Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Riepilogo

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) ^{26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze} / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale degli iCM tramite il flusso di calcio (^Ca2+).

Abstract

La riprogrammazione cardiaca è diventata una terapia potenzialmente promettente per riparare un cuore danneggiato. Introducendo più fattori di trascrizione, tra cui Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in cardiomiociti indotti (iCM). Questi iCM, quando generati in situ in un cuore infartuato, si integrano elettricamente e meccanicamente con il miocardio circostante, portando ad una riduzione delle dimensioni della cicatrice e ad un miglioramento della funzione cardiaca. A causa dell'efficienza, della purezza e della qualità relativamente basse della riprogrammazione degli iCM, la caratterizzazione degli iCM rimane una sfida. I metodi attualmente utilizzati in questo campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR, si concentrano principalmente sull'espressione di geni e proteine cardiaco-specifici, ma non sulla maturazione funzionale degli iCM. Innescata dai potenziali d'azione, l'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti nei cardiomiociti porta ad un rapido afflusso di calcio nella cellula. Pertanto, quantificare il tasso di afflusso di calcio è un metodo promettente per valutare la funzione dei cardiomiociti. Qui, il protocollo introduce un metodo per valutare la funzione iCM in base al flusso di calcio (^Ca2+). Un ceppo di topo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 è stato stabilito incrociando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (indicato come Myh6-Cre di seguito) con topi Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (indicato come Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito). I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) di topi neonatali P0-P2 sono stati isolati e coltivati in vitro e una costruzione policistronica di MGT è stata introdotta negli NCF, che ha portato alla loro riprogrammazione in iCM. Poiché solo gli iCM riprogrammati con successo esprimeranno il reporter GCaMP3, la maturazione funzionale degli iCM può essere valutata visivamente dal flusso Di ^Ca2+ con microscopia a fluorescenza. Rispetto agli NCF non riprogrammati, gli NCF-iCM hanno mostrato un flusso transitorio di calcio significativo e una contrazione spontanea, simili ai CM. Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione del ceppo murino, l'isolamento e la selezione dei cuori dei topi neonatali, l'isolamento NCF, la produzione di retrovirus per la riprogrammazione cardiaca, l'induzione iCM, la valutazione del flusso di iCM ^{Ca2 +} utilizzando la nostra linea reporter e la relativa analisi statistica e presentazione dei dati. Si prevede che i metodi qui descritti forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli iCM per gli studi di riprogrammazione cardiaca.

Introduzione

L'infarto miocardico (MI) è una malattia grave in tutto il mondo. Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo e rappresentano circa 18,6 milioni di decessi nel 20191,2. La mortalità totale delle CVD è diminuita nell'ultimo mezzo secolo. Tuttavia, questa tendenza è stata rallentata o addirittura invertita in alcuni paesi non ^sviluppati1, il che richiede trattamenti più efficaci delle CVD. Come una delle manifestazioni fatali di CVD, MI rappresenta circa la metà di tutti i decessi attribuiti a CVD negli Stati ^Uniti2. Durante l'ischemia, con il blocco delle arterie coronarie e l'apporto limitato di nutrienti e ossigeno, il miocardio subisce gravi cambiamenti metabolici, compromette la funzione sistolica dei cardiomiociti (CM) e porta alla morte del ^CM3. Numerosi approcci nella ricerca cardiovascolare sono stati esplorati per riparare le lesioni cardiache e ripristinare la funzione del cuore ^ferito4. La riprogrammazione cardiaca diretta è emersa come una strategia promettente per riparare il cuore danneggiato e ripristinarne la ^funzione5,6. Con l'introduzione di Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in iCM in vitro e in vivo, e questi iCM possono ridurre l'area cicatriziale e migliorare la funzione cardiaca7,8.

