JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.

Abstract

L'HIV-1 causa un'infezione cronica che colpisce più di 37 milioni di persone in tutto il mondo. Le persone che vivono con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) sperimentano comorbilità correlata all'infiammazione cronica nonostante la terapia antiretrovirale. Tuttavia, questi segnali infiammatori non sono stati completamente caratterizzati. Il ruolo degli eventi di ingresso precoce sull'attivazione degli eventi di segnalazione cellulare e sull'espressione genica a valle non è stato catturato a livello di singola cellula. Qui gli autori descrivono un metodo che applica i principi della microscopia a fluorescenza a cellule vive a una piattaforma automatizzata a cella singola che colture e immagini le cellule rispetto ai corsi di tempo personalizzati dall'utente, consentendo l'analisi ad alta produttività dei processi cellulari dinamici. Questo saggio può tracciare la microscopia a fluorescenza viva a singola cellula dei primi eventi che seguono immediatamente l'infezione da HIV-1, in particolare l'afflusso di calcio che accompagna l'esposizione al virus e lo sviluppo di infezioni produttive utilizzando un virus reporter fluorescente. Le cellule MT-4 sono caricate con un colorante sensibile al calcio e coltivate in penne isolate su un dispositivo nanofluidico. Le cellule coltivate sono infettate da un virus reporter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Un microscopio a fluorescenza posizionato sopra il dispositivo nanofluidico misura l'afflusso di calcio su un decorso di 8 minuti dopo l'esposizione acuta all'HIV-1. L'infezione produttiva dell'HIV-1 viene misurata in quelle stesse cellule per un intervallo di 4 giorni. I dati di imaging di questi corsi di tempo vengono analizzati per definire le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Gli autori presentano un'alternativa integrata e scalabile ai metodi di imaging tradizionali utilizzando una nuova piattaforma optofluidica in grado di smistamento, 1500, imaging e automazione del software a cella singola. Questo saggio può misurare la cinetica degli eventi in varie condizioni, tra cui il tipo di cellula, l'agonista o l'effetto antagonista, misurando al contempo una serie di parametri. Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica: questa tecnica può essere ampiamente adattata per studiare la cinetica di segnalazione cellulare e le interazioni molecolari dinamiche.

Introduzione

L'infiammazione cronica è una delle principali cause di morbilità precoce associata all'HIV emortalità 1,2,3. Esistono diversi meccanismi in base ai quali l'HIV può attivare la segnalazione infiammatoria, e recenti prove suggeriscono un ruolo per i recettori P2X nell'ingresso dell'HIV che sono recettori del trifosfato di adenosina (ATP) che gatingcalcio 3,4,5,6,7,8,9,10. Il sottotipo P2X dei recettori purinergici (P2XR) può essere importante facilitatore di questa infiammazione. Tuttavia, i meccanismi molecolari delle interazioni HIV-P2XR sono in gran parte sconosciuti e possono avere un impatto sulle fasi del ciclo di vita virale dell'HIV-1 precoce e tardivo. Definire i percorsi e la cinetica che guidano l'infiammazione cronica associata all'HIV è fondamentale per far avanzare le opzioni di trattamento per le persone con HIV.

Per valutare se l'HIV-1 agonizza direttamente i recettori P2X, l'attivazione P2XR e l'infezione da HIV-1 devono essere misurate in parallelo. I test sull'attività P2XR e sull'infezione da HIV-1 sono stati stabiliti in modo indipendente: l'afflusso di calcio cellulare è un indicatore dell'attivazione P2XR e l'infezione produttiva dell'HIV-1 può essere quantificata dall'abbondanza di RNA. Il rilevamento della fluorescenza dell'afflusso di calcio è possibile con il colorante sensibile al calcio Fluo-4 e l'infezione da HIV-1 può essere visualizzato con il virus reporter fluorescente mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.

Poiché questi indicatori di attivazione P2X (afflusso acuto di calcio cellulare) e infezione da HIV-1 (sintesi dell'RNA HIV-1) si verificano su scale temporali diverse (minuti contro giorni), manca un metodo ad alta produttività che consenta un'analisi accoppiata dell'attivazione P2XR e dell'infezione da HIV-1. Le tecniche sperimentali standard ad alta produttività, come la citometria del flusso, consentono l'analisi della popolazione ma non possono valutare la relazione tra eventi acuti e longitudinali in singole cellule. In alternativa, l'imaging a cella singola con microscopia a fluorescenza standard è a bassa produttività. Questi limiti sperimentali presentano la necessità di nuove tecniche ad alta produttività per misurare direttamente le associazioni tra eventi cellulari acuti e longitudinali.

Un sistema optofluidico descritto è una nuova piattaforma in grado di smistamento e isolamento a cella singola, 15, imaging e automazione software16,17,18,19. Questo sistema presenta un'alternativa integrata ad alta produttività ai limiti dei metodi di imaging tradizionali. La piattaforma Beacon è costituita da un'anidride carbonica (CO2)e un incubatore a temperatura controllata che supporta le cellule contenute in un chip. Il chip possiede transistor fotosensibili che generano un gradiente elettrico in risposta alla luce mirata. Questa forza dielettroforetica risultante è usata per spostare singole cellule attraverso il chip nanofluidico nelle regioni desiderate. Le cellule sono ordinate in penne sul chip, che forniscono una barriera per isolare fisicamente le singole cellule. Il flusso laminare continuo dei mezzi di crescita in tutto il chip impedisce la migrazione cellulare dalle penne, consentendo al contempo la diffusione di piccole particelle di nutrienti e reagenti specifici dell'esperimento. Un microscopio a fluorescenza si trova sopra il chip. L'automazione del software viene utilizzata per acquisire immagini del chip nel punto di tempo specificato dall'utente.

Tutta la caratterizzazione delle celle è stata eseguita utilizzando un sistema optofluidico per la selezione e la manipolazione a cella singola. Questo sistema è costituito da componenti meccanici, microfluidici e ottici integrati che consentono la manipolazione, il dosaggio, la coltura e l'imaging a cella singola. Le cellule vengono caricate e coltivate sul dispositivo nanofluidico usa e getta costituito da 3.500 camere singole (penne), ognuna in grado di contenere volume sub-nanoliter. Le cellule possono essere posizionate all'interno di penne utilizzando "gabbie" dielettroforetiche indotte dalla luce e coltivate in condizioni controllate da temperatura e CO2. Le microfluidica consentono la perfusione di supporti o tamponi sul chip per la coltura cellulare o il trattamento farmacologico. Un ago azionato consente l'importazione e l'esportazione di cellule da piastre di pozzo incubate e tappate. L'area del chip può essere immagine con ingrandimento 4x o 10x in canali fluorescenti e a campo luminoso (inclusi DAPI, FITC, TRed o Cy5) per caratterizzare fenotipi cellulari o analisi funzionali. L'intero sistema è automatizzato utilizzando software che può essere utilizzato per flussi di lavoro predesignati o esperimenti personalizzati.

Sono state studiate le relazioni tra l'infezione da HIV-1 e la P2XR, ma non è stata riportata una procedura ad alta produttività per caratterizzare direttamente queste interazioni in parallelo. Qui, gli autori descrivono una metodologia per studiare le interazioni HIV-P2XR attraverso il monitoraggio dell'afflusso acuto di calcio e della successiva infezione produttiva dell'HIV-1 a livello di singola cellula. In particolare, questo stabilisce un nuovo strumento che consente la misurazione longitudinale diretta, ad alta produttività e longitudinale di più bersagli in singole celle.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione di cellule per l'imaging

  1. Preparare la soluzione di carico Fluo-4 AM fresca: Aggiungere 25 μL di solvente detergente concentrato 100x, quindi aggiungere 2,5 μL di Fluo-4 AM 1000x a un tubo da 1,5 ml. Vortice da mescolare.
  2. Pipetta 2,5 mL di mezzi di coltura nella soluzione di carico e invertire la miscela. Proteggere dalla luce.
  3. Centrifuga 2 x 106 cellule MT-4 a 500 x g per 3 min.
  4. Rimuovere i mezzi e rimosogliere il pellet in 2 mL della soluzione di carico Fluo-4 AM preparata. Proteggere dalla luce.
  5. Pipetta risospense le cellule in una piastra di Petri da 35 mm. Incubare a 37 °C per 15-30 minuti, quindi incubare per altri 15-30 minuti a temperatura ambiente.
  6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga. Centrifugare le celle a 500 x g per 3 min e rimuovere il supernatante costituito dalla soluzione di carico.
  7. Rimorsi il pellet cellulare con pipettando in 1 mL del mezzo di coltura e centrifugando a 500 x g per 3 minuti da lavare.
  8. Rimorsiva il pellet cellulare con pipettando nel mezzo di coltura ad una concentrazione di 2 x 106 celle/mL (minimo 50 μL). Proteggere dalla luce.

2. Preparazione del sistema optofluidico, caricamento delle celle e penning cellulare

  1. Preparare un chip con la soluzione di bagnatura, che facilita la scrittura cellulare.
    1. Per fare questo, caricare tubi di centrifuga contenenti 2 ml di soluzione bagnante e 50 ml di acqua DI sullo strumento con un nuovo chip optofluidico ed eseguire la funzione Wet Chip. Questa funzione inonderà automaticamente il chip con la soluzione di bagnatura attraverso la fluidic del sistema, incuba il chip a 50, °C e scarica il truciolo con acqua 3 volte.
    2. Una volta fatto lo scarico dell'acqua, sciacquare il chip con 3 cicli di 250 μL di mezzi di coltura.
  2. Integrare la sospensione cellulare dal passaggio 1.8 con soluto detergente 1:100 F-127 prima del caricamento per ridurre la probabilità che le cellule si attacchino ai canali del chip.
  3. Utilizzare l'ago di esportazione dello strumento per importare celle da un tubo di centrifuga da 1,5 ml utilizzando l'operazione load e small volume import per un volume del pacchetto di celle da 5 μL.
  4. Celle a penna che utilizzano una tensione ottimizzata di posizionamento optoelettronico (OEP) di 4,3 V e 5 μm/s di velocità della gabbia. La scrittura avviene utilizzando OEP. Esegui la scrittura usando la funzione Autopen, che seleziona automaticamente singole celle, le circonda con una gabbia OEP e le sposta in una penna vicina. Se le celle di interesse rimangono in seguito alla scrittura automatica, utilizzare la funzione penna manuale per selezionare le celle di destinazione (con un clic del mouse) e una penna di destinazione (con un clic successivo del mouse).
  5. Una volta completato il penning (quando la funzione Autopen viene completata o quando è stato raggiunto il numero desiderato di celle penned), sciacquare il chip con 3 cicli di 250 μL di mezzi di coltura per cancellare qualsiasi cella nonpenata rimanente dal chip.

3. Infezione a una cellula e imaging funzionale

  1. Dopo aver scritto le celle, ottenere immagini fluorescenti di cellule nei canali FITC, Texas Red e DAPI per misurare la fluo-4 basale, la mCherry e l'autofluorescenza.
  2. Infondere l'HIV-1 nel microchip ad una concentrazione di 13 ng di HIV-1 NL-CI per 2 x 106 cellule infilando lentamente la sospensione nel chip attraverso l'ago da esportazione.
  3. Immediatamente dopo l'aggiunta dell'HIV-1, ottenere ripetutamente immagini nei canali FITC e DAPI su un corso di 10 minuti.
  4. Ottenere immagini nei canali Texas Red e DAPI a 1, 2, 3 e 4 giorni dopo l'infezione (DPI).

4. Analisi dei dati di imaging funzionale a cella singola con il software FIJI

  1. In ogni punto di tempo di ogni canale di imaging di interesse, utilizzare lo strumento FIJI Point Selection e la funzione Measure per misurare i segnali Fluo-4, mCherry e autofluorescenza di ogni cella. Misurare simultaneamente la fluorescenza di fondo calcolando l'intensità media della fluorescenza (IFM) della penna e del chip contenenti ogni cella.
  2. Controllare la fluorescenza di fondo e l'autofluorescenza utilizzando la funzione Misura per trovare la IFM in una selezione regione e sottraendo questo valore dal valore di fluorescenza cellulare.
  3. Normalizzare la fluorescenza di sfondo di ogni immagine del chip: misurare la IFM del chip in ogni campo. Quindi sottrarre le IFM del chip con la minima fluorescenza di fondo da tutte le altre misurazioni MFI del chip.
  4. Normalizzare la fluorescenza di fondo di ogni penna contenente celle: misurare l'IFM della penna di ogni cella in ogni campo visivo. Quindi sottrarre questo valore dalla IFM non elaborati della cella per ogni campo.
  5. Controllo per l'autofluorescenza cellulare: sottrarre le IFM DAPI giorno 0 e giorno 4 di ogni cella dal giorno 0 e dal giorno 4 mMFry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

La figura 1 illustra il formato dei dati di imaging grezzo e del chip acquisiti attraverso il microscopio a fluorescenza. L'identificazione e il raggruppamento di cellule non infette e infette mediante misurazione mCherry sono mostrati nella figura 2. Questi ammassi vengono analizzati per la cinetica dell'afflusso di calcio nella figura 3, che dimostra l'afflusso precoce di calcio nelle cellule infettate dall'HIV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

La metodologia descritta per studiare la relazione tra l'afflusso di calcio e l'infezione produttiva dell'HIV-1 in singole cellule può essere adattata per studiare la cinetica del calcio intracellulare in risposta ad altri agonisti o antagonisti di interesse. La preparazione delle celle per l'imaging è semplice, minimamente richiede molto tempo e i reagenti sono disponibili in comodi kit di produttori ampiamente utilizzati. La misurazione del calcio a base di Fluo-4 è ben descritta in letteratura e l'HIV-1 può essere...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

R.P.S. è un dipendente di Sema4. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Siamo grati per le discussioni scientifiche con il dottor Benjamin Chen. Questo lavoro è stato finanziato da K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
 Beacon Optofluidic SystemBerkeley Lights
 Fetal Bovine SerumGibco
 FIJIOpen-source softwarePMID: 22743772, 22930834
 Fluo-4 Calcium Imaging KitThermo Fisher F10489
 HIV-1 NLCINL4-3Laboratory of Benjamin ChenPMID: 28148796
 Hyclone Pennecillin Streptomycin solutionGE Healthcare Life sciences SV30010
 MT-4 cellsNIH AIDS Reagent ARP-120
 OptoSelect 3500 chipBerkeley Lights
 Pipettor TipsDenville Scientific P3020-CPS
 Prism 9.0.0GraphPad
 RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich R8758
Serological PipettesFisher Brand 13-678-11E
Tissue Culture HoodVarious models
T75 flasksCorning3073

Riferimenti

  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585(2015).
  4. Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
  5. Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
  6. Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
  7. Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186(2019).
  8. Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
  9. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
  10. Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
  11. Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
  12. Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  13. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  14. He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
  15. Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425(2017).
  16. Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010(2018).
  17. Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247(2020).
  18. Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41(2018).
  19. Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
  20. Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692(2019).
  21. Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074(2018).
  22. Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Immunologia e infezioneNumero 171high throughoutoptofluidicoimaging a cellule viveinfezione da HIVafflusso di calciorecettore purinergico

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati