JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Protocolli dettagliati passo-passo sono descritti qui per studiare i segnali meccanici in vitro utilizzando cellule multipotenti della cresta neurale O9-1 e idrogel di poliacrilammide di varia rigidità.

Abstract

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule multipotenti embrionali vertebrate che possono migrare e differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule che danno origine a vari organi e tessuti. La rigidità dei tessuti produce forza meccanica, un segnale fisico che svolge un ruolo fondamentale nella differenziazione NCC; tuttavia, il meccanismo rimane poco chiaro. Il metodo qui descritto fornisce informazioni dettagliate per la generazione ottimizzata di idrogel di poliacrilammide di varia rigidità, la misurazione accurata di tale rigidità e la valutazione dell'impatto dei segnali meccanici nelle celle O9-1, una linea NCC che imita gli NCC in vivo.

La rigidità dell'idrogel è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) e ha indicato diversi livelli di rigidità di conseguenza. Gli NCC O9-1 coltivati su idrogel di varia rigidità hanno mostrato una diversa morfologia cellulare e l'espressione genica delle fibre da stress, che indicavano diversi effetti biologici causati da cambiamenti meccanici del segnale. Inoltre, questo ha stabilito che la variazione della rigidità dell'idrogel ha portato a un efficiente sistema in vitro per manipolare la segnalazione meccanica alterando la rigidità del gel e analizzando la regolazione molecolare e genetica negli NCC. Gli NCC O9-1 possono differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule sotto l'influenza dei corrispondenti mezzi di differenziazione ed è conveniente manipolare i segnali chimici in vitro. Pertanto, questo sistema in vitro è un potente strumento per studiare il ruolo della segnalazione meccanica nelle NCC e la sua interazione con i segnali chimici, che aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo e delle malattie della cresta neurale.

Introduzione

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono un gruppo di cellule staminali durante l'embriogenesi dei vertebrati con una notevole capacità di migrare e contribuire allo sviluppo di vari organi e tessuti. Le NCC possono differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui neuroni sensoriali, cartilagine, ossa, melanociti e cellule muscolari lisce, a seconda della posizione di origine assiale e della guida ambientale locale dell'NCC1,2. Con la capacità di differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule, le anomalie genetiche che causano la disregolazione in qualsiasi fase dello sviluppo della cresta neurale (NC) possono portare a numerose malattie congenite2. Ad esempio, le perturbazioni durante la formazione, la migrazione e lo sviluppo di NCC portano a disturbi dello sviluppo noti collettivamente come neurocristopatie1,3. Queste malattie vanno dai difetti craniofacciali dovuti al fallimento nella formazione di NCC, come la sindrome di Treacher Collins, allo sviluppo di vari tumori dovuti alla capacità migratoria metastatica dell'NCC, come si vede nel melanoma3,4,5,6. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno fatto notevoli scoperte sui ruoli e i meccanismi delle NCC nello sviluppo e nelle malattie, con la maggior parte dei risultati focalizzati sui segnalichimici 7,8. Più recentemente, i segnali meccanici sono stati indicati per svolgere un ruolo critico ma poco compreso nello sviluppo NCC9,10.

I segnali ambientali degli NCC svolgono un ruolo fondamentale durante il loro sviluppo, compresa la regolazione della differenziazione NCC in vari tipi di cellule. I segnali ambientali, ad esempio i segnali fisici, influenzano i comportamenti cardine e le risposte cellulari, come la diversificazione funzionale. La meccanotrasduzione consente alle cellule di percepire e rispondere a tali segnali per mantenere vari processi biologici2. Gli NCC sono circondati da cellule vicine e diversi substrati, come la matrice extracellulare (ECM), che può dare origine a stimoli meccanici per mantenere l'omeostasi e adattarsi ai cambiamenti attraverso la determinazione del destino, la proliferazione e l'apoptosi11. La meccanotrasduzione inizia alla membrana plasmatica dove si verifica la componente sensoriale degli stimoli meccanici extracellulari, con conseguente regolazione intracellulare della cellula12. Integrine, aderenze focali e giunzioni della membrana plasmatica relè segnali meccanici, come forze di taglio, stress e rigidità dei substrati circostanti, in segnali chimici per produrre risposte cellulari12. La trasmissione di segnali chimici dalla membrana plasmatica alla regolazione cellulare finale viene effettuata attraverso diverse vie di segnalazione per finalizzare i processi vitali per l'organismo, come la differenziazione.