Sebbene la riprogrammazione cardiaca sia una strategia promettente per il trattamento dell'infarto miocardico, rimangono una serie di sfide. In primo luogo, l'efficienza, la purezza e la qualità della riprogrammazione non sono sempre così alte come previsto. L'incentivo MGT può raggiungere solo l'8,4% (cTnT+) o il 24,7% (αMHC-GFP+) del totale dei CF da riprogrammare in iCM in vitro7, o fino al 35% in ^vivo8, il che ne limita l'applicazione. Anche con più fattori indotti nel sistema, come ^Hand29 o Akt1 / ^PKB10, l'efficienza di riprogrammazione è ancora appena soddisfacente per essere utilizzata in un ambiente clinico. Pertanto, sono necessari ulteriori studi incentrati sul miglioramento dell'efficienza di riprogrammazione in questo campo. In secondo luogo, l'integrità elettrica e le caratteristiche di contrazione degli iCM sono importanti per il miglioramento efficiente della funzione cardiaca, ma sono difficili da valutare. Attualmente, i metodi di valutazione ampiamente utilizzati nel campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR di alcuni importanti cv di espressione dei geni, sono tutti focalizzati sulla somiglianza di iCM e CM, ma non direttamente correlati alle caratteristiche funzionali degli iCM. Inoltre, tali metodi hanno procedure relativamente complicate e richiedono molto tempo. Mentre gli studi di riprogrammazione di solito comportano uno screening dei potenziali fattori di riprogrammazione che promuovono la maturazione degli ^iCM11, la riprogrammazione cardiaca richiede un metodo rapido e conveniente basato sulla funzione degli iCM.

I CM aprono i canali ionici del calcio voltaggio-dipendenti sulla citomembrana durante ogni ciclo di contrazione, il che porta ad un afflusso transitorio di ioni calcio (^Ca2+) dal fluido intercellulare al citoplasma per partecipare alla contrazione del miofilamento. Tale ciclo di afflusso e deflusso di ^Ca2+ è il tratto fondamentale della contrazione miocardica e costituisce la normale funzione delle ^CM12. Pertanto, un metodo che rileva l'afflusso di ^Ca2+ potrebbe essere un modo potenziale per misurare la funzione delle CM e delle celle simili a CM, compresi gli iCM. Inoltre, per gli iCM, tale metodo fornisce un altro modo per valutare l'efficienza della riprogrammazione.

Indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per indicare le attività cellulari, in particolare i potenziali d'azione. Generalmente, i GECI sono costituiti da un dominio di legame ^Ca2+ come la calmodulina e da un dominio fluorescente come GFP, e GCaMP3 è uno con alta intensità di affinità e fluorescenza. Il dominio di fluorescenza di GCaMP3 verrà attivato quando la concentrazione locale di calcio viene ^modificata13. In questo articolo, viene descritto un ceppo di topo che esprime specificamente un reporter GCaMP3 in cellule Myh6+. Introducendo MGT nei NCF isolati dai neonati di questo ceppo, la riprogrammazione può essere monitorata mediante fluorescenza, che esporrà con successo iCM riprogrammati. Un tale ceppo e metodo di topo fornirà una preziosa piattaforma per studiare la riprogrammazione cardiaca.

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Protocollo

Tutte le procedure e le pratiche sperimentali che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care & Use Committee dell'Università del Michigan. Tutte le procedure e le pratiche sperimentali che coinvolgono la coltura cellulare devono essere eseguite BSL2 Biological Safety Cabinet in condizioni sterili. Per le procedure e le pratiche che coinvolgono i virus, è stata seguita la linea guida del corretto smaltimento delle cellule trasfettate, delle punte delle pipette e dei tubi per evitare il rischio di rischi per l'ambiente e la salute.

1. Istituzione di un ceppo di mouse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38^{(CAG-GCaMP3)Hze} /J (denominato Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Figura 1)

1. Preparare il ceppo di topo Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Jackson lab stock 009074, denominato Myh6-Cre) e Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J ceppo di topo (Jackson lab stock 014538, denominato Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), rispettivamente.
2. Allevare ogni ceppo fino a 8 settimane per ottenere topi adulti Myh6-Cre e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, rispettivamente.
3. Incrociamo i topi adulti Myh6-Cre e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
   NOTA: Impostare Myh6-Cre maschio / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 femmina o viceversa. Non vi è alcuna differenza significativa tra i loro discendenti. Tipicamente, i topi femmina daranno alla luce 8-10 cuccioli 19-21 giorni dopo l'incrocio.

2. Isolamento e selezione dei cuori neonatali dei topi Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.

1. Ottieni cuccioli P0-P2. Assicurarsi che siano presenti 8-10 cuccioli per isolare 10 milioni di NCF con questo protocollo.
2. Anestetizzò profondamente i cuccioli per ipotermia. Mettere i cuccioli in un guanto di lattice e immergerli fino al collo in ghiaccio tritato e acqua (2° C - 3 °C).
3. Disinfettare brevemente i cuccioli con il 75% di etanolo.
4. Sacrifica i cuccioli per decapitazione con forbici sterili.
5. Fai un'incisione orizzontale vicino al cuore, stringi il cuore e poi isolalo separandolo alla radice dell'aorta con le forbici.
6. Osservare il cuore che batte sotto un microscopio a fluorescenza. Assicurarsi che i cuori con il genotipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mostrino il flusso Di ^Ca2+ indicato da GCaMP3 con battito cardiaco. Gli altri genotipi non mostrano fluorescenza (Figura 2, Video 1 e Video 2).

3. Isolamento dei fibroblasti cardiaci neonatali (NCF)

NOTA: Per questa parte, il protocollo del ^Lab14 del Dr. Li Qian è stato adottato con ottimizzazioni minori quando applicabile a questo studio.

1. Dopo l'isolamento dei cuori αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, tagliarli in quattro pezzi che sono liberamente collegati. Lavarli in DPBS ghiacciato in una piastra da 6 cm accuratamente più volte per limitare l'inquinamento delle cellule del sangue nelle cellule isolate.
2. Trasferire i cuori in un tubo conico da 15 ml.
3. Digerire i cuori con 8 ml di tripsina-EDTA calda allo 0,25% a 37 °C per 10 min.
4. Scartare la tripsina surnatante e aggiungere 5 mL di collagenasi calda di tipo II (0,5 mg/mL) in HBSS.
5. Vorticare accuratamente la miscela e incubare a 37 °C per 5 minuti.
6. Dopo l'incubazione, vortice accuratamente e lasciare che il tessuto non digerito si stabilizzi per gravità.
7. Raccogliere il surnatante in un tubo conico da 15 ml con 5 mL di fibroblasti freddi (FB) medio (IMDM con 20% FBS e 1% penicillina/streptomicina).
8. Ripetere i passaggi 3.4-3.7 per il tessuto non digerito 4-5 volte.
9. Raccogliere tutto il surnatante insieme e filtrare il surnatante con un filtro da 40 μm.
10. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
11. Risospese le celle in 10 mL di buffer di smistamento cellulare attivato magneticamente (buffer MACS; 1x PBS con 2 mM EDTA e 0,5% BSA).
12. Determinare il numero di cellule vitali mediante colorazione blu tripano.
    1. Prelevare 10 μL di cellule da 10 mL di sospensione cellulare nel passaggio 3.11.
    2. Mescolare con 10 μL di soluzione blu di tripano allo 0,4% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere la miscela a un emocitometro e determinare il numero di cellule vitali. Le cellule morte sono macchiate di blu, mentre le cellule vitali sono non macchiate.
13. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
14. Risospesso le cellule con 10 μL di microsfere Thy1.2 in 90 μL di tampone MACS refrigerato per meno di 10 milioni di cellule vitali. Aggiungi più perline proporzionalmente se ci sono più di 10 milioni di cellule vitali. Pipettare bene la miscela e incubare a 4 °C per 30-60 min.
15. Aggiungere 10 ml di buffer MACS e mescolare bene.
16. Centrifugare a 200 x g per 5 min, scartare il surnatante.
17. Ripetere una volta i passaggi 3.15-3.16.
18. Sospendere le celle e le perline con 2 ml di buffer MACS.
19. Impostare un separatore MACS nella cappa. Inserire una colonna LS nel separatore ed equilibrare la colonna con 3 mL di buffer MACS.
20. Quando la colonna LS è bilanciata, passare le celle attraverso la colonna.
21. Lavare la colonna LS con 2 mL di buffer MACS tre volte.
22. Togliere la colonna dal separatore, eluirla con 2 mL di buffer MACS tre volte, quindi raccogliere l'eluizione in un tubo da 50 ml.
23. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
24. Risospendare le celle con 5 ml di media FB.
25. Determinare il numero di cellule con un emocitometro.
26. Diluire le cellule con mezzi FB e seminare le cellule in piatti o piatti come desiderato. Assicurarsi che la densità di semina cellulare sia di circa 2-2,5 x ¹⁰⁴ celle/^cm2 (ottimizzare la densità in base ai singoli esperimenti). Assicurarsi che i fibroblasti attaccati abbiano una forma da ovale a rotonda il secondo giorno dopo la semina (Figura 3).

4. Produzione di retrovirus che codifica per il vettore MGT policistronico per la riprogrammazione cardiaca

1. Mantenere Plat-E con terreni di coltura Plat-E (DMEM integrato con 10% FBS, 1 μg/mL di puromicina e 10 μg/mL di blasticidina) a 37 °C con il 5% di _CO2.
2. Il giorno 1, dividere Plat-E in una piastra a 6 pozzetti a circa 4-5 x ¹⁰⁵ celle / densità del pozzo.
3. Il giorno 2, Plat-E raggiunge in genere l'80% di confluenza. Trasfettare le cellule con le seguenti procedure. Regola il volume e la quantità di ogni elemento qui presente in base a ciascun pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
   1. Diluire 2 μg di vettore plasmide di espressione del retrovirus policistronico pMX-puro-MGT (Addgene 111809) a 500 ng/μL con tampone TE.
   2. Preparare la miscela di trasfezione mescolando 10 μL di lipofectamine con 150 μL di mezzo sierico ridotto. Pipettare con cura per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Fare attenzione a evitare le bolle durante il pipettaggio.
   3. Nel frattempo, preparare una miscela di plasmidi mescolando il plasmide con 150 μL di mezzo sierico ridotto. Pipettare con cura per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Fare attenzione a evitare le bolle durante il pipettaggio.
   4. Mescolare con cura le due miscele e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. La soluzione potrebbe apparire torbida.
   5. Aggiungere la miscela goccia a goccia alle cellule da trasfettare.
   6. Incubare le cellule a 37 °C durante la notte.
4. Il giorno 3, cambiare il mezzo in un terreno di coltura cellulare completo fresco privo di puromicina e blasticidina.
5. Il giorno 4, 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante che contiene retrovirus e conservarlo a 4 °C.
6. Il giorno 5, 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante che contiene retrovirus.
7. Filtrare sia il surnatante da 48 h che da 72 h con un filtro da 0,45 μm, precipitare durante la notte a 4 °C aggiungendo 1/5 di volume di soluzione al 40% di Poli (glicole etilenico) (PEG) per ottenere una concentrazione finale di PEG all'8%.
8. Centrifugare a 4.000 x g per 30 minuti per far precipitare il virus.
   NOTA: il virus PEG8000 forma piccole precipitazioni bianche.
9. Risospesare il virus con un mezzo iCM contenente 8 μg/mL di polibrene come desiderato. Utilizzare immediatamente il retrovirus.

5. Riprogrammazione di NCF in iCM con infezione da retrovirus codificante MGT

1. Crescere o passare NCF prima dell'infezione da virus.
   NOTA: Di solito, NCF può essere passato due volte.
2. Il giorno 0, seme NCF alla densità di circa 1-2 x ¹⁰⁴ cellule / ^cm2 in mezzo FB.
3. Il giorno 1, sostituire il terreno di coltura con un mezzo contenente virus per ogni bene desiderato. Utilizzare il virus da un pozzo Plat-E in una piastra a 6 pozzetti per infettare due pozzetti in una piastra a 24 pozzetti. Legare il virus per determinare la concentrazione ottimale del virus.
   NOTA: Virus contenenti altri fattori di riprogrammazione di interesse potrebbero essere introdotti insieme al retrovirus MGT.
4. Incubare a 37 °C durante la notte.
5. Il giorno 2, 24 ore dopo l'infezione da virus, sostituire il mezzo contenente virus con un normale mezzo iCM.
6. Per monitorare l'espressione di GCaMP3, placcarla al microscopio a fluorescenza invertita. Sotto 10x al canale GFP, osserva la lieve fluorescenza basale GCaMP3 di una porzione di cellule già al giorno 5.
7. Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni durante la riprogrammazione. Se necessario, eseguire una selezione positiva per le cellule infette da retrovirus MGT aggiungendo 2 μg/mL di puromicina al terreno di coltura per 3 giorni e mantenendolo a 1 μg/mL.
   NOTA: introdurre sostanze chimiche di interesse (ad esempio, IGF-1, MM589, A83-01 e PTC-209, denominate IMAP come riportato in ^precedenza15) insieme al cambiamento medio.
8. Dopo 14 giorni di infezione, sostituire il mezzo con il mezzo B27 per indurre ulteriormente la maturazione iCM.

6. Valutazione della maturazione funzionale iCM e dell'efficienza di riprogrammazione mediante flusso Di ^Ca2+

NOTA: Aggiungere 1 μM di isoproterenolo alle cellule da valutare prima della valutazione, se necessario.

1. Valutare il flusso di ^Ca2+ con un microscopio a fluorescenza invertita a temperatura ambiente.
2. Nel canale GFP, osservare le celle GCaMP3+ sotto l'obiettivo 10x. Assicurati che mostri il battito cellulare spontaneo nel canale del campo luminoso.
3. Selezionare casualmente tre campi sotto 20x e registrare il flusso ^Ca2+ degli iCM per 3 min per ogni campo.
   NOTA: Qui, il flusso di ^{Ca2 +} è stato sincronizzato con il battito cellulare spontaneo (Figura 4, Figura 5 e Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8).
4. Quantificare manualmente le cellule con flusso ^{di Ca2} +.

7. Analisi statistica e presentazione dei dati

1. Analizza le differenze tra i gruppi analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) ed esegui i test di confronto multipli Student-Newman-Keuls.
   NOTA: I risultati sono nella media ± S.E con p < 0,05 considerato statisticamente significativo. Ogni esperimento è stato eseguito almeno tre volte.

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Risultati

Il flusso di lavoro sperimentale per generare il ceppo di topo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e la struttura genica dei topi transgenici sono mostrati nella Figura 1. Mentre il ceppo di topo è stabilito, i cuori dei cuccioli sono stati isolati e osservati al microscopio a fluorescenza inversa per confermare il genotipo. I cuori con genotipo corretto mostrano il flusso di ^Ca2+ sincronizzato con il battito, visualizzato come fluorescenza GCaMP3, mentre non è stata osservat...

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Discussione

La valutazione della funzione degli iCM è necessaria per il campo della riprogrammazione cardiaca. In questo manoscritto, il protocollo descrive un ceppo di topo Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38^{(CAG-GCaMP3)Hze}/J che è stato stabilito, come utilizzare gli NCF isolati dai topi neonatali in questo ceppo per la riprogrammazione in iCM e la valutazione della funzione degli iCM mediante flusso di ^Ca2 +. Questo è un metodo de novo per valutare la maturazione funzionale degli iCM.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365