Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

Riepilogo

Forniamo protocolli a chiunque abbia una mente di "cultura maker" per iniziare a costruire un laboratorio aereo per l'analisi quantitativa di una miriade di parametri comportamentali in Drosophila melanogaster, stampando in 3D molte delle apparecchiature necessarie. Descriviamo anche un protocollo di respirometria ad alta risoluzione che utilizza le larve per combinare dati comportamentali e sul metabolismo mitocondriale.

Abstract

L'utilità della Drosophila come organismo modello per lo studio delle malattie umane, dei comportamenti e della biologia di base è indiscutibile. Sebbene pratica, la ricerca sulla Drosophila manca di popolarità nei paesi in via di sviluppo, probabilmente a causa dell'idea disinformata che creare un laboratorio ed eseguire esperimenti pertinenti con insetti così piccoli sia difficile e richieda apparecchiature costose e specializzate. Qui, descriviamo come costruire un flylab economico per analizzare quantitativamente una miriade di parametri comportamentali in D. melanogaster, stampando in 3D molte delle attrezzature necessarie. Forniamo protocolli per costruire internamente rastrelliere per fiale, arene di corteggiamento, apparecchi per saggi locomotori, ecc., da utilizzare per il mantenimento generale delle mosche e per eseguire esperimenti comportamentali utilizzando mosche e larve adulte. Forniamo anche protocolli su come utilizzare sistemi più sofisticati, come un ossigrafo ad alta risoluzione, per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale nei campioni larvali e mostrare la sua associazione con i cambiamenti comportamentali nelle larve in seguito all'espressione xenotopica della mitocondriale ossidasi alternativa (AOX). L'AOX aumenta l'attività larvale e la respirazione con perdita mitocondriale e accelera lo sviluppo a basse temperature, il che è coerente con un ruolo termogenico per l'enzima. Speriamo che questi protocolli ispirino i ricercatori, soprattutto dei paesi in via di sviluppo, a utilizzare Drosophila per combinare facilmente i dati sul comportamento e sul metabolismo mitocondriale, che possono portare a informazioni sui geni e/o sulle condizioni ambientali che possono anche regolare la fisiologia umana e gli stati patologici.

Introduzione

La Drosophila melanogaster è stata introdotta nella comunità scientifica come organismo modello potenzialmente potente più di 100 anni fa. Questo potenziale è stato fermamente convalidato in diverse aree delle scienze biologiche e biomediche, come la genetica, l'evoluzione, la biologia dello sviluppo, la neurobiologia e la biologia molecolare e cellulare. Di conseguenza, sei premi Nobel per la medicina o la fisiologia sono stati assegnati a dieci ricercatori di Drosophila che hanno contribuito in modo sostanziale alla nostra comprensione dell'ereditarietà, della mutagenesi, dell'immunità innata, dei ritmi circadiani, dell'olfatto^{e dello sviluppo}. Forse ancora più importante, D. melanogaster non ha smesso di fornirci nuovi modelli di biologia e malattie umane, poiché una rapida ricerca su PubMed rivela quasi 600 pubblicazioni negli ultimi 5 anni, utilizzando il termine di ricerca "modello drosophila" (², a febbraio 2021). Negli Stati Uniti, dove la Drosophila è un organismo modello molto diffuso nella comunità biomedica, circa il 2,2% di tutti i premi di ricerca R01 assegnati dal NIH nel 2015 sono stati assegnati^{ai ricercatori di} Drosophila. In Brasile, invece, una ricerca di progetti attualmente finanziati sul sito della Sao Paulo Research Foundation (FAPESP), la più importante agenzia di finanziamento per la ricerca in tutte le aree scientifiche nello stato di San Paolo, ha mostrato solo 24 grant e fellowship con la Drosophila come principale oggetto di studio⁴. Considerando tutti i 13205 progetti attualmente finanziati da FAPESP (⁵, a febbraio 2021), questi 24 progetti di Drosophila rappresentano un rapporto inferiore allo 0,2% del totale dei progetti, che è quasi 12 volte inferiore a quello del NIH. Se togliamo i progetti finanziati che mirano a studiare la Drosophila da un punto di vista ecologico e/o evolutivo, e assumiamo che i progetti rimanenti utilizzino questo organismo come modello per comprendere i processi biologici umani in salute e malattia, tale rapporto diminuisce a uno scioccante ~0,1%.

In effetti, un'indagine adeguata è giustificata per rivelare le ragioni per cui la ricerca sulla Drosophila in Brasile/San Paolo non sembra essere così significativa nel numero di progetti finanziati. Coltivare la Drosophila non è costoso ^6,7,8 ed è relativamente semplice, poiché a differenza dei vertebrati, non è necessaria alcuna autorizzazione da parte di un comitato bioetico per la sperimentazione ^9,10. Tuttavia, in Brasile¹¹ è richiesta un'approvazione per lavorare con lenze da mosca geneticamente modificate, aggiungendo uno strato di burocrazia inerente a tutto il lavoro che coinvolge organismi geneticamente modificati. Tuttavia, questo probabilmente non impedirebbe ai ricercatori interessati di avviare un flylab. Ipotizziamo che la disinformazione sulla potenza del modello e sugli alti costi previsti associati alla creazione di un flylab e all'esecuzione di esperimenti significativi siano fattori importanti in questa decisione. Come per la maggior parte delle attrezzature e delle forniture scientifiche, gli apparati appropriati per eseguire la manutenzione generale delle mosche e le analisi comportamentali devono essere importati in Brasile dal Nord America, dall'Europa e/o da altri paesi, il che è un processo costoso ed estremamente dispendioso in termini di tempo^12,13.