Diversi studi hanno suggerito che la segnalazione meccanica dalla rigidità del substrato gioca un ruolo nella differenziazione cellulare13,14. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) cresciute su substrati molli con una rigidità simile a quella del tessuto cerebrale (nell'intervallo di 0,1-1,0 kPa) hanno determinato la differenziazione delle cellule neuronali15,16. Tuttavia, più MSC si differenziano in cellule simili ai miociti quando cresciute su substrati di 8-17 kPa che imitano la rigidità del muscolo, mentre la differenziazione simile agli osteoblasti è stata osservata quando le MSC sono state coltivate su substrati rigidi (25-40 kPa)15,16. Il significato della meccanotrasduzione è evidenziato dalle irregolarità e dalle anomalie nella via di segnalazione meccanica che potenzialmente portano a gravi difetti e malattie dello sviluppo, tra cui cancro, malattie cardiovascolari e osteoporosi17,18,19. Nei tumori, il tessuto mammario normale è morbido e il rischio di cancro al seno aumenta nel tessuto mammario rigido e denso, un ambiente che è più simile ai tumori al seno15. Con queste conoscenze, gli effetti della segnalazione meccanica sullo sviluppo di NCC possono essere studiati attraverso la semplice manipolazione della rigidità del substrato attraverso un sistema in vitro, fornendo ulteriori vantaggi e possibilità nella comprensione dei fondamenti della progressione della malattia correlata alla NC e dell'eziologia.

Per studiare l'impatto dei segnali meccanici negli NCC, abbiamo istituito un efficiente sistema in vitro per NCC basato sull'ottimizzazione di metodi precedentemente pubblicati e sulla valutazione delle risposte degli NCC a diversi segnali meccanici20,21. È stato fornito un protocollo dettagliato per la preparazione della rigidità dell'idrogel variabile e la valutazione dell'impatto della segnalazione meccanica negli NCC. Per raggiungere questo obiettivo, gli NCC O9-1 vengono utilizzati come modello NC per studiare gli effetti e i cambiamenti in risposta agli idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi. Gli NCC O9-1 sono una linea cellulare NC stabile isolata dall'embrione di topo (E) al giorno 8.5. Gli NCC O9-1 imitano gli NCC in vivo perché possono differenziarsi in vari tipi di cellule derivate da NC in mezzi di differenziazione definiti22. Per studiare la segnalazione meccanica degli NCC, è stato fabbricato un substrato a matrice con elasticità sintonizzabile da concentrazioni variabili di soluzioni di acrilammide e bis-acrilammide per ottenere la rigidità desiderata, correlata alla rigidità del substrato biologico20,21,23. Per ottimizzare le condizioni del substrato matriciale per NCC, in particolare le celle O9-1, sono state apportate modifiche dal protocollo20precedentemente pubblicato. Una modifica apportata a questo protocollo è stata quella di incubare idrogel nel collagene I, diluito in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES, a 37 °C durante la notte. Il basso pH dell'acido acetico porta ad una distribuzione omogenea e ad una maggiore incorporazione di collagene I, consentendo così un attaccamento più uniforme della proteina ECM24. Inoltre, una combinazione di siero equino e siero bovino fetale (FBS) è stata utilizzata alle concentrazioni del 10% e del 5% rispettivamente nella soluzione salina tampone fosfato (PBS), prima di conservare gli idrogel nell'incubatrice. Il siero di cavallo è stato utilizzato come supplemento aggiuntivo a FBS grazie alla sua capacità di promuovere la proliferazione e la differenziazione cellulare alla concentrazione del 10%25.

Con questo metodo, un ambiente biologico è stato imitato dal rivestimento proteico ECM (ad esempio, Collagen I) per creare un ambiente in vitro accurato per far crescere e sopravvivere20,21. La rigidità degli idrogel preparati è stata analizzata quantitativamente tramite microscopia a forza atomica (AFM), una tecnica ben nota per rappresentare il modulo elastico26. Per studiare l'effetto di diversi livelli di rigidità sugli NCC, le cellule O9-1 wild-type sono state coltivate e preparate su idrogel per la colorazione di immunofluorescenza (IF) contro l'actina filamentosa (F-actina) per mostrare le differenze nell'adesione cellulare e nelle morfologie in risposta ai cambiamenti nella rigidità del substrato. Utilizzando questo sistema in vitro, i ricercatori saranno in grado di studiare i ruoli della segnalazione meccanica negli NCC e la sua interazione con altri segnali chimici per ottenere una comprensione più profonda della relazione tra NCC e segnalazione meccanica.

Protocollo

1. Preparazione dell'idrogel

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare che è stata disinfettata con etanolo e ultravioletto (UV) sterilizzato prima dell'uso per mantenere la sterilità. Gli strumenti, come pinzette e pipette, devono essere spruzzati con etanolo. Anche le soluzioni tampone devono essere filtrate sterili.

  1. Preparazione di coperture in vetro rivestite di aminosilano
    1. Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio.
      NOTA: preparare altri 3-4 coverslip per garantire forniture di backup sufficienti quando si rompono facilmente. Diversi materiali di coperture in vetro produrranno una diversa compatibilità di semina e fissaggio delle cellule. È meglio determinare quale tipo si adatta meglio all'esperimento prima di iniziare gli esperimenti (vedi la Tabella dei materiali).
    2. Utilizzare un bruciatore ad alcool o un bruciatore Bunsen per sterilizzare ogni coverslip facendolo passare avanti e indietro attraverso la fiamma (30 s per esperimenti di analisi proteica). Posizionare ogni coverlip di vetro su una salvietta da laboratorio per raffreddare.
    3. Una volta raffreddate le coperture in vetro, trasferirle su una capsula di Petri rivestita di parafilm per evitare lo slittamento.
      NOTA: Se i coperchi non sono abbastanza freddi, il calore residuo scioglierà il parafilm sugli scivoli, rendendoli inutilizzabili.
    4. Coprire i coverslip con circa 200 μL e 800 μL di 0,1 M NaOH per un coverslip di 12 mm e un coverslip da 25 mm, rispettivamente, e lasciarli riposare per 5 min. Quindi, aspirare il NaOH 0,1 M e lasciare asciugare all'aria i coperchi per altri 5 minuti per formare un film uniforme.
    5. Una volta asciugati i coverslip, pipettare circa 80 μL e 150 μL di 3-aminopropil trietossisilano (APTS) per 12 mm e 25 mm, rispettivamente. Fare attenzione a non versare la soluzione sul parafilm. Lasciare riposare la soluzione per 5 minuti.
    6. Aspirare il più possibile APTS in eccesso e lasciare asciugare l'APTS residuo per 5 minuti. Risciacquare bene le coverslip immergendole in sterile, deionizzato (DI) H2O tre volte per 5 minuti ogni volta.
      NOTA: Se le coperture in vetro non vengono risciacquate bene, l'APTS residuo provoca reazioni indesiderate con glutaraldeide, causando la formazione di un precipitato bianco e causando coperture inutilizzabili.
    7. Spostare le coperture in una nuova capsula di Petri con il lato reattivo rivolto verso l'alto. Aggiungi abbastanza glutaraldeide allo 0,5% alla capsula di Petri per coprire interamente le coperture e lasciare riposare le coperture per 30 minuti.
    8. Aspirare la glutaraldeide allo 0,5% e risciacquare nuovamente le coverslips in DI H2O una volta per 3 min. Impostare i coverslips lato reattivo su una salvietta da laboratorio o una capsula di Petri pulita per asciugare completamente all'aria prima dell'uso.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui; I coperchi devono essere posti in DI H2O sterili fino all'uso.
  2. Preparazione di coverslip siliconati
    1. Posizionare lo stesso numero di coverslip delle coverslip rivestite di aminosilano (punto 1.1.1) in una capsula di Petri rivestita di parafilm.
    2. Pipettare 40 μL o 150 μL per coperchi da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di diclorometilsilano (DCMS) su un lato del coperchio e lasciare riposare la soluzione per 5 minuti.
    3. Aspirare qualsiasi soluzione rimanente dal coperchio, lavare in DI H2O sterile una volta per 1 minuto e posizionare le coperture reattive rivolte verso l'alto su una salvietta da laboratorio per asciugare completamente all'aria prima di passare alla fase successiva.
  3. Preparazione di idrogel
    1. Mescolare acrilammide, bis-acrilammide e DI H2O in un tubo centrifugo da 1,5 mL per preparare 500 μL di soluzioni con rigidità variabili (vedere Tabella 1). Vortice la soluzione per 30 s per mescolarla accuratamente.
    2. Lavorando rapidamente, aggiungere la soluzione di persolfato di ammonio al 10% (APS) e la tetrametiletilendiammina (TEMED) al tubo e ruotare nuovamente le soluzioni per miscelare le soluzioni.
      NOTA: Preparare un APS fresco al 10% e lasciarlo sul ghiaccio o congelarlo in aliquote monouso a causa del suo delicato ciclo di congelamento/scongelamento.
    3. Pipettare circa 33 μL o 100 μL della soluzione sui coperchi essiccati da 12 mm o 25 mm rivestiti di aminosilano (rispettivamente punto 1.1).
    4. Utilizzando una pinzetta curva, posizionare immediatamente il coverslip trattato con DCMS sopra la soluzione di gel con il lato trattato che tocca la soluzione gel, inserendo così la soluzione gel tra il coverslip trattato con DCMS e il coverslip rivestito con aminosilano.
    5. Lasciare polimerizzare la soluzione di gel per 5-15 minuti, monitorando attivamente la polimerizzazione su gel della soluzione rimanente nel tubo.
    6. Una volta che il gel è polimerizzato, separare il coverslip trattato con DCMS con una pinzetta curva o una lama di rasoio, lasciando il gel attaccato alla coverslip originale rivestita di aminosilano.
    7. Posizionare immediatamente il coverslip con l'idrogel attaccato in una piastra predeterminata a 4 pozzetti/24 pozzetti e 6 pozzetti ricoperta da 500 μL e 2 mL di PBS sterile o DI H2O per coperture da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, per evitare che il gel si secchi.
    8. Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.7 per tutti i coverslip.
    9. Immergere gli idrogel in PBS sterile o DI H2O per 30 minuti per rimuovere la soluzione di acrilammide in eccesso. Conservare gli idrogel in PBS sterile o DI H2O a 4 °C per una sosta procedurale qui.
    10. In una stanza buia, preparare la miscela di esanoato di esatanoato (sulfo-SANPAH) di sulfosuccinimidile 6-(4'-azido-2'-azido-2'-azido-2'-azido-2'-idrossietil) piperazin-1-il] (HEPES) (pH = 8,5) con 25 μL di 50 μl di sulfo-SANPAH da 50 μg / mL in un tubo conico, avvolto in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Utilizzare una pipetta per mescolare bene la soluzione prima dell'uso.
      NOTA: Un volume di 2,5 mL di soluzione di sulfo-SANPAH è sufficiente per circa venticinque idrogel da 12 mm o cinque idrogel da 25 mm.
    11. Aspirare PBS o DI H2O dalla piastra del pozzo. Aggiungere circa 100 μL o 500 μL per coperture da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di soluzione di sulfo-SANPAH (fase 1.3.10) per coprire il gel. Assicurarsi che la soluzione copra interamente il gel.
      NOTA: Regolare la forza di aspirazione del vuoto per evitare che la forte forza strappi o disturbi gli idrogel.
    12. Posizionare i gel con la soluzione sotto una luce UV da 15 W, 365 nm per 10 minuti, scoperta per ridurre al minimo qualsiasi interferenza della luce UV che reagisce con il sulfo-SANPAH.
    13. Aspirare il sulfo-SANPAH in eccesso inclinando la piastra per raccogliere il più possibile la soluzione. Lavare il gel con 50 mM HEPES due o tre volte.
    14. Aggiungere 500 μL e 2 mL per gel da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di collagene I da 50 mg/mL diluiti in acido acetico allo 0,2% in ciascun pozzetto contenente l'idrogel. Lasciare incubare i gel durante la notte in un incubatore a CO2 a 37 °C, 5%.
      NOTA: Diluire il collagene I in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES per promuovere la distribuzione omogenea e l'attaccamento del collagene I.
    15. Aspirare il collagene I e lavare i gel con PBS sterile tre volte per rimuovere il collagene in eccesso I per 5 minuti ogni lavaggio. Incubare gli idrogel in PBS con 10% siero equino, 5% FBS per 2 ore nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: L'aggiunta del 10% di siero equino promuove una maggiore proliferazione rispetto al solo utilizzo di FBS come fatto nella pubblicazione precedente.
    16. Aspirare il mezzo. Aggiungere 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) filtrato sterile con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (P/S) a ciascun pozzetto. Conservare i gel nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2 fino a quando non sono pronti per la coltura cellulare.
    17. Una volta pronto, impiattare circa 1,5 × 104 cellule O9-1 / cm2 in mezzo basale nei piatti di coltura. Incubare le cellule per 2 giorni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2. Controllare la confluenza delle cellule per assicurarsi che le cellule siano sufficientemente attaccate ai gel e che il numero di cellule sia sufficiente prima di raccogliere per l'analisi.
      NOTA: vedere il protocollo pubblicato in precedenza per le fasi di recupero, passaggio e raccolta delle celle O9-120.
    18. Procedere alle sezioni 2, 3 o 4 per un'ulteriore analisi degli idrogel.

2. Analisi quantitativa della rigidità tramite AFM

  1. Avviare il computer del sistema AFM, seguito dal controller AFM (vedere la tabella dei materiali).
  2. Montare il cantilever AFM sul portasonda AFM. Utilizzare un cantilever sferico con una perla di silice da 0,5 μm montata all'estremità del cantilever (cantilever con perla sferica).
    NOTA: per idrogel più rigidi, come 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, è stata utilizzata una sonda più rigida con la costante della molla di 0,24 N/m. Una sonda più morbida è stata utilizzata per idrogel più morbidi, come 0,5 kPa e 1 kPa, con una costante di molla di 0,059 N / m.
  3. Impostare il software AFM in modalità contatto.
  4. Montare il wafer di silicio sullo stadio campione AFM per raccogliere le curve di forza facendo clic su Engage affinché il cantilever tocchi il substrato di silicio, generando così le curve di forza.
  5. Utilizzare le curve di forza sopra (2.4) per la calibrazione, fare clic su Calibra nel software di controllo per ottenere una costante media della molla del cantilever in condizioni di regolazione termica e salvare i valori calibrati nel software di controllo.
  6. Montare i campioni posizionando il coperchio con l'idrogel collegato in una capsula di Petri da 60 mm sullo stadio di scansione AFM. Aggiungere 3 ml di PBS nella piastra prima di effettuare misurazioni per evitare che il gel si secchi.
  7. Impostare l'AFM in modo che funzioni in modalità contatto (fluido) per avviare la misurazione. Impegnare il tallone sferico per toccare e sollevare continuamente dal campione di gel.
  8. Impostare il cantilever in modo che la sua soglia di deflessione rimanga a 10 nm. Mantenere la dimensione di rampa della sonda a 10 μm. Quindi, registrate le curve di forza come nel passaggio 2.4.
  9. Acquisire almeno 20 curve di forza da almeno 3 a 10 punti diversi sulla superficie dell'idrogel.
  10. Calcola il modulo medio di Young di ~ 20 curve di forza per ogni punto con il software di imaging e analisi AFM. Utilizzate le curve di forza di rampa di estensione e un modello linearizzato (sferico). Calcola la media di tutti i punti per ciascun campione per ottenere la rigidità finale.
    NOTA: il modulo di Young e i dati correlati (adesempio, deviazioni standard) vengono automaticamente salvati come foglio di calcolo.
  11. Ripetere i passaggi 2.6-2.10 per tutti i campioni.

3. Analisi molecolare della rigidità mediante colorazione ad immunofluorescenza

  1. Utilizzare una pinzetta per trasportare il coverslip su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Lavare le cellule con 500 μL di PBS sterile tre volte per rimuovere le cellule morte e qualsiasi terreno di coltura rimanente.
  2. Fissare le celle utilizzando 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 minuti a temperatura ambiente, indisturbati. Quindi, lavare nuovamente le cellule tre volte utilizzando 500 μL di PBS / pozzetto per 2 minuti ciascuna.
    NOTA: Conservare a 4 °C per un arresto procedurale.
  3. Trattare le cellule con 500 μL di 0,1% Triton X-100 per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS / pozzetto.
  4. Bloccare le cellule con 250 μL di siero d'asino al 10% (diluito in PBS e 0,1% Tween 20) per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Incubare le cellule con 250 μL di anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS / pozzetto per 5 minuti ciascuna.
    NOTA: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) e anti-AP2 alfa (1:250) sono stati utilizzati in questo esperimento e sono stati diluiti in siero d'asino al 10%.
  6. Incubare le cellule con corrispondenti anticorpi secondari e/o falloidina utilizzati per la colorazione di F-actina ad una diluizione di 1:400 in 250 μL di siero d'asino al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
    NOTA: 568 nm Di falloidina può essere co-incubata con anticorpi secondari a 488 nm o 647 nm o da sola.
  7. Incubare le cellule con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, diluizione 1:1000) in 250 μL di PBS per 10 min seguito da un ultimo lavaggio di PBS per 2 min.
  8. Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio a ciascun pozzetto. Conservare i campioni a 4 °C per impostare per almeno 2 ore prima dell'imaging per assicurarsi che il supporto di montaggio sia impostato correttamente.
  9. Cattura immagini di almeno 3 fotogrammi casuali per campione di idrogel con un microscopio a fluorescenza, producendo canali singoli e uniti.

4. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

  1. Trasferire gli idrogel con le cellule aderenti per la raccolta dell'RNA in una nuova piastra per ridurre al minimo l'RNA indesiderato dalle cellule attaccate alla piastra cellulare. Lavare le cellule con PBS tre volte per rimuovere le cellule morte e il terreno di coltura.
  2. Estrarre l'mRNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA. Eseguire la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA utilizzando un supermix a trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Eseguire RT-qPCR con primer per Vcl come marcatore di rigidità di scelta e analizzare utilizzando il metodo 2-ΔΔCT.
    NOTA: Sequenza di primer di Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; inverso 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Risultati

Preparazione dell'idrogel e valutazione della rigidità tramite AFM e modello Hertz
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per generare idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile regolando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide. Tuttavia, gli idrogel di poliacrilammide non sono pronti per l'adesione delle cellule a causa della mancanza di proteine ECM. Pertanto, il sulfo-SANPAH, agendo come un linker, si lega covalentemente agli idrogel e reagisce con le ammine primarie delle prote...

Discussione

L'obiettivo del presente studio è quello di fornire un sistema in vitro efficace ed efficiente per comprendere meglio l'impatto dei segnali meccanici negli NCC. Oltre a seguire il protocollo passo-passo sopra menzionato, i ricercatori devono tenere presente che la coltura cellulare di NCC O9-1 è influenzata dal tipo di coverslip di vetro utilizzati per preparare gli idrogel. Ad esempio, è stato notato che le cellule seminate su un tipo specifico di coverslip di vetro (vedi la Tabella dei materiali)

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Ringraziamo la dott.ssa Ana-Maria Zaske, operatore della struttura Atomic Force Microscope-UT Core presso l'Università del Texas Health Sciences Center, per l'esperienza apportata in AFM in questo progetto. Ringraziamo anche le fonti di finanziamento del National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Riferimenti

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologia dello sviluppoNumero 174cellule della cresta neuralesegnali meccanicicellule O9 1microscopia a forza atomica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati