Acquisizione dei dati di risonanza magnetica funzionale a riposo nel ratto

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati stabili di risonanza magnetica funzionale (rs-fMRI) allo stato di riposo da un ratto utilizzando isoflurano a basso dosaggio in combinazione con dexmedetomidina a basso dosaggio.

Abstract

La risonanza magnetica funzionale allo stato di riposo (rs-fMRI) è diventata un metodo sempre più popolare per studiare la funzione cerebrale in uno stato di riposo, non di attività. Questo protocollo descrive un metodo di sopravvivenza preclinica per ottenere dati rs-fMRI. La combinazione di isoflurano a basso dosaggio con infusione continua dell'agonista del recettore adrenergico α₂ dexmedetomidina fornisce un'opzione robusta per un'acquisizione dati stabile e di alta qualità preservando la funzione della rete cerebrale. Inoltre, questa procedura consente la respirazione spontanea e la fisiologia quasi normale nel ratto. Ulteriori sequenze di imaging possono essere combinate con l'acquisizione dello stato di riposo creando protocolli sperimentali con stabilità anestetica fino a 5 ore utilizzando questo metodo. Questo protocollo descrive la configurazione delle apparecchiature, il monitoraggio della fisiologia del ratto durante quattro fasi distinte dell'anestesia, l'acquisizione di scansioni dello stato di riposo, la valutazione della qualità dei dati, il recupero dell'animale e una breve discussione dell'analisi dei dati post-elaborazione. Questo protocollo può essere utilizzato in un'ampia varietà di modelli di roditori preclinici per aiutare a rivelare i cambiamenti della rete cerebrale risultanti che si verificano a riposo.

Introduzione

La risonanza magnetica funzionale allo stato di riposo (rs-fMRI) è una misura del segnale dipendente dal livello di ossigeno nel sangue (BOLD) quando il cervello è a riposo e non impegnato in alcun compito particolare. Questi segnali possono essere utilizzati per misurare le correlazioni tra le regioni del cervello per determinare la connettività funzionale all'interno delle reti neurali. rs-fMRI è ampiamente utilizzato negli studi clinici a causa della sua non invasività e della bassa quantità di sforzo richiesto ai pazienti (rispetto alla fMRI basata su attività) che lo rende ottimale per diverse popolazioni di^{pazienti 1}.

I progressi tecnologici hanno permesso di adattare rs-fMRI per l'uso in modelli di roditori per scoprire i meccanismi alla base degli stati di malattia (vedi riferimento² per la revisione). I modelli animali preclinici, compresi i modelli di malattia o knockout, consentono una vasta gamma di manipolazioni sperimentali non applicabili nell'uomo e gli studi possono anche utilizzare campioni post-mortem per migliorare ulteriormente gli esperimenti². Tuttavia, a causa della difficoltà sia nel limitare il movimento che nel mitigare lo stress, l'acquisizione della risonanza magnetica nei roditori viene tradizionalmente eseguita in anestesia. Gli agenti anestetici, a seconda della loro farmacocinetica, farmacodinamica e bersagli molecolari, influenzano il flusso sanguigno cerebrale, il metabolismo cerebrale e potenzialmente influenzano le vie di accoppiamento neurovascolare.

Ci sono stati numerosi sforzi per sviluppare protocolli anestetici che preservino l'accoppiamento neurovascolare e la funzione della retecerebrale^3,4,5,6,7,8. In precedenza abbiamo riportato un regime anestetico che applicava una bassa dose di isoflurano insieme a una bassa dose dell'agonista del recettore adrenergico α₂ dexmedetomidina⁹. I ratti con questo metodo di anestesia hanno mostrato robuste risposte BOLD alla stimolazione dei baffi in regioni coerenti con le vie di proiezione stabilite (nuclei talamici ventrolaterali e ventromediali, corteccia somatosensoriale primaria e secondaria); sono state rilevate in modo coerente anche reti cerebrali a riposo su larga scala, tra cui la rete in modalità predefinita^10,11 e la rete di salienza^12. Inoltre, questo protocollo anestetico consente l'imaging ripetuto sullo stesso animale, che è importante per monitorare longitudinalmente la progressione della malattia e l'effetto delle manipolazioni sperimentali.

Nel presente studio, descriviamo in dettaglio la configurazione sperimentale, la preparazione degli animali e le procedure di monitoraggio fisiologico coinvolte. In particolare, descriviamo le fasi anestetiche specifiche e l'acquisizione delle scansioni durante ogni fase. La qualità dei dati viene valutata dopo ogni scansione a riposo. Nella discussione è incluso anche un breve riepilogo dell'analisi post-scansione. I laboratori interessati a scoprire il potenziale dell'uso di rs-fMRI nei ratti troveranno utile questo protocollo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su uno scanner MRI 9.4 T e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Dartmouth College. È stata ottenuta un'ulteriore approvazione per registrare e mostrare gli animali utilizzati nel video e nelle figure seguenti.

1. Preparazioni prima della scansione

1. Linea di infusione sottocutanea
   1. Rimuovere parzialmente un ago da 23 G dalla confezione in modo che la punta dell'ago rimanga sterile.
   2. Tenere saldamente il mozzo dell'ago e utilizzare una lama di rasoio per segnare l'albero dell'ago dove incontra il mozzo.
   3. Bloccare un portaaghi attorno all'albero direttamente sotto il punteggio e rompere delicatamente l'albero dal mozzo.
   4. Inserire 1/3 dell'albero dell'ago (estremità smussata) nella linea PE50 precedentemente sterilizzata con una lunghezza della linea sufficiente per estendersi dalla pompa del farmaco all'animale all'interno del foro del magnete.
2. Diluizione di dexmedetomidina e atipamezolo
   1. Preparare una soluzione di dexmedetomidina cloridrato diluito utilizzando 0,5 mL di 0,5 mg/mL di brodo miscelato con 9,5 mL di soluzione salina sterile in un flacone di vetro trasparente e sterile (concentrazione diluita = 0,025 mg/mL).
   2. Preparare una soluzione di atipamezolo diluito utilizzando 0,1 mL di brodo da 5 mg/mL miscelato con 9,9 mL di soluzione salina sterile in un flacone di vetro trasparente e sterile (concentrazione diluita = 0,05 mg/mL).
3. Parametri di scansione
   1. Utilizzare i parametri presentati nella Tabella 1 per preparare le sequenze di scansione.

2. Anestesia di fase 1: induzione e preparazione animale

1. Apparecchio
   1. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano accese e funzionino correttamente, compresi il miscelatore di ossigeno e aria, la piastra riscaldante e il sistema di scavenging attivo (vedere figura 1).
   2. Impostare il set point di temperatura dell'impianto di riscaldamento su 37,5 °C.
2. Induzione animale
   1. Posizionare l'animale (ratto Sprague Dawley maschio di 90 giorni) nella camera di induzione e indurre l'anestesia con il 2,5% di isoflurano nel 30% di aria arricchita di ossigeno.
      NOTA: è possibile utilizzare una vasta gamma di età degli animali ed entrambi i sessi.
   2. Una volta che l'animale è anestetizzato, rimuoverlo dalla camera, pesare l'animale e posizionarlo nel cono del naso (al 2,5% di isoflurano) sulla piastra riscaldante nello spazio di preparazione.
3. Preparazione animale
   1. Applicare un unguento lubrificante oftalmico su ciascun occhio per evitare l'essiccazione.
   2. Confermare la profondità dell'anestesia con una mancanza di risposta al pizzico della dita.
   3. Usa i clipper per radere un'area quadrata di 2 "per 2" sulla regione lombare inferiore della schiena dell'animale (cioè direttamente sopra la coda).
   4. Somministrare 0,015 mg/kg di soluzione di dexmedetomidina con un'iniezione intraperitoneale (p.i.) (ad esempio, un ratto da 300 g riceverebbe 0,18 ml) nel quadrante inferiore destro dell'addome utilizzando un ago da 25 G.
   5. Commutare il flusso di isoflurano dallo spazio di preparazione alla culla dell'animale.
   6. Sposta l'animale nella culla dell'animale. Posizionare saldamente i denti anteriori del topo sopra e nella barra del morso. Spingere il cono del naso sopra il naso per garantire una vestibilità aderente.
      NOTA: Se il cono del naso non copre la mascella inferiore, utilizzare un film di paraffina per tenere delicatamente la mascella chiusa mentre si sigilla anche intorno al cono del naso.
   7. Posizionare il pad respiratorio sotto l'addome del ratto sotto la gabbia toracica e ricodizionarlo fino a quando la forma d'onda della respirazione mostra una depressione profonda centrata su ciascun respiro (vedere la forma d'onda della respirazione nella Figura 2).
   8. Monitorare la respirazione dell'animale utilizzando il software di monitoraggio della fisiologia. Passare alla fase successiva dell'anestesia quando la respirazione è inferiore a 40 respiri/ min (bpm; circa 5 minuti dopo l'iniezione di dexmedetomidina).

3. Anestesia di fase 2: configurazione animale

1. Inserire le barre auricolari nel condotto uditivo per stabilizzare la testa del ratto nella culla dell'animale. Una volta posizionato, tirare in avanti sulla barra del morso e confermare che la testa non si muova. Regolare di riconseguire il cono del naso e il film di paraffina secondo necessità (vedere Figura 3a).
2. Inserire la sonda di temperatura in un coperchio della sonda monouso prelubrificato. Inserire delicatamente la sonda di temperatura di circa 1/2 "nel retto e fissarla alla base della coda con nastro adesivo medico.
3. Posizionare la clip del pulsossimetro sull'area metatarsale del piede posteriore, assicurandosi che la fonte di luce si trova sul fondo del piede (palmo).
   NOTA: la rotazione della clip può influire sul segnale; quindi, la creazione di un supporto per mantenere la zampa e la clip in posizione verticale porterà a una maggiore stabilità. Si noti inoltre che fino a quando il ratto non è a temperatura corporea normale, la saturazione di ossigeno può essere bassa (<95%).
4. Utilizzare il peso del ratto per calcolare la velocità di infusione per espellere 0,015 mg/kg/h di dexmedetomidina (un ratto da 300 g riceve 0,18 ml/h).
5. Impostare la pompa del farmaco per espellere la velocità di infusione calcolata.
6. Riempire una siringa da 3 ml con la soluzione sterile e diluita di dexmedetomidina e inserire la punta dell'ago nell'estremità aperta della linea di infusione sterilizzata (che si estende dalla pompa del farmaco alla culla animale con l'ago sottocutaneo precedentemente attaccato). Riempire la linea e fissare la siringa nel supporto della siringa della pompa del farmaco.
7. Spostare il blocco pusher in avanti fino a quando non tocca lo stantuffo e il farmaco viene espulso dall'ago, assicurandosi che la linea di infusione sia completamente piena.
8. Usando una salvietta icool, pulire l'area rasata per rimuovere eventuali peli randagi.
9. Pizzicare la pelle di circa due dita sopra la base della coda. Inserire 1/3 dell'ago della linea di infusione nella pelle tendata.
10. Fissare l'ago alla pelle con un pezzo da 3 "di nastro medico largo. Posizionare un secondo pezzo di nastro medico largo sopra il primo, attraverso il ratto, e attaccato a entrambi i lati della culla dell'animale (vedere Figura 4).
    NOTA: È di fondamentale importanza che l'ago ferromagnetico sia ben fissato per impedire il movimento durante la scansione.
11. Iniziare l'infusione di dexmedetomidina sottocutanea.
12. Posiziona un pezzo di garza sul ponte del naso del ratto per creare una superficie piana per la bobina. Utilizzare nastro di carta, che non interferisce con il segnale MRI, per fissare la bobina alla testa del ratto, centrandola sul cervello (vedere Figura 3b,c).
13. Fissare tutte le linee e i cavi all'interno della culla animale con nastro da laboratorio e verificare se tutti i segnali fisiologici sono stabili (vedere Figura 2).
14. Posiziona gli asciugamani di carta sopra l'animale, fissandoli alla culla dell'animale con del nastro da laboratorio. Se si utilizza un sistema di riscaldamento ad aria, avvolgere un foglio di plastica attorno all'intera culla per contenere l'aria calda.
15. Sposta l'animale nel foro e sintonizza il magnete.

4. Anestesia di fase 3: acquisizione della scansione anatomica

1. Ridurre l'isoflurano all'1,5%, con conseguente aumento costante della respirazione a circa 45-50 bpm. Rimanere a questo livello per tutta la durata della scansione anatomica.
2. Utilizzare la scansione del localizzatore FLASH per assicurarsi che il cervello sia allineato con l'isocentro del magnete (Figura 5a). Riposizionare l'animale e ripetere se necessario.
3. Eseguire la scansione del localizzatore RARE ad alta risoluzione e utilizzare questo output di scansione per allineare 15 fette sagittali centrate sul cervello (da sinistra a destra, Figura 5b).
4. Usando la fetta sagittale centrale, allineare la fetta assiale centrale alla decussazione della commessura anteriore, che appare come una macchia scura (Figura 5c). Prendete nota dell'offset della sezione da utilizzare in un secondo momento nelle scansioni dello stato di riposo.
5. Acquisisci 23 fette utilizzando i protocolli assiali FLASH e RARE per aiutare nella registrazione in uno spazio comune durante l'analisi post-scansione.
6. Shim attraverso tutto il cervello usando la sequenza PRESS.

5. Fase 4: acquisizione della scansione dello stato di riposo

1. Dopo aver completato le scansioni anatomiche, ridurre l'isoflurano allo 0,5% allo 0,75%, regolando in modo che la respirazione dell'animale sia di 60-65 respiri al minuto. Rimanere a questo livello per almeno 10 minuti prima di iniziare la scansione dello stato di riposo per garantire la stabilità.
2. Quando la fisiologia è stabile (l'intervallo respiratorio è di 60-75 bpm senza ansimare o irregolarità, la temperatura corporea interna è di 37,5 ± 1,0 ° C e la saturazione di ossigeno è del 95% o superiore), acquisire una scansione EPI a 15 fette utilizzando la stessa fetta offset della serie assiale anatomica.
3. Al termine di ogni scansione dello stato di riposo, controllare la qualità utilizzando un'analisi dei componenti indipendente (ICA) per scomporre i dati in componenti spaziali e temporali.
4. Ottenere almeno tre scansioni dello stato di riposo di alta qualità.

6. Recupero post-scansione

1. Al termine della scansione, aumentare l'isoflurano al 2% e interrompere l'infusione sottocutanea di dexmedetomidina.
2. Rimuovere la culla dell'animale dal foro del magnete, scartare l'animale e rimuovere le barre auricolari, la sonda di temperatura, la clip del pulsossimetro e l'ago dexmedetomidina.
3. Iniettare 0,015 mg/kg della soluzione diluita di atipamezolo nel muscolo della zampa posteriore del ratto usando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G (cioè, un ratto da 300 g riceverebbe 0,09 ml).
4. Rimettete il topo nella gabbia di casa sopra una piastra riscaldante e monitorate fino a quando l'animale non è deambulante.

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Risultati

Dopo ogni scansione dello stato di riposo, la stabilità viene valutata utilizzando un'analisi dei componenti indipendente (ICA; script di esempio incluso in File supplementari). Nella Figura 6 sono illustrati esempi di output di componenti da scansioni a stato di riposo. La Figura 6a mostra un componente di segnale da una scansione con elevata stabilità. Si noti che spazialmente, il componente ha un'elevata regionalità. All'interno del corso ...

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Discussione

La stabilità dell'animale, sia fisicamente che fisiologicamente, è la chiave per ottenere dati di alta qualità sullo stato di riposo. Questo protocollo raggiunge la stabilità muovendosi attraverso quattro fasi distinte di anestesia. È imperativo che l'animale abbia raggiunto le soglie fisiologiche impostate prima di passare alla fase successiva dell'anestesia; poiché questo metodo si basa su meccanismi autoregolatori fisiologici, i singoli animali possono richiedere quantità di tempo leggermente diverse in ogni fa...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
9.4T MRI	Varian/Bruker		Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen Mixer	Sechrist	Model 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)	NIMH/NIH	Version AFNI_18.3.03	Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal Cradle	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating System	SAII	Model 1025	MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe Scissors	MRIequip.com	MT-6003
Clippers	Patterson Veterinary	07-882-1032	Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer Covers	Medline	MDS9608
FMRIB Software Library	FMRIB	MELODIC Version 3.15	Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating Pad	Cara Inc.	Model 50
Hemostat forceps, straight	Kent Scientific	INS750451-2
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane Vaporizer	VetEquip Inc.	911103
Lab Tape, 3/4"	VWR International	89097-990
Needles, 23 gauge	BD	305145	plastic hub removed
Parafilm Laboratory Film	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface Coil	Bruker	T12609	2cm
Polyethylene Tubing	Braintree Scientific	PE50 50FT	0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline Solution	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep Pads	Medline	MDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)	Medline	MMM15300	3M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle	BD	309626
Syringes, 3 mL	BD	309657
Vented induction and scavenging system	VetEquip Inc.	942102	2 liter induction chamber with active scavenging
		411724	omega flowmeter
		931600	scavenging cube, "vacuum"
		921616	nose cone, non-rebreathing