Recentemente, è emersa un'alternativa all'importazione di apparecchiature specializzate poiché le stampanti 3D sono diventate più convenienti e accessibili a qualsiasi persona, compresi i ricercatori di Drosophila nei paesi in via di sviluppo. La tecnologia di stampa 3D è stata ampiamente utilizzata negli ultimi 10 anni dai membri della "cultura maker", che si basa sull'idea di autosufficienza piuttosto che affidarsi esclusivamente ai prodotti fabbricati dall'azienda¹⁴. Un'idea del genere è sempre stata presente nei laboratori di ricerca accademica di tutto il mondo, quindi non sorprende che le stampanti 3D siano diventate apparecchiature di laboratorio standard in molti luoghi^15,16. Per un certo numero di anni, abbiamo stampato in 3D rastrelliere per fiale di mosche, arene di accoppiamento, apparecchi per l'arrampicata, tra gli altri dispositivi, per una frazione del costo degli equivalenti di marca. I costi ridotti per la stampa e l'assemblaggio di attrezzature da laboratorio fatte in casa sono classicamente rappresentati dal FlyPi, che può essere costruito per meno di € 100,00 e funge da microscopio ottico e a fluorescenza in grado di utilizzare una sofisticata stimolazione opto- e termogenetica del pesce zebra, della Drosophila e dei nematodi geneticamente trattabili¹⁵. Qui, forniamo una serie di protocolli per chiunque sia interessato a diventare un ricercatore di Drosophila (o ad espandere il proprio flylab esistente) per stampare in 3D molto del materiale necessario. Investendo tempo e sviluppando un po' di esperienza, il lettore sarà anche in grado di ottimizzare i protocolli qui presentati per stampare apparati più adatti alle proprie esigenze di ricerca.

Tuttavia, un flylab non è un luogo solo per attrezzature "economiche", soprattutto quando si intende associare le analisi comportamentali ai fenomeni metabolici sottostanti. Ci siamo anche interessati al ruolo dei mitocondri nella modulazione dei pattern comportamentali di Drosophila, poiché questi organelli sono responsabili della produzione di massa di ATP nella maggior parte dei tessuti attraverso diverse vie metaboliche i cui prodotti convergono verso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). L'analisi del consumo di ossigeno mitocondriale come un modo per comprendere il metabolismo mitocondriale richiede un ossigrafo, che è un'apparecchiatura più sofisticata che purtroppo non può ancora essere stampata in 3D. Poiché l'OXPHOS influisce praticamente su tutti i processi cellulari poiché dipende da una serie di reazioni redox esoergoniche che si verificano nella cellula^17,18, i tassi di consumo di ossigeno basati sul substrato ossidabile fornito ai mitocondri possono aiutare a rivelare se il funzionamento dell'organello è causa o conseguenza di un particolare comportamento. Pertanto, forniamo anche qui un protocollo per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale nei campioni di larva, poiché ci rendiamo conto che la stragrande maggioranza dei protocolli pubblicati si concentra sull'analisi di campioni adulti. Abbiamo dimostrato che i cambiamenti nella respirazione mitocondriale, indotti dall'espressione transgenica della Ciona intestinalis alternative ossidasi (AOX), portano ad un aumento della mobilità larvale sotto stress da freddo. Ciò è molto probabilmente dovuto alla termogenesi, poiché AOX è un'ossidasi terminale non pompante protoni che può bypassare l'attività dei complessi OXPHOS III e IV (CIII e CIV), senza contribuire al potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) e alla produzione di ATP 19,20,21. Nessun insetto, inclusa la Drosophila, o vertebrato possiede naturalmente AOX 21,22,23, ma la sua espressione in una miriade di sistemi modello 24,25,26,27,28,29 è riuscita a mostrare il suo potenziale terapeutico per condizioni di stress respiratorio mitocondriale generale, specialmente quando causato da CIII e/o CIV sovraccarico. AOX conferisce resistenza a livelli tossici di antimicina A²⁴ e cianuro^24,25 e mitiga diversi fenotipi correlati alla disfunzione mitocondriale 24,25,30,31,32. Il fatto che l'espressione di AOX modifichi il comportamento larvale e la funzione mitocondriale giustifica studi più approfonditi sul ruolo di questo enzima nel metabolismo e nella fisiologia delle cellule e dei tessuti metazoici^33,34.

Speriamo che con questo articolo possiamo contribuire a sensibilizzare la comunità scientifica dei paesi in via di sviluppo come il Brasile che utilizzando l'eccellente set di strumenti genetici presentati da D. melanogaster , in combinazione con apparati fatti in casa efficienti e convenienti per le analisi comportamentali, può generare dati di ricerca di base relativamente veloci su processi biologici interessanti con un impatto traslazionale significativo, supportare futuri studi terapeutici nella ricerca clinica. Lo sviluppo di tali ideali comunitari sarebbe di grande beneficio per i drosofili, i ricercatori medici e le scienze biologiche e biomediche. Soprattutto, andrebbe a vantaggio della società in generale, in quanto i finanziamenti pubblici potrebbero essere utilizzati in modo più traslazionale per comprendere e curare le malattie umane.

