Chirurgia ed elaborazione dei campioni per l'imaging correlativo della valvola polmonare murina

Riepilogo

Qui, descriviamo un flusso di lavoro correlativo per l'escissione, la pressurizzazione, la fissazione e l'imaging della valvola polmonare murina per determinare la conformazione grossolana e le strutture locali della matrice extracellulare.

Abstract

Le cause alla base della malattia correlata alle valvole cardiache (HVD) sono sfuggenti. I modelli animali murini forniscono uno strumento eccellente per studiare l'HVD, tuttavia, le competenze chirurgiche e strumentali necessarie per quantificare con precisione la struttura e l'organizzazione su più scale di lunghezza hanno stentato il suo avanzamento. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della dissezione murina, della colorazione in blocco, dell'elaborazione del campione e delle procedure di imaging correlative per rappresentare la valvola cardiaca a diverse scale di lunghezza. La pressione idrostatica transvalvolare è stata utilizzata per controllare l'eterogeneità temporale fissando chimicamente la conformazione della valvola cardiaca. La tomografia microcinesca (μCT) è stata utilizzata per confermare la geometria della valvola cardiaca e fornire un riferimento per l'elaborazione del campione a valle necessaria per la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM). Le immagini SEM seriali ad alta risoluzione della matrice extracellulare (ECM) sono state prese e ricostruite per fornire una rappresentazione 3D locale della sua organizzazione. I metodi di imaging μCT e SBF-SEM sono stati quindi correlati per superare la variazione spaziale attraverso la valvola polmonare. Sebbene il lavoro presentato sia esclusivamente sulla valvola polmonare, questa metodologia potrebbe essere adottata per descrivere l'organizzazione gerarchica nei sistemi biologici ed è fondamentale per la caratterizzazione strutturale su più scale di lunghezza.

Introduzione

La valvola polmonare (PV) serve a garantire il flusso sanguigno unidirezionale tra il ventricolo destro e l'arteria polmonare. Le malformazioni della valvola polmonare sono associate a diverse forme di cardiopatia congenita. L'attuale trattamento per la cardiopatia congenita delle valvole cardiache (HVD) è la riparazione valvolare o la sostituzione della valvola, che può richiedere più interventi chirurgici invasivi per tutta la vita di un paziente¹. È stato ampiamente accettato che la funzione della valvola cardiaca deriva dalla sua struttura, spesso indicata come il correlato struttura-funzione. Più specificamente, le proprietà geometriche e biomeccaniche del cuore ne dettano la funzione. Le proprietà meccaniche, a loro volta, sono determinate dalla composizione e dall'organizzazione dell'ECM. Sviluppando un metodo per determinare le proprietà biomeccaniche delle valvole cardiache murine, i modelli animali transgenici possono essere utilizzati per interrogare il ruolo dell'ECM sulla funzione e la disfunzione della valvola cardiaca^2,3,4,5.

Il modello animale murino è stato a lungo considerato lo standard per gli studi molecolari perché i modelli transgenici sono più facilmente disponibili nei topi rispetto ad altre specie. I modelli transgenici murini forniscono una piattaforma versatile per la ricerca di malattie correlate alle valvole cardiache⁶. Tuttavia, le competenze chirurgiche e i requisiti di strumentazione per caratterizzare sia la geometria che l'organizzazione ECM sono stati un grosso ostacolo nel progresso della ricerca HVD. I dati istologici in letteratura forniscono un'immagine nel contenuto della matrice extracellulare della valvola cardiaca murina, ma solo sotto forma di immagini 2D e non sono in grado di descrivere la sua architettura 3D^7,8. Inoltre, la valvola cardiaca è sia spazialmente che temporalmente eterogenea, rendendo difficile trarre conclusioni tra gli esperimenti riguardanti l'organizzazione ECM se il campionamento e la conformazione non sono fissi. I metodi di caratterizzazione 3D convenzionali, come la risonanza magnetica o l'ecocardiografia 3D, non forniscono la risoluzione necessaria per risolvere i componenti ECM^9,10.

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro completamente correlato in cui l'eterogeneità temporale dovuta al ciclo cardiaco è stata affrontata fissando la conformazione del PV murino con la pressione idrostatica transvalvolare. L'eterogeneità spaziale è stata controllata con precisione campionando le regioni di interesse e registrando set di dati da diverse modalità di imaging, in particolare μCT e microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali, su diverse scale di lunghezza. Questo metodo di scouting con μCT per guidare il campionamento a valle è stato proposto in precedenza, ma poiché la valvola polmonare presenta variazioni temporali, è stato necessario un ulteriore livello di controllo sul livello chirurgico¹¹.

Gli studi in vivo che descrivono la biomeccanica della valvola cardiaca murina sono scarsi e, invece, si basano su modelli computazionali quando descrivono il comportamento di deformazione. È di fondamentale importanza che i dati extracellulari locali sulla scala di lunghezza nanometrica siano correlati alla geometria e alla posizione della valvola cardiaca. Questo, a sua volta, fornisce distribuzioni quantificabili e mappate spazialmente di proteine ECM che contribuiscono meccanicamente, che possono essere utilizzate per rafforzare i modelli di valvole cardiache biomeccaniche esistenti^12,13,14.

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Protocollo

L'uso di animali in questo studio era in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Nationwide Children's Hospital ai sensi del protocollo AR13-00030.

1. Escissione della valvola polmonare

1. Autoclave gli strumenti necessari per la dissezione del mouse. Ciò include forbici fini, micro pinza, micro morsetti vascolari, pinza per l'applicazione di morsetti, portaasele, forbici a molla e riavvolgitori.
2. Acclimatare tutti i topi per un minimo di 2 settimane prima dell'operazione. Rimuovere i topi C57BL/6, di circa 1 anno di età, dalle loro gabbie e pesare, quindi eutanasizzare con un cocktail di ketamina / xilazina (3: 1 ketamina: xilazina, 0,01 ml per g) overdose.
3. Posizionare il topo in posizione di reclinazione dorsale su un vassoio e fissare gli arti con del nastro adesivo. Una volta fissato, eseguire la toracotomia.
   1. Esporre il cuore rimuovendo il tessuto adiposo e la fascia in eccesso.
   2. Rimuovere l'atrio destro e perfondere attraverso il ventricolo sinistro con soluzione salina a temperatura ambiente (0,9% NaCl). La perfusione dovrebbe richiedere circa 20 ml su 30 s. Ciò si traduce nel dissanguamento del topo.
4. Rimuovere l'intero cuore recidendo la vena cava superiore, la vena cava inferiore, l'arteria polmonare e l'aorta. Prestare particolare attenzione all'arteria polmonare. Tagliare circa 2 mm sopra la giunzione ventricolo-arteriosa, in quanto questo servirà come condotto per la pressurizzazione.
5. Rimuovere i ventricoli sinistro e destro per esporre le camere alla pressione atmosferica. Assicurarsi che la struttura del tronco polmonare non sia influenzata dalla rimozione dei ventricoli.

2. Fissazione della pressione della valvola polmonare

1. Tubo di pressurizzazione dell'anastomosio con arteria polmonare, lasciando circa 1 mm di distanza tra la giunzione sino-tubulare e l'estremità del tubo per adattarsi a grandi movimenti delle foglioline e del tronco polmonare.
2. Elevare il serbatoio a una pressione fisiologica analoga e riempirlo con la soluzione salina. Testare il sistema di flusso per assicurarsi che non vi siano blocchi o bolle d'aria.
3. Collegare un rubinetto alla valvola polmonare anastomosizzata e garantire un flusso adeguato attraverso il tubo (cioè senza bolle d'aria) commutando il tratto di deflusso. Una volta che il flusso è adeguato, spostare il deflusso alla valvola polmonare anastomosizzata e garantire la pressurizzazione del tronco polmonare. Questo è identificato dalla distensione del tronco polmonare.
4. Una volta confermata la pressurizzazione del tronco polmonare, incorporare gradualmente la soluzione fissativa primaria (1,25% glutaraldeide, 1,0% paraformaldeide in cacodilato 0,15 M) fino a quando la soluzione salina non viene spurgata. Questo viene fatto rimuovendo una porzione, circa il 25% della capacità del serbatoio, della soluzione salina e sostituendola con il fissativo primario.
   ATTENZIONE: I fissativi utilizzati (paraformaldeide e glutaraldeide) sono altamente tossici e devono essere indossati adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) per garantire la sicurezza.
5. Posizionare una garza imbevuta di fissativo sul campione di tessuto per evitare l'essiccazione.
6. Perfondere il fissativo per 3 ore, riempiendo il serbatoio secondo necessità per mantenere una pressione costante. Durante la fissazione, non è raro che la valvola polmonare si restringa a causa della fissazione chimica. In tal caso, ricostituire costantemente il serbatoio con fissativo primario per mantenere la pressione fisiologica.
7. Conservare la valvola cardiaca nella soluzione fissativa a 4 °C fino all'uso. I campioni sono stati conservati per un massimo di 1 settimana senza alcuna differenza percepibile.

3. Colorazione e incorporamento del campione in blocco^15,16

ATTENZIONE: I reagenti coloranti utilizzati in questo paragrafo (ferrocianuro di potassio, tedrossido di osmio, tiocarboidrazide, aspartato di piombo e acetato di uranile) sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura. Si consiglia l'uso di una cappa aspirante e di dpi adeguati.

1. Macchiatura
   1. Lavare il campione di valvola cardiaca fissa per 5 minuti con tampone cacodilato freddo da 0,15 M. Ripetere il lavaggio altre due volte.
   2. Immergere completamente la valvola cardiaca in una soluzione di ferrocianuro di potassio all'1,5%, cacodilato da 0,15 M, cloruro di calcio da 2 mM e tetroxide di osmio al 2%, su ghiaccio per 1 ora.
   3. Mentre il campione è in incubazione, preparare la soluzione di tiocarboidrazide (TCH) sciogliendo 0,1 g di TCH in 10 ml di ddH₂O. Posizionare la soluzione in un forno a 60 °C per 1 ora. Agitare delicatamente periodicamente per assicurarsi che TCH sia completamente sciolto. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm immediatamente prima dell'uso.
   4. Lavare i campioni con ddH₂O a temperatura ambiente mettendoli in un tubo di ddH₂O per 5 minuti e agitarlo leggermente agitando il contenitore. Ripeti questo processo tre volte.
   5. Metterlo in soluzione filtrata TCH per 20 minuti a temperatura ambiente. Eseguire la fase di lavaggio tre volte (5 minuti ciascuna) con ddH₂O a temperatura ambiente come descritto al punto 3.1.4.
   6. Una volta fatto, posizionare il campione in tetroxide di osmio al 2% per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavarlo di nuovo per un totale di tre volte per 5 minuti ciascuno con ddH₂O a temperatura ambiente.
   7. Incubare il campione in acetato di uranile all'1% durante la notte a 4 °C.
   8. Durante questo periodo, preparare una soluzione di 0,066 g di nitrato di piombo in 10 ml di soluzione stock di acido aspartico. Regolare il pH a 5,5 con 1 N KOH. Mettere la soluzione in un forno a 60 °C per sciogliere il nitrato di piombo.
   9. Dopo l'incubazione notturna, eseguire la fase di lavaggio come descritto al punto 3.1.4. Ripeti tre volte. Quindi, incubare il tessuto della valvola cardiaca in soluzione di aspartato di piombo dal passaggio 3.1.8 in un forno a 60 °C per 30 minuti.
2. Disidratazione
   1. Lavare i fazzoletti per 5 minuti a temperatura ambiente con ddH₂O. Ripetere tre volte.
   2. Produrre soluzioni fresche di 20%, 50%, 70%, 90% e 100% di etanolo in ddH₂O. Tenere sul ghiaccio fino all'uso.
   3. Per disidratare il tessuto valvolare cardiaco. Eseguire trattamenti successivi di etanolo al 20%, 50%, 70% e 90% su ghiaccio per 5 minuti ciascuno. Quindi eseguire due successivi trattamenti di etanolo al 100% su ghiaccio per 5 minuti.
   4. Spostare il tessuto in acetone ghiacciato per 10 minuti. Quindi mettere in acetone fresco a temperatura ambiente per 10 minuti.
3. Incorporamento
   1. Realizzare la miscela di resine (vedere Tabella dei materiali)secondo le specifiche del produttore: 11,4 g del componente A, 10 g del componente B, 0,3 g del componente C e 0,05-0,1 g del componente D. Inizialmente mescolare i componenti A e B riscaldando ciascuno dei componenti a 60 °C prima di aggiungere i componenti C e D. La miscela si trasformerà in un colore ambrato con l'aggiunta dei componenti C e D. Sarà uniforme se correttamente miscelato.
   2. Creare miscele con rapporti di volume di 25:75, 50:50 e 75:25 resina:acetone. Mescolare accuratamente.
   3. Posizionare i tessuti nei successivi trattamenti della miscela resina/acetone 25:75, 50:50 e 75:25 per 2 ore ciascuno a temperatura ambiente.
   4. Posizionare i tessuti in resina al 100% durante la notte a temperatura ambiente.
   5. Il giorno seguente, mettere i tessuti in resina fresca al 100% per 2 ore a temperatura ambiente.
   6. Trasferire i tessuti della valvola cardiaca in una capsula incorporante, sostituirli con resina fresca al 100% e metterli in un forno a 60 °C per 48 ore per polimerizzare.
4. Eseguire l'imaging correlativo come mostrato di seguito.

4. Imaging tomografico micro-computerizzata

1. Montare il blocco campione di resina su un porta campioni μCT con un adesivo (colla o nastro biadesivo funziona bene).
2. Posizionare il supporto nella camera μCT e fissarlo sul palco avvitando la pinza in modo che non vi sia alcun movimento del supporto. Il movimento del campione durante la scansione ridurrà la qualità dell'immagine.
3. Aprire l'interfaccia utente μCT facendo doppio clic sull'icona. Aggiungi un progetto selezionando il segno + accanto a Progetti e compila i campi necessari.
4. Una volta creato, trova il progetto creato e selezionalo facendo clic su di esso. Si aprirà una seconda colonna Acquisizioni. Seleziona il + accanto a Acquisizioni e compila i campi necessari.
5. Chiudere le porte della camera e armare il sistema premendo il pulsante di inserimento sul pannello frontale o il μCT. Riscaldare le radiografie dall'interfaccia utente selezionando il pulsante che indica Warmup.
   NOTA: il sistema spegnerà automaticamente le radiografie dopo una procedura di riscaldamento riuscita. Attivare i raggi X selezionando il pulsante.
6. Regolare la rotazione dello stadio in modo che il centro della rotazione del campione non si discosti dal centro del monitor (ad esempio, il campione si trova all'interno del campo visivo per l'intera scansione). Per il sistema utilizzato per questo esperimento, ciò comporta la regolazione della fase della regione di interesse (ROI) nella scheda a discesa come descritto di seguito.
   1. Impostare la regolazione dello stadio ROI impostando l'angolo di rotazione su 0° e segnando il bordo del campione. Il campione viene quindi ruotato a 180 ° e il bordo del campione viene nuovamente contrassegnato.
   2. Regolare la posizione dell'asse x dello stadio ROI in modo che il bordo del campione sia compreso tra questi due estremi. Ripetere questo processo per angoli di rotazione di 90° e 270° per la posizione y.
   3. Nel caso in cui la rotazione del campione causi lo spostamento dei bordi fuori dal campo visivo, diminuire l'ingrandimento delle esigenze di μCT fino a quando i bordi del campione sono visibili agli angoli sopra impostati e può essere effettuata una regolazione grossolana dello stadio ROI.
   4. Una volta regolato all'ingrandimento inferiore, spostare il campione o il rilevatore per aumentare l'ingrandimento e le posizioni del ROI possono essere regolate correttamente.
      NOTA: potrebbe essere necessario ripetere questo processo per garantire l'allineamento. Il corretto allineamento si traduce in un campione che mostra poco o nessun movimento orizzontale attraverso tutti gli angoli di rotazione del campione.
7. Regolare il μCT sui parametri di scansione desiderati utilizzando il software del produttore. Questi parametri includono il potenziale del tubo, la corrente del tubo, la distanza del rivelatore, la distanza del campione, il tempo di esposizione, la traiettoria e il numero di proiezioni (vedere la Tabella S1 per i parametri di acquisizione μCT utilizzati in questo studio).
   NOTA: i parametri di calibrazione, come le scansioni in campo chiaro e in campo scuro, devono essere mantenuti secondo le specifiche del produttore, salvo diversa indicazione. Ad esempio, se un campione è troppo grande e il sistema non è in grado di spostare il campione fuori dalla vista campo, è necessario rimuoverlo per eseguire scansioni di calibrazione del campo chiaro.
8. Una volta impostati i parametri, è possibile vedere un'approssimazione della durata della scansione premendo il pulsante Stima tempo. Selezionare il pulsante Start per iniziare la scansione.
9. Dopo il completamento della scansione, assicurarsi che i raggi X siano spenti, svitare la pinza e rimuovere con attenzione il campione dalla camera μCT.

5. Elaborazione del campione e correlazione delle immagini

1. Ricostruire le proiezioni μCT utilizzando un algoritmo di retroproiezione filtrato con il software fornito dal produttore (vedi Tabella dei materiali).
   1. Seleziona la scheda Recon nella parte superiore dello schermo. Selezionare la scheda Progetto e acquisizione.
   2. Selezionate il modello di ricognizione associato alla retroproiezione filtrata. Premi il pulsante Avvia ricognizione.
2. Identificare e segmentare la valvola polmonare utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Ciò richiede una conoscenza preliminare dell'anatomia della valvola polmonare¹⁷. A pressioni arteriose elevate, i volantini coapt e bloccano il lume della valvola polmonare.
3. Identificare l'orientamento di slicing rispetto alla direzione di scansione e al campione. Riorientate il campione in modo che la direzione di sezionamento sia allineata con l'asse desiderato.
4. Identifica le regioni di interesse per l'imaging ad alta risoluzione. In questo esperimento, è stata scelta la pancia (al centro) del volantino e la giunzione arterio-valvolare.
5. Rimuovere la resina in eccesso e il campione con la lama del rasoio o levigatura per pezzi di materiale di grandi dimensioni, o per microtomo per pezzi più fini.
6. Una volta in un luogo di interesse, confrontare il campione fisico con fette μCT virtuali per confermare la posizione. Questo è stato fatto confrontando le caratteristiche anatomiche nella sezione trasversale.

6. Microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali¹⁸

1. Ridurre la sezione trasversale del campione per adattarsi a SBF-SEM, circa 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
2. Montare il campione tagliato sul mozzicone in alluminio SBF-SEM utilizzando resina epossidica.
3. Rivestire il blocco del campione con oro 35 nm. Ruotare il campione sulla piattaforma per applicare uno strato uniforme di rivestimento.
4. Sfiatare la camera SBF-SEM e regolare l'altezza della lama del coltello in base all'altezza eucentrica del microscopio.
5. Inserire il campione e livellare lo stub campione.
6. Immagine in condizioni di basso vuoto per evitare la carica e con rilevatore di backscatter (vedere tabella S2 per i parametri di acquisizione SBF-SEM).
7. Immagine e cucitura di più regioni di interesse a diversi ingrandimenti utilizzando un software automatizzato (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

L'anastomosi dell'arteria polmonare al tubo di pressurizzazione è mostrata in Figura 1A. Dopo l'applicazione della pressione idrostatica, il tronco polmonare si distende radialmente (Figura 1B) indicando che i lembi della valvola polmonare sono in configurazione chiusa. La conformazione della valvola polmonare è stata confermata da μCT. In questo caso, i volantini erano coapt (chiusi) e l'anulus era circolare (Figura 2A).

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Discussione

La rimozione dei ventricoli serve a due scopi. In primo luogo, esponendo il lato del ventricolo alla pressione atmosferica, quindi è sufficiente applicare una pressione transvalvolare dal lato arterioso della valvola polmonare per chiudere, e in secondo luogo, fornendo una base stabile per prevenire la torsione del tronco polmonare. Durante la pressurizzazione, il tronco polmonare si distende radialmente e inferiormente, rendendolo incline alla torsione, causando il collasso del tronco polmonare. Il precaricamento della...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236