per garantire una corretta anestesia dell'animale.
2. Rasare e rimuovere la pelliccia nella zona dell'addome del mouse.
3. Somministrare una singola dose pre-operatoria di Buprenorfina (0,1 mg/kg p.p.).
4. Disinfettare l'area chirurgica con tre salviette alternate di iodio al 2% e alcol al 75%.
5. Eseguire una laparotomia con micro forbici per generare un'incisione di 1-1,5 cm.
6. Aprire la cavità peritoneale con un riavvolgitore. Seguire con il metodo A o il metodo B come descritto di seguito.

4. Metodo A: (smettere di sanguinare con schiuma gel, Figura 1A)14,15,16

1. Preparazione del mouse
   1. Posizionare una garza sterile intorno all'incisione.
   2. Estrarre delicatamente l'intestino usando una pinza e tenerlo sulla garza.
   3. Identificare la vena porta dalla sua posizione ed esporla bene.
   4. Coprire l'intestino con una garza calda umido salino durante l'intero intervento chirurgico.
2. Inserire l'ago della siringa per insulina precaricato sull'isolotto attraverso la vena porta vicino al duodeno (Figura 1B). Per fare ciò, tenere l'ago con il foro (smussatura) rivolto verso il basso e posizionare l'angolo della superficie di apertura parallelo alla parete della vena porta prima di penetrare attraverso la parete.
   1. Tirare lo stantuffo per prelevare un po ' di sangue (20-50 μL) nella siringa per mescolare prima le isole.
   2. Infondere lentamente gli isolotti nella vena porta mentre si tira e si spinge ripetutamente il tuffo.
   3. Posizionare un pezzo di schiuma gel (circa 0,5 cm x 0,5 cm di dimensione) per coprire il sito di iniezione.
   4. Premere la schiuma di gel verso il basso con una punta di cotone mentre si estrae l'ago dalla vena porta.
   5. Continuare a premere sul gel per circa 2 minuti per confermare che non vi è alcun sanguinamento attivo.
   6. Capovolgere la punta di cotone sopra e lontano dalla schiuma di gel per assicurarsi che la schiuma di gel copra bene la vena porta.

5. Metodo B: (smettere di sanguinare con cuscinetto di grasso, Figura 1C)¹⁷

1. Esporre accuratamente la vena porta.
   1. Utilizzare due punte di cotone per tenere la vena porta esposta sia dal lato sinistro che da quello destro.
   2. Identificare il cuscinetto di tessuto adiposo tra il duodeno e la vena porta.
   3. Penetrare attraverso il cuscinetto di grasso prima di inserire l'ago nella vena porta (Figura 1D).
   4. Infondere gli isolotti, seguendo la procedura simile sopra descritta nelle parti 4.2.1 e 4.2.2 del metodo A.
   5. Estrarre l'ago mentre si preme sul grasso con una punta di cotone.
   6. Continuare a premere sul cuscinetto grasso per 1 minuto dopo aver rimosso l'ago.
2. Dopo aver confermato che non vi è alcun sanguinamento dalla vena porta, riportare delicatamente l'intestino nella cavità peritoneale nella sua posizione originale.
3. Lasciare 0,5 ml di soluzione salina calda (36-37 °C) nella cavità addominale prima della chiusura.
   NOTA: La soluzione salina calda facilita il movimento e il recupero dell'intestino post-operatorio e previene la necrosi intestinale.
4. Chiudere lo strato muscolare con una sutura 5-0.
5. Chiudere lo strato di pelle con una sutura 4-0.
6. Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante fino a completo recupero dall'anestesia.
7. Continuare a fornire un analgesico (ad esempio, buprenorfina 0,1 mg / kg i.p.) ogni 12 ore e calore supplementare per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
   NOTA: La procedura di trapianto di isole richiede circa 15-20 minuti per essere completata.

6. Colorazione H & E e fotografia dell'intera sezione epatica

1. Perfusione epatica
   1. Mettere il mouse in anestesia come descritto sopra nella parte 3.1.
   2. Esporre con attenzione la vena porta e tagliare la vena cava inferiore.
   3. Perfondere manualmente il fegato utilizzando 20 ml di paraformaldeide al 10% attraverso la vena porta per circa 5 minuti, utilizzando una siringa da 20 ml con ago da 25 ^G18.
      NOTA: La perfusione epatica può rimuovere il sangue dal tessuto epatico e migliorare la fissazione del fegato senza disturbare gli innesti di isole.
   4. Sezionare l'intero fegato perfuso da altri organi.
   5. Fissare il tessuto epatico perfuso in paraformaldeide al 10% per 24 ore.
   6. Incorporare il tessuto nella paraffina.
   7. Tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore ciascuna e metterle su un vetrino per la colorazione.
   8. Eseguire la colorazione di H&E, insulina, fibrina e neutrofili polimorfonucleati (PMN) utilizzando metodi ^{standard15,16}.
   9. Scansiona l'intera sezione epatica al microscopio.

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Risultati

Abbiamo eseguito trapianti di isole singeniche e xenogeniche attraverso la vena porta. La funzione dell'innesto di isole è stata osservata in modo dose-dipendente in entrambi i modelli di trapianto di isole. Nel modello di trapianto di isole singeniche utilizzando topi C57BL/6, il trapianto di 250 isole ha portato a normoglicemia transitoria prima che i topi tornassero all'iperglicemia. I topi che ricevevano 500 isole hanno raggiunto e mantenuto la normoglicemia oltre i 30 giorni dopo il trapianto (...

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Discussione

In questo studio, sono state dimostrate due procedure migliorate che possono prevenire il sanguinamento e possono ridurre la mortalità del topo durante l'IIT del topo. Questo studio consente ai ricercatori di visualizzare il modello di trapianto di isole che è unico nello studio della risposta infiammatoria istantanea mediata dal sangue dopo il trapianto. Il modello IIT è un modello distintivo per lo studio della sopravvivenza delle cellule insulari e delle lesioni ischemiche epatiche in risposta al trapianto di

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416