I protocolli che forniamo qui per la stampa 3D degli apparati per un flylab sono stati progettati per l'uso con la stampante 3D RepRap, basata sul modello Prusa I3 DIY disponibile a³⁵ anni. Utilizziamo il filamento di acido polilattico bianco (PLA) da 1,75 mm (SUNLU) come materia prima per la stampa, la piattaforma Tinkercad³⁶ per la progettazione del modello e il software Repetier-Host³⁷ per la conversione da STL a G-Code, un passaggio necessario per fornire le coordinate alla stampante. Un'ulteriore ottimizzazione dei protocolli è necessaria nel caso in cui il lettore desideri utilizzare attrezzature, materiali e software alternativi.

Protocollo

1. 3D progettazione del modello

NOTA: Il flusso di lavoro per la stampa 3D prevede tre passaggi fondamentali: (1) modellazione 3D; (2) importazione del modello nel software di slicing; e (3) la selezione del filamento corretto, la configurazione della stampante e, infine, la stampa. Di seguito è mostrato un protocollo di base per la modellazione di un piccolo rack/vassoio per fiale di mosche; Questo rack deve essere utilizzato con fiale per mosche standard, che hanno un diametro di circa 2,5 cm e un'altezza di 9,8 cm. Per la progettazione di nuovi modelli, gli strumenti forniti dal software Tinkercad consentono la facile gestione di strutture tridimensionali, creando pezzi di diverse forme, dimensioni e spessori, in base alle proprie esigenze. Per gli Drosofili che si avventurano per la prima volta nel regno della stampa 3D, seguire i protocolli seguenti, anche con tutti i loro dettagli, può essere ancora impegnativo, quindi consigliamo vivamente di familiarizzare con il software per ottenere i migliori risultati.

1. Accedi a Tinkercad online³⁸ (Figura 1A). Per accedere alla piattaforma, gratuitamente, è necessaria la registrazione preventiva con i propri dati personali.
2. Fare clic su Crea un nuovo progetto per iniziare un nuovo progetto e rinominare il progetto di conseguenza nell'angolo in alto a destra della finestra. Premere Invio per essere indirizzati al piano di lavoro del progetto (Figura 1B).
3. Verificare se il piano di lavoro ha le dimensioni corrette di 200 mm x 200 mm, facendo clic con il tasto sinistro del mouse su Modifica griglia nell'angolo in basso a destra (quadrato rosso nella Figura 1B). Nella finestra popup (Figura 1C), assicurarsi che le "Unità" siano millimetri e che le "Preimpostazioni" siano predefinite. Inserisci 200.00 nei campi "Larghezza" e "Lunghezza" e fai clic su Aggiorna griglia per salvare le modifiche.
4. Verificare se la griglia di snap è impostata su 1,0 mm (quadrato rosso nella Figura 1B). In caso contrario, fare clic sul menu a discesa e selezionare 1,0 mm.
5. Nel menu Forme di base a destra (quadrato blu 2 nella Figura 1B), selezionare una casella solida e trascinarla al centro del piano di lavoro.
6. Fare clic in un punto qualsiasi della casella nel piano di lavoro con il pulsante sinistro del mouse per visualizzarne i bordi e i vertici. Fare clic su qualsiasi vertice (che diventerà quindi rosso) per visualizzare le dimensioni della scatola (quadrati rossi nella Figura 1D). Fare clic con il tasto sinistro del mouse su ciascuna dimensione e digitare 130 mm per la lunghezza (L), 130 mm per la larghezza (L) e 40 mm per l'altezza (H). Centrare nuovamente la casella trascinandola al centro del piano di lavoro.
7. Fare clic sullo strumento Righello nell'angolo in alto a destra dello schermo (quadrato rosso 1 nella Figura 1E). Fare immediatamente clic sul vertice inferiore sinistro della casella, come indicato nella Figura 1E (quadrato rosso 2), per impostare il punto iniziale (x = 0, y = 0, z = 0) di un sistema di coordinate cartesiane tridimensionale. Si noti che la distanza tra il vertice selezionato e il punto iniziale della coordinata verrà ora visualizzata (quadrati rossi nella Figura 1F), dove "A", "B" e "C" rappresentano rispettivamente la distanza dagli assi x, y e z (che in questo caso dovrebbe essere zero).
8. Quindi, selezionare una casella vuota (foro) dal menu Forme di base a destra (quadrato blu 2 nella Figura 1B) e trascinarla sul piano di lavoro. Impostare le sue dimensioni su 30 (L) x 30 (L) x 40 (A) mm ed elevarlo di 2 mm dal piano di lavoro, digitando "2,00" nella casella di testo accanto alla punta della freccia verde nell'angolo in basso a destra della casella vuota (quadrato rosso nella Figura 1G). Posizionare la casella vuota all'interno della scatola solida a 2 mm di distanza dal punto iniziale della coordinata x,y, digitando "2.00" nelle caselle di testo accanto alle frecce verdi nell'angolo in basso a sinistra della casella (quadrati rossi nella Figura 1H; confrontare con la Figura 1G).
9. Con la casella vuota ancora selezionata, premere i tasti CtrL+D sulla tastiera per distribuire il comando "duplica" e creare una nuova casella vuota delle stesse identiche dimensioni. Posizionare la nuova casella vuota all'interno della casella piena, accanto alla prima casella vuota, digitando "34.00" nella casella di testo accanto alla freccia verde lungo l'asse y e "2.00" nelle caselle di testo accanto alle due frecce verdi rimanenti (quadrati rossi nella Figura 1I).
10. Ripetere questo passaggio, regolando le distanze corrette dal punto iniziale delle coordinate, fino a riempire l'intera scatola solida con scatole vuote distanziate di 2 mm l'una dall'altra (Figura 1J).
11. Seleziona tutte le caselle (quelle solide e vuote) facendo clic con il tasto sinistro del mouse e trascinando su tutta l'area. Premere i tasti CtrL+G sulla tastiera per distribuire il comando "gruppo" e creare un'unica casella con 16 spazi vuoti per le fiale di mosche (Figura 1K). Questo è il design finale del rack per fiale.
12. Fare clic su Esporta nell'angolo in alto a destra della finestra di Tinkercad. Nella finestra visualizzata (Figura 1L), selezionare Tutto nella struttura accanto a Includi e . STL in Per stampa 3D come tipo di file. Scegli un nome appropriato per il file di disegno e salvalo in una posizione appropriata nel computer.

2. 3D stampa

NOTA: In questa sezione, forniamo istruzioni su come utilizzare il file STL creato nel passaggio 1 e convertirlo nel file G-Code contenente le istruzioni di stampa sulla stampante 3D. Questo è il processo di slicing, per il quale utilizziamo il software Repetier-Host.

1. Scaricare il file supplementare 1 e salvarlo in una posizione appropriata nel computer. Si tratta di un file .rcp contenente le configurazioni della stampante da utilizzare di seguito. Per maggiori informazioni sul tipo di file .rcp, visitare il sito³⁹.
2. Aprire il software Repetier-Host, che dovrebbe essere già installato sul computer, seguendo le istruzioni da³⁷. Premere i tasti CtrL+O sulla tastiera per aprire il file STL sul computer creato nel Protocollo 1.
3. Una volta aperto, fare clic sul rack per fiale progettato e premere il tasto R sulla tastiera per aprire il menu di modifica sul lato destro dello schermo (quadrato rosso 1 nella Figura 2A). Centralizzare l'oggetto sul tavolo di stampa facendo clic sul pulsante Centra oggetto , indicato con il quadrato rosso 2 nella Figura 2A, nella scheda Posizionamento oggetto .
4. Fare clic sulla scheda Filtro dei dati (quadrato rosso 1 nella Figura 2B) accanto alla scheda Posizionamento oggetto , quindi fare clic sul pulsante Configurazione (quadrato rosso 2 nella Figura 2B) di seguito. Si noti che si aprirà una nuova finestra a sinistra in cui è possibile definire i parametri della stampante come la velocità, lo spessore dello strato e i supporti (vedere maggiori dettagli nella discussione di seguito).
5. Fare clic sul pulsante Importa (quadrato rosso 3 nella Figura 2E), selezionare File supplementare 1 dai file e premere Invio. Si noti che questo file .rcp (scaricato nel passaggio 2.1) fornisce i parametri per la configurazione automatica della stampante che abbiamo ottimizzato per questo rack di fiale.
6. Per completare la configurazione dei parametri di stampa, selezionare Nessuno per Tipo di supporto nel menu a destra (quadrato rosso 4 nella Figura 2E), poiché la stampa di questo pezzo non richiede un supporto per evitare piegature o altre deformità. In Densità di riempimento (quadrato rosso 5 nella Figura 2E), scegliere il 20% per creare una struttura solida (vedere maggiori dettagli su questi parametri nella discussione di seguito).
7. Fare clic su Slice with CuraEngine nell'angolo in alto a destra dello schermo per eseguire il programma di slicing e generare il G-Code, che contiene le informazioni necessarie alla stampante per stampare il pezzo. Si noti che nella scheda Anteprima di stampa nel menu a destra (accanto alla scheda Affettatrice ), verranno visualizzate le informazioni sul tempo e la quantità di materiale necessari per il completamento del processo di stampa (quadrato rosso 1 nella Figura 2F).
8. Fare clic su Salva per stampa SD per salvare il file G-Code in una scheda SD (quadrato rosso 2 nella Figura 2F). Si noti che il G-Code contiene le coordinate 3D del pezzo progettato, tagliate a strati, per il corretto funzionamento della stampante.
9. Inserire la scheda SD nella stampante 3D RepRap, quindi seguire le informazioni visualizzate sullo schermo della stampante per selezionare la stampa dalla scheda SD.
10. Selezionare il file G-Code del rack per flaconi. Si noti che la stampante si riscalderà automaticamente e inizierà a stampare il pezzo progettato, operazione che dovrebbe richiedere diverse ore. Il rack (Figura 3A) deve essere pronto per l'uso subito dopo il completamento del lavoro di stampa.

3. Apparecchi di analisi comportamentale

NOTA: I passaggi descritti nei protocolli 1 e 2 possono essere ripetuti con le opportune regolazioni per stampare diverse delle apparecchiature di laboratorio necessarie. Tuttavia, ci rendiamo conto che la progettazione di nuovi pezzi può essere impegnativa e dispendiosa in termini di tempo per gli utenti principianti di Tinkercad, quindi invece di fornire protocolli passo-passo su come progettare tutti i modelli, stiamo rendendo disponibili per il download diversi modelli di progettazione che abbiamo creato come file STL (vedi File supplementari 2-11).

1. Scarica il file supplementare 2 per un modello di un piccolo imbuto (Figura 3B), utilizzato abitualmente nei flylab per aiutare a trasferire le mosche adulte in nuove fiale o bottiglie evitando che le mosche striscino sulle pareti interne di questi contenitori per scappare.
2. Scarica il file supplementare 3 per un supporto per tappetino per maschiatura (Figura 3C), che può contenere una schiuma di etilene-vinil acetato o un tappetino di cotone spesso su cui è possibile picchiettare fiale o bottiglie di vetro quando si rovesciano le mosche in nuovi contenitori con cibo appena fatto.
3. Scarica il file supplementare 4 e il file supplementare 5 per il modello di un supporto per fotocamera che abbiamo chiamato Stalker (Figura 3D).
   NOTA: L'apparecchio consente di posizionare qualsiasi telecamera (professionale, webcam, telefoni cellulari, ecc.) sopra una base dove è possibile riprendere o registrare video una capsula di Petri contenente larve o mosche adulte. Stalker consente l'imaging del comportamento animale che avviene orizzontalmente, sempre alla stessa distanza dalla capsula di Petri, evitando di introdurre variabilità nelle misurazioni sperimentali se le registrazioni devono essere effettuate in giorni diversi, ad esempio, o se la telecamera deve essere utilizzata per un altro scopo tra le registrazioni. L'apparecchio è comodamente modulare e può essere facilmente assemblato dopo aver stampato la base e la parte superiore dal file supplementare 4 e i lati dal file supplementare 5. I quadrati di 1 cm² alla base, che possono essere evidenziati con un pennarello indelebile, aiutano a tracciare la distanza percorsa dai singoli animali. Stampa l'apparato (almeno la base) utilizzando un filamento bianco, in modo che ci sia abbastanza contrasto tra lo sfondo e gli animali per consentire al software di tracciamento di identificare ogni mosca.
4. Scarica il File Supplementare 6 per il design stampabile del Fly Motel (Figura 3E), che ha dieci arene di corteggiamento e accoppiamento (stanze) organizzate in modo da facilitare le registrazioni video di dieci singole coppie di accoppiamento alla volta. Si noti che il Fly Motel si basa sul dispositivo pubblicato nel⁴⁰, dove si trova una spiegazione dettagliata del suo utilizzo negli studi comportamentali. Oltre alle parti stampate in 3D, l'apparecchio richiede 12 viti (3 x 8 mm) per fissare la parte superiore a quella inferiore per stabilizzare il dispositivo assemblato, una lastra acrilica (60 x 60 x 3 mm) e una cerniera lampo. Poiché la struttura del Fly Motel è più complessa, forniamo anche un video didattico (File supplementare 7) su come assemblarlo correttamente, dato che sono disponibili tutti i pezzi necessari e un cacciavite.
5. Scarica il file supplementare 8 per il modello di un T-Maze (Figura 3F), che viene utilizzato per i saggi di memoria utilizzando mosche adulte. Una spiegazione dettagliata di come il T-Maze viene utilizzato per far associare alle mosche stimoli odorosi ripugnanti con il loro comportamento fototropico si trova nella pubblicazione originale⁴¹. L'apparecchio si avvale anche di due provette coniche traslucide da 15 mL, che si trovano comunemente in qualsiasi laboratorio e sono attaccate alle aperture circolari larghe 2 cm su ciascun lato del pezzo centrale. Si noti che la stampa del T-Maze richiede un supporto (vedere maggiori dettagli nella legenda della Figura 2). Selezionare "Ovunque" per Tipo di supporto (quadrato rosso 4 nella Figura 2E) dopo aver seguito i passaggi 2.1-2.6 sopra.
6. Scarica il File Supplementare 9 e il File Supplementare 10 per la progettazione delle parti stampabili della nostra versione dell'apparato per saggi di geotassi negativa iterativa rapida (RING) (Figura 3G), utilizzato per eseguire saggi rampicanti con mosche adulte di diversi genotipi o condizioni ambientali contemporaneamente, generando risultati in modo più standardizzato e ad alta produttività⁴². L'apparato RING è anch'esso modulare, e oltre alle parti stampate in 3D, richiede altri pezzi che possono essere facilmente acquistati online o in un negozio di ferramenta a basso costo: due alberi rettificati Φ8 x 300 mm, quattro cuscinetti lineari Φ8 mm, elastici (o pezzi di una corda), un pezzo di legno 240 x 60 x 20 mm per la base, e otto viti per legno (8 mm) per fissare le parti stampate alla base in legno. Scarica il file supplementare 11 per istruzioni su come assemblare il dispositivo una volta stampate o acquistate tutte le parti. Una spiegazione dettagliata di come utilizzare l'apparato RING si trova nella pubblicazione originale⁴².

4. Saggio della mobilità larvale

NOTA: Abbiamo ottimizzato questo protocollo, originariamente basato su Nichols et ^al.42, per studiare gli effetti dell'espressione di AOX sullo sviluppo di Drosophila sotto stress da freddo. Le linee 3xtubAOX²⁵ e w¹¹¹⁸, utilizzate rispettivamente come esempi di larve che esprimono AOX e di controllo, sono state coltivate con dieta standard²⁴ a 12 °C, secondo Saari et al.34. Consigliamo questo protocollo per analizzare la mobilità di campioni larvali di qualsiasi condizione genetica, coltivati in qualsiasi condizione ambientale di interesse.

1. Preparare le piastre di agar al 2% facendo bollire la quantità equivalente di agar in acqua deionizzata, versandola in piastre di Petri Φ90 X 15 mm e lasciandole solidificare a temperatura ambiente. Per piastre con un volume finale di 20 mL ciascuna, utilizzare 0,4 g di agar.
2. Raccogliere con cura le larve di L3 vaganti dal lato delle fiale/fiasche di coltura utilizzando un paio di pinze a punta tonda o un pennello e posizionare gli individui in una capsula di Petri Φ90 x 15 mm con acqua deionizzata per meno di 10 secondi per sciacquare le particelle di cibo attaccate al loro corpo.
3. Trasferisci le singole larve in piatti con agarosio e attendi 5 minuti affinché gli animali si acclimatino.
4. Posizionare i piatti contenenti la singola larva sopra una carta millimetrata (griglia da 0,2 cm² ), e contare il numero di linee attraversate dall'animale per 1 minuto, mentre si muove sopra l'agar. Ogni linea attraversata rappresenta una distanza di 2 mm. Ripetere la procedura con lo stesso individuo 10-15 volte per ottenere repliche tecniche.
5. Ripetere il passaggio 4.4 con almeno 8-10 individui provenienti da provette/matracci diversi, coltivati in tempi diversi per ottenere repliche biologiche della stessa linea.
6. Ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 per ottenere i dati per l'altra linea di mosca (o per tutte le linee che si intende analizzare).
7. Le stesse singole larve utilizzate nelle fasi 4.4-4.6 possono essere utilizzate per ottenere ulteriori dati sul movimento del corpo posizionando le piastre di agar con una singola larva sotto uno stereomicroscopio e contando il numero di contrazioni peristaltiche della parete corporea per 1 minuto. Ottenere repliche tecniche e biologiche per una stima della mobilità media tra le linee di mosca analizzate.
8. Applicare il test statistico per calcolare la probabilità che i valori di questi parametri di mobilità larvale siano distinti tra le linee di interesse. Poiché stiamo confrontando qui i dati di sole due righe, potrebbe essere applicato un test t di Student.

5. Respirometria mitocondriale con omogenati larvali

NOTA: Il seguente protocollo è stato ottimizzato per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale da omogenati larvali della linea 3xtubAOX che esprime AOX e del controllo w¹¹¹⁸, coltivati a 12°C, ma se ne consiglia l'uso anche per campioni larvali di qualsiasi condizione genetica e ambientale. Ci rendiamo conto che condurre tali esperimenti non dovrebbe essere incluso come un obiettivo "conveniente" per un flylab "fatto in casa", a differenza di tutti gli altri protocolli che forniamo in questo articolo, poiché è necessario un notevole investimento iniziale per un laboratorio per acquisire un ossigrafo ad alta risoluzione. Il protocollo deve essere utilizzato con l'Oxygraph-2k (O2k) e il software DatLab di Oroboros Instruments, quindi è necessaria un'ulteriore ottimizzazione nel caso in cui il lettore desideri utilizzare un'apparecchiatura alternativa.

1. Accendere l'O2k e avviare il software DatLab nel computer collegato all'ossigrafo. Le barre magnetiche all'interno delle camere di analisi dovrebbero iniziare a muoversi automaticamente. Rimuovere la soluzione di conservazione dell'etanolo dalle camere.
2. Lavare le camere almeno 3 volte con etanolo al 100% e 3 volte con acqua ultrapura.
3. In DatLab, la finestra O2k Control si aprirà automaticamente. In Temperatura di blocco [°C], immettere 12 °C (o la temperatura preferita nell'intervallo 2-47 °C) e premere OK.
4. Si aprirà automaticamente una seconda finestra, Modifica esperimento. Inserire i nomi dei campioni nei campi Campione , in base a ciò che verrà aggiunto nelle camere A e B, e premere Salva.
5. Aggiungere 1800 μL del tampone di saggio (120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 2% BSA, pH 7,4) in ciascuna camera e chiuderle parzialmente, consentendo comunque lo scambio di ossigeno con l'aria esterna. Lasciare che la concentrazione di ossigeno e i segnali del flusso di ossigeno si stabilizzino, mostrando fluttuazioni minime per almeno 10 minuti. Questa fase fornirà la calibrazione dell'apparecchiatura con l'aria esterna il giorno dell'esperimento (vedere i passaggi 6.3 e 6.4 di seguito per ulteriori dettagli sulle calibrazioni sperimentali).
6. Durante la fase di calibrazione dell'aria, iniziare la preparazione del campione raccogliendo accuratamente dalle provette/matracci di coltura 20 larve vaganti del genotipo appropriato, utilizzando un paio di pinze o un piccolo pennello.
7. Sciacquare ogni larva rapidamente ma accuratamente con acqua deionizzata o 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ e 2 mM KH₂PO₄) e trasferirle in un omogeneizzatore di vetro da 1 mL su ghiaccio, contenente 500 μL di tampone di isolamento ghiacciato (250 mM di saccarosio, 5 mM Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
8. Omogeneizzare le larve intere con 5 colpi e versare l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml su ghiaccio.
9. Aggiungere 300 μl di tampone di isolamento all'omogeneizzatore di vetro, macerare ulteriormente i tessuti larvali rimanenti con 3 colpi e versare nuovamente l'omogeneizzato nella stessa provetta da microcentrifuga su ghiaccio.
10. Aggiungere 200 μl di tampone di isolamento all'omogeneizzatore in vetro, macerare ulteriormente i tessuti larvali residui con 2 colpi e versare nuovamente l'omogeneizzato nella stessa provetta da microcentrifuga su ghiaccio.
11. Miscelare l'omogeneizzato finale (~1 mL) capovolgendo delicatamente la provetta due volte e tenerla in ghiaccio fino all'elaborazione del secondo campione.
12. Ripetere i passaggi 5.6-5.11 per ottenere l'omogenato larvale dell'altro genotipo.
13. Aprire le camere dell'ossigrafo A e B e trasferire 200 μl di ciascun omogenato al tampone di analisi in ciascuna camera, che a questo punto deve essere esattamente a 12 °C. Chiudere completamente le camere e lasciare che la concentrazione di ossigeno e i segnali del flusso di ossigeno si stabilizzino per circa 10 minuti.
14. Avviare le misurazioni del consumo di ossigeno aggiungendo a ciascuna camera 5 μl di una soluzione di piruvato 2 M, 2 M di prolina (concentrazione finale nelle camere = 5 mM ciascuna) e 7,5 μl di una soluzione di malato 0,4 M (1,5 mM). Attendere almeno 5 minuti per la stabilizzazione del segnale. Si noti che a questo punto, i mitocondri saranno caricati con substrati ossidabili per avviare le reazioni del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA). Qualsiasi aumento del segnale di consumo di ossigeno può essere dovuto alle funzioni delle proteine di disaccoppiamento (o ad altri fenomeni di disaccoppiamento) e può essere utilizzato per calcolare la respirazione generale disaccoppiata (nota anche come respirazione a perdita in assenza di adenilati, L_N- vedere Risultati rappresentativi per i dettagli).
15. Aggiungere in ciascuna camera 4 μL di una soluzione di ADP 0,5 M (1 mM) e attendere almeno 5 minuti per la stabilizzazione del segnale. Di solito si osserva immediatamente un aumento significativo del segnale di consumo di ossigeno, che rappresenta la respirazione fosforilativa ossidativa (OXPHOS). La maggior parte di questa respirazione OXPHOS è guidata dal complesso I (CI).
16. Aggiungere a ciascuna camera 2 μL di una soluzione di 0,05 M di antimicina A (0,05 mM) per inibire CIII e attendere almeno 5 minuti per la stabilizzazione del segnale. Per il campione di controllo w¹¹¹⁸ deve essere osservata una diminuzione del segnale di consumo di ossigeno fino ai livelli basali osservati prima dell'aggiunta di piruvato, prolina e malato. La respirazione mitocondriale da larve che esprimono AOX sarà parzialmente resistente all'antimicina-A, poiché gli elettroni possono ora essere diretti verso AOX. Circa il 40% della respirazione totale di OXPHOS dovrebbe rimanere dopo l'inibizione di CIII, che dovrebbe essere supportata esclusivamente da AOX.
17. Aggiungere a ciascuna camera 4 μL di una soluzione di 0,1 M di propil-gallato (0,2 mM) per inibire l'AOX e attendere almeno 15 minuti per la stabilizzazione del segnale. I livelli di consumo di ossigeno nei campioni larvali che esprimono AOX dovrebbero ora diminuire ai livelli basali osservati prima dell'aggiunta di piruvato, prolina e malato. Questa diminuzione dimostra che la respirazione resistente all'antimicina-A osservata è dovuta alla funzione AOX.
18. Aggiungere a ciascuna camera 1 μL di rotenone 0,01 M (0,005 mM) per inibire l'IC e attendere almeno 5 minuti per la stabilizzazione del segnale per ottenere il segnale di consumo di ossigeno del campione indipendente dalla respirazione mitocondriale. Questo segnale è solitamente basso come quello osservato prima dell'aggiunta di piruvato, prolina e malato.
19. Salva l'esperimento e chiudi il software DatLab.

6. Elaborazione dei dati di respirometria mitocondriale

NOTA: I valori di consumo di ossigeno sono ottenuti come media dei segnali di flusso di ossigeno in un determinato periodo di tempo e sono espressi come pmol O₂ consumato al secondo per mg di proteina totale nel campione. I valori vengono innanzitutto confrontati con la concentrazione massima di ossigeno disponibile nel tampone di saggio il giorno dell'esperimento, in base alla temperatura sperimentale (indicata come saturazione dell'aria) e alla concentrazione minima di ossigeno, che viene determinata in precedenza in ciascuna camera mediante l'aggiunta di Na₂S₂O₄ al tampone di saggio (vedere ⁴³ per le linee guida del produttore per ottenere la calibrazione dell'ossigeno zero). I valori sono anche normalizzati dalla quantità di proteine totali negli omogenati larvali aggiunti al tampone di saggio di ciascuna camera.

1. Determinare la concentrazione proteica totale di ciascun campione utilizzando il metodo Bradford⁴⁴. Riapri l'esperimento salvato sul software DatLab, premi Esperimento nel menu in alto, quindi su Modifica. Nella finestra che si apre, selezionare mg nella sezione Unità e nella sezione Quantità inserire la quantità di proteine contenuta nei 200 μL del campione aggiunto in ciascuna camera. La concentrazione verrà calcolata automaticamente dal software, considerando il volume totale della camera di 2 mL. Premere il pulsante Salva .
2. Premere Grafico nel menu in alto, quindi Seleziona grafici. Nella finestra che si apre, selezionare Flusso per massa per entrambi i grafici (1 e 2, che si riferiscono rispettivamente alle camere A e B). Premere Ok. Il risultato sperimentale è ora normalizzato dalla concentrazione proteica dei campioni (pmol O₂/s/mg di proteina totale).
3. Nell'angolo in alto a destra di ogni grafico (1 e 2) della pagina principale dei risultati sperimentali, fare clic su Concentrazione di O₂. Lungo l'asse x, identificare un intervallo di tempo prima dell'aggiunta dei campioni nelle camere, in cui la concentrazione di ossigeno e i segnali di flusso sono molto stabili.
   1. Tenere premuto il tasto Maiusc sulla tastiera del computer, fare clic con il tasto sinistro del mouse sull'ora selezionata inizialmente, trascinare il cursore lungo l'asse del tempo per selezionare la regione desiderata e rilasciare il pulsante del mouse. Eseguire questa procedura per ciascuno dei grafici singolarmente.
   2. Fare doppio clic sulle barre blu delle aree selezionate nella parte inferiore dei grafici e digitare "aria" per indicare che queste sono le regioni selezionate utilizzate per calcolare la saturazione dell'ossigeno nell'aria.
4. Fare clic su Calibrazione nella barra dei menu in alto e selezionare A: Ossigeno, O₂ per calibrare la camera A. Nella finestra aperta, verificare che O₂ Calib sia selezionato (colore giallo).
   1. Per la calibrazione dello zero, fare clic su Copia da file e scegliere il file con la calibrazione dell'ossigeno zero eseguita in precedenza (vedere ⁴³ per le linee guida del produttore).
   2. Per Calibrazione aria, selezionare aria nella colonna Seleziona contrassegno . Fare clic su Calibra e copiare negli appunti.
5. Fare clic su Calibrazione nella barra dei menu in alto, selezionare B: Ossigeno, O₂ e ripetere il passaggio 6.4 per calibrare la camera B.
6. Nell'angolo in alto a destra di ciascun grafico (1 e 2) della pagina principale dei risultati sperimentali, fare clic su O₂ flusso per massa. Selezionare le regioni stabili desiderate del segnale di consumo di ossigeno tenendo premuto il tasto Maiusc sulla tastiera, facendo clic con il tasto sinistro del mouse e trascinando il cursore lungo l'asse del tempo. Le regioni stabili selezionate tra le aggiunte di piruvato/prolina/malato e ADP rappresentano la L_N; tra ADP e antimicina A, OXPHOS; tra l'antimicina A e il gallato di propile (in seguito all'inibizione della CIII), respirazione resistente all'antimicina A; tra gallato di propile e rotenone (su inibizione di CIII+AOX), respirazione residua; dopo rotenone (su inibizione CI+CIII+AOX), respirazione residua non mitocondriale. Fare doppio clic sulle barre rosse delle aree selezionate nella parte inferiore dei grafici e inserire le etichette appropriate.
7. Fai clic su Indicatori nella barra dei menu in alto, quindi su Statistiche. Nella scheda Mostra della finestra aperta, deselezionare tutte le opzioni tranne O₂ flusso per massa. Nella scheda Seleziona della stessa finestra, selezionare la camera A per ottenere i dati di respirazione per il primo campione. Fare clic su Copia negli appunti e incollare i dati in un foglio di calcolo. Ripetere la procedura per ottenere i dati per il secondo campione nella camera B.
8. In un foglio di calcolo, sottrarre tutti i valori di respirazione per la respirazione residua non mitocondriale (i dati dopo l'aggiunta del rotenone). Calcola le medie da più repliche sperimentali e traccia i dati come preferisci.

Risultati

Seguendo i passaggi nei protocolli 1 e 2, si dovrebbe essere in grado di progettare un semplice rack per fiale volanti ed eseguire il file STL del modello attraverso il programma di slicing per generare le coordinate per la stampante 3D. La Figura 3A mostra un'unità stampata del modello accanto al suo design. Speriamo anche che il passaggio 1 possa fornire le competenze di base per utilizzare le forme di base disponibili nella piattaforma Tinkercad per crea...

Discussione

I protocolli di stampa 3D e i file STL qui forniti hanno lo scopo di facilitare l'installazione di un nuovo flylab o di aumentare il repertorio di apparati in una struttura comportamentale di Drosophila esistente, utilizzando apparecchiature "fatte in casa". La strategia di stampa 3D può essere particolarmente utile nei paesi in via di sviluppo come il Brasile, dove la ricerca che utilizza la Drosophila come organismo modello per lo studio della biologia umana sembra e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand