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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, il protocollo presenta la preparazione della soluzione di naringenina per la somministrazione intraperitoneale in vivo . La naringenina è completamente sciolta in una miscela di dimetilsolfossido, Tween 80 e soluzione salina. Gli effetti osteoporotici antidiabetici della naringenina sono stati valutati mediante test della glicemia, colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati e saggio immunoassorbente enzimatico.

Abstract

La preparazione di una soluzione composta (fitochimica) è un passaggio trascurato ma critico prima della sua applicazione in studi come lo screening farmacologico. La completa solubilizzazione del composto è necessaria per il suo uso sicuro e risultati relativamente stabili. Qui, un protocollo per la preparazione della soluzione di naringenina e la sua somministrazione intraperitoneale in una dieta ricca di grassi e un modello diabetico indotto da streptozotocina (STZ) è dimostrato come esempio. Una piccola quantità di naringenina (3,52-6,69 mg) è stata utilizzata per testare la sua solubilizzazione in solventi, tra cui etanolo, dimetilsolfossido (DMSO) e DMSO più Tween 80 ricostituito in soluzione fisiologica (PS), rispettivamente. La completa solubilizzazione del composto viene determinata osservando il colore della soluzione, la presenza di precipitati dopo la centrifugazione (2000 x g per 30 s) o lasciando riposare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente (RT). Dopo aver ottenuto un composto stabile/soluzione fitochimica, la concentrazione/quantità finale del composto necessaria per gli studi in vivo può essere preparata in una soluzione madre di solo solvente (senza PS) e quindi diluita/miscelata con PS come desiderato. Gli effetti osteoporotici antidiabetici della naringenina nei topi (somministrazione intraperitoneale a 20 mg/kg p.c., 2 mg/ml) sono stati valutati misurando la glicemia, la massa ossea (micro-CT) e la velocità di riassorbimento osseo (colorazione TRAP ed ELISA). I ricercatori alla ricerca di preparazioni dettagliate di soluzioni organiche / fitochimiche trarranno beneficio da questa tecnica.

Introduzione

Con l'aumento degli studi sull'uso di composti fitochimici per lo screening dei farmaci, vale la pena prestare attenzione agli approcci per preparare soluzioni fitochimiche per valutare i loro effetti ottimali. Molti aspetti come la metodologia di dissoluzione, il dosaggio e la concentrazione devono essere considerati quando si prepara il composto1.

La dissoluzione a base di solvente è ampiamente utilizzata per la preparazione di composti organici1. I solventi comunemente usati includono acqua, olio, dimetilsolfossido (DMSO), metanolo, etanolo, acido formico, Tween, glicerina, ecc2. Sebbene una sospensione con sostanze non disciolte sia accettabile quando il composto viene somministrato mediante sonda gastrica, un soluto completamente disciolto è fondamentale per la somministrazione endovenosa. Poiché la soluzione oleosa, la sospensione e l'emulsione possono causare embolie capillari, si suggerisce una soluzione acquosa per la preparazione del composto, specialmente quando si somministrano iniezioni endovenose, intramuscolari e intraperitoneali3.

L'intervallo di dosaggio efficace varia tra i composti e anche tra le malattie trattate con lo stesso composto. Le determinazioni della dose efficace e sicura e della concentrazione dipendono dalla letteratura e dagli esperimenti preliminari4. Qui, la preparazione del composto naringenina è dimostrata come esempio.

La naringenina (4,5,7-triidrossi-flavanone), un composto polifenolico, è stata studiata nel trattamento della malattia per le sue attività epatoprotettive5, antidiabetiche6, antinfiammatorie7 e antiossidanti8. Per le applicazioni in vivo, la somministrazione orale di naringenina è comunemente usata. Studi precedenti hanno riportato la preparazione di una soluzione di naringenina in carbossimetilcellulosa allo 0,5%-1%, dose di metilcellulosa allo 0,5%, DMSO allo 0,01% e soluzione fisiologica (PS) a 50-100 mg/kg, somministrata mediante sonda gastrica orale 9,10,11,12. Inoltre, altri studi hanno riportato l'integrazione di naringenina con chow al 3% (wt/wt) per assunzione orale alla dose di 3,6 g/kg/die13,14. Gli studi hanno anche riportato l'uso di etanolo (0,5% v / v), PS e DMSO per sciogliere la naringenina per iniezione intraperitoneale a 10-50 mg / kg15,16,17,18. In uno studio sull'epilessia del lobo temporale, i topi hanno ricevuto un'iniezione di naringenina sospesa in carbossimetilcellulosa allo 0,25% disciolta in PS19. Sebbene questi studi riportino l'uso di diversi solventi per preparare soluzioni di naringenina, ulteriori dettagli, come lo stato di dissoluzione e la risposta animale, non sono stati riportati.

Questo protocollo introduce una procedura per la preparazione della soluzione di naringenina per l'applicazione in vivo nell'osteoporosi indotta da diabete. La preparazione della soluzione iniettabile comprende la preparazione di solventi e composti, la stima del dosaggio, il processo di dissoluzione e la filtrazione. Il dosaggio è stato determinato sulla base della ricerca bibliografica e di esperimenti preliminari monitorando i topi dopo aver somministrato iniezioni ogni giorno per 3 giorni e modificando il dosaggio in base ai comportamenti del topo. La concentrazione finale scelta (20 mg/kg p.c.) è stata somministrata per via intraperitoneale 5 giorni alla settimana per 8 settimane in una dieta ricca di grassi e topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ)20,21. Gli effetti della naringenina nell'osteoporosi diabetica sono stati valutati mediante test della glicemia, micro-CT, colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Nel complesso, è stato osservato che la naringenina in un intervallo di concentrazione di 40-400 mg/ml non si dissolve completamente né in etanolo né in DMSO né al 5% (etanolo o DMSO) più il 95% di PS (v/v). Tuttavia, la naringenina si è sciolta completamente in una miscela di 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 e 92,96% PS. La procedura dettagliata aiuterà i ricercatori a preparare il composto come soluzione di iniezione per l'applicazione in vivo .

Protocollo

Le indagini descritte erano conformi alle linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche e sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Shanghai della medicina tradizionale cinese. Quando si eseguono gli esperimenti, sono necessari camici da laboratorio, guanti monouso in nitrile e occhiali protettivi per motivi di sicurezza.

1. Preparazione dei solventi e stima della naringenina necessaria per l'applicazione in vivo

  1. Preparare i seguenti solventi: Tween-80 (intervallo di concentrazione finale: 0,5% -1%), DMSO, glicerina (intervallo di concentrazione finale: 15% -20%), etanolo (intervallo di concentrazione finale: 12% per iniezione intramuscolare)22 e 0,9% PS.
  2. Stimare la quantità di naringenina necessaria in base alla dose, al numero di topi e alla frequenza di iniezione.
    1. Ordinare 10 topi (C57BL/6, maschio, 5 settimane, SPF) per somministrare naringenina 5 giorni alla settimana per 8 settimane. Mantenere i topi in specifiche condizioni prive di agenti patogeni (SPF).
      NOTA: La dose necessaria per l'iniezione intraperitoneale è di 20 mg/kg p.c.23.
    2. Pesare 160 mg di naringenina in base al seguente calcolo: 20 mg/kg x 0,02 kg/topo x 10 topi x 5 giorni/settimana x 8 settimane = 160 mg.
  3. Calcolare la concentrazione di naringenina da iniettare in vivo.
    1. Preparare il volume raccomandato in base al peso corporeo dei topi. Il volume raccomandato di naringenina applicato a ciascun topo è pari all'1% del peso corporeo (0,3 ml). In questo esperimento, sono stati utilizzati 0,2 ml per mouse.
    2. Calcola il volume totale: 0,2 ml per mouse x 10 mouse x 5 giorni/settimana x 8 settimane = 80 ml.
    3. Calcolare la concentrazione della Naringenina in magazzino: 160 mg/80 mL solventi = 2 mg/ml.
    4. Calcola il volume per ogni giorno: 0,2 ml per mouse x 10 topi = 2 ml.

2. Scioglimento

  1. Soluzione di etanolo
    1. Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 3,52 mg di naringenina e aggiungerla in una provetta da 2,0 ml.
      NOTA: Per ottenere una concentrazione di 2 mg/ml, il volume totale richiesto sarà di 1760 μL (calcolo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml).
    2. Girare rapidamente verso il basso (2000 x g per 30 s) per far depositare la polvere di naringenina sul fondo del tubo (Figura 1A).
    3. Aggiungere 8,8 μL di etanolo al 100% nel tubo per preparare una soluzione allo 0,5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto2. La naringenina non si dissolve completamente (Figura 1B).
    4. Continuare ad aggiungere 79,2 μL di etanolo al 100% al tubo per preparare una soluzione al 5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto (calcolo: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). La naringenina non si dissolve completamente (Figura 1B).
    5. Aggiungere 1672 μL di 0,9% PS al tubo contenente il 5% di etanolo, come descritto al punto 2.1.4. Questo produrrà un'emulsione (Figura 1D). Centrifuga (2000 x g per 30 s) la soluzione per verificare se la naringenina è completamente disciolta nella soluzione. Nella soluzione compaiono precipitati bianchi di naringenina non disciolta (Figura 1E).
  2. Soluzione DMSO
    1. Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 3,95 mg di naringenina e aggiungere in una provetta da 2,0 ml.
      NOTA: Per ottenere una concentrazione di 2 mg/ml, il volume totale richiesto sarà di 1975 μL (calcolo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml).
    2. Girare rapidamente verso il basso (2000 x g per 30 s) per far depositare la polvere di naringenina sul fondo del tubo.
    3. Aggiungere 9,8 μL di DMSO alla provetta per preparare una soluzione allo 0,5% (v/v) (calcolo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). La naringenina si dissolve completamente (Figura 2A).
    4. Aggiungere 88,2 μL di DMSO al tubo per preparare una soluzione al 5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto (calcolo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). La naringenina si dissolve completamente (Figura 2B).
    5. Aggiungere 1877 μL di 0,9% PS (v/v per cento del 95%) alla soluzione preparata al punto 2.2.4. Viene prodotta un'emulsione (Figura 1C). Centrifuga (2000 x g per 30 s) la soluzione per verificare se la naringenina è completamente disciolta nella soluzione. Nella soluzione compaiono precipitati bianchi di naringenina non disciolta (Figura 1D).
  3. Soluzione Tween-80 e DMSO
    1. Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 6,69 mg di naringenina e aggiungerla in una provetta da 5,0 ml.
      NOTA: Per raggiungere la concentrazione finale di 2 mg/ml, il volume totale della soluzione richiesto sarà di 3345 μL (calcolo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml).
    2. Girare rapidamente verso il basso (2000 x g per 30 s) per far depositare la polvere di naringenina sul fondo del tubo.
    3. Aggiungere 117,7 μL di DMSO per preparare una soluzione al 3,5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto (calcolo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). La naringenina si dissolve completamente (Figura 3A)
    4. Aggiungere 117,7 μL di Tween 80 alla soluzione preparata al punto 2.3.3 per ottenere il 3,5% (v/v) di Tween 80 e il 3,5% (v/v) di DMSO. Osservare la completa dissoluzione della naringenina (Figura 3B)
    5. Aggiungere lentamente la soluzione preparata al punto 2.3.4 in una provetta da 5,0 mL contenente 3109,6 μL di 0,9% PS (v/v per cento del 93%) e agitare bene per ottenere una soluzione apparente di naringenina (Figura 3C).
    6. Lasciare che la soluzione preparata al punto 2.3.5 rimanga a temperatura ambiente (RT) per 2 ore. La soluzione è ancora evidente senza precipitati visibili (Figura 3D).
  4. Preparazione della soluzione di naringenina per la somministrazione in vivo
    1. Secondo il punto 1.2.2, pesare 160 mg di naringenina (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
    2. Aggiungere 2,8 ml di DMSO per ottenere una soluzione al 3,5% (v/v) (calcolo: 2,8 mL / 80 mL x 100% = 3,5%)
    3. Quindi, aggiungere 2,8 mL di Tween 80 alla soluzione preparata al punto 2.4.2 per ottenere il 3,5% (v/v) di Tween 80 e il 3,5% (v/v) di DMSO.
    4. Aliquot la soluzione preparata al punto 2.4.3 in quattro provette, 1,4 mL per provetta [(2,8 mL + 2,8 mL) / 4 = 1,4 mL].
    5. Aliquote 18,6 mL di 0,9% PS a cinque tubi da 15 mL.
    6. Conservare la soluzione preparata nei punti 2.4.3 (soluzione madre) e 2.4.5 a 4 °C (2,8 mL + 2,8 mL + 18,6 mL x 4 = 80 mL).
    7. Prelevare 140 μL della soluzione madre (fase 2.4.3) e mescolarla con 1860 μL di PS allo 0,9% per preparare 2 mL di soluzione di naringenina per 1 giorno di somministrazione.
    8. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm.

3. Somministrazione della soluzione di Naringenin

  1. Movimentazione e contenzione
    1. Spruzzare la gabbia e le mani con alcool al 70-75% prima di aprire il coperchio. Sollevare il mouse per la base della coda e posizionarlo su una superficie solida per posizionare delicatamente la coda all'indietro.
    2. Afferrare la collottola dietro le orecchie con il pollice sinistro e l'indice e posizionare la coda tra il mignolo e l'anulare. Tenere il mouse in posizione supina con l'estremità posteriore leggermente sollevata.
  2. Iniezione
    1. Afferrare la pelle posteriore del topo in modo che la pelle addominale sia tesa.
    2. Spingere l'ago (siringa da insulina) con un angolo di 10° tra l'ago e la superficie addominale, nel quadrante inferiore destro o sinistro dell'addome per evitare di colpire la vescica, il fegato o altri organi interni.
    3. Far scorrere l'ago per via sottocutanea in direzione cranica per 3-5 mm, quindi inserirlo con un angolo di 45° nella cavità addominale.
    4. Quando l'ago passa attraverso la parete addominale e la resistenza scompare, eseguire un'aspirazione per confermare che nessun materiale di riflusso viene ritirato. Quindi, spingere lentamente la soluzione.
    5. Dopo l'iniezione, estrarre lentamente l'ago e ruotarlo leggermente per evitare perdite. Il volume raccomandato è 50-100 μL/10 g.
    6. Smaltire la Naringenina avanzata in un contenitore a rischio biologico.

4. Test della glicemia

NOTA: Testare la glicemia 1 giorno prima dell'iniezione e 1 e 2 mesi dopo l'iniezione.

  1. Digiunare i topi per 15 ore prima del test della glicemia. L'acqua può continuare ad essere fornita.
  2. Apri le strisce reattive e segna la data. Una volta aperte, utilizzare le strisce reattive entro 3 mesi. Conservare le strisce reattive a 2-30 °C. Chiudere ermeticamente il coperchio dopo aver rimosso la striscia per evitare la formazione di umidità.
  3. Posizionare l'animale nella camera di induzione. Accendere il vaporizzatore ad un livello di induzione del 4% per l'isoflurano e di 4 L/min per l'ossigeno. Dopo che l'animale è completamente anestetizzato, mantenere l'anestetico con il cono nasale e la somministrazione di anestetico ad un livello dell'1,5% per l'isoflurano e di 0,4 L/min per l'ossigeno.
  4. Pulire la coda con batuffoli di cotone / tamponi imbevuti di alcool al 70% -75%.
  5. Partendo dal punto più basso della coda, fare una piccola puntura sulla vena laterale della coda con una puntura dell'ago da 25G e spremere una goccia di sangue.
  6. Pulire la goccia di sangue con una carta velina.
  7. Spremere un'altra goccia di sangue e raccoglierla sul bordo di una striscia reattiva.
  8. Leggere e registrare il risultato visualizzato sul misuratore di glucosio.
  9. Per fermare l'emorragia, pizzicare la coda del topo con una garza sterile e pulire l'area con alcol al 75%.
  10. Ulteriori campioni possono essere ottenuti con una tecnica simile che si muove lungo la coda cranicamente.

5. Colorazione TRAPPOLA

  1. Preparazione diapositive
    1. Eseguire test della glicemia a digiuno sui topi una volta alla settimana. Quando i livelli di glucosio nel sangue sono ≥ 11,1 mmol / L (indicativi di topi diabetici di tipo II di successomodello 24), eutanasia i topi usando CO2, seguita da dislocazione cervicale, e raccogliere il lombare 4 ° -6° (L4-L6) (non viene eseguita eutanasia durante il test della glicemia a digiuno).
    2. Fissare i campioni L4-L6 con paraformaldeide al 4% per 24 ore (assicurarsi che il volume di paraformaldeide sia >20x il volume del tessuto), quindi lavare per 2 ore in flusso continuo di acqua di rubinetto.
    3. Per decalcificare i campioni, immergerli in una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) al 10% per 2 settimane a RT in condizioni statiche fino a quando i campioni non si ammorbidiscono. Assicurarsi che il volume della soluzione decalcificante sia 20-30 volte il volume del tessuto/campione. Cambiare la soluzione EDTA a giorni alterni.
    4. Disidratare il campione utilizzando un disidratatore.
      1. Posizionare i campioni in cassette di incorporamento per la lavorazione dei tessuti. Numerare la cassetta usando una matita.
      2. Impostare il programma disidratatore come segue: alcol al 75% per 2 ore, alcol all'85% per 1 ora, alcol al 95% per 1 ora, alcol al 95% per 2 ore, etanolo anidro (I) per 2 ore, etanolo anidro (II) per 2 ore, etanolo anidro (III) per 2 ore, xilene (I) per 1 ora, xilene (II) per 1 ora, xilene (III) per 1 ora, cera di paraffina (I) per 2 ore e cera di paraffina (II) per 2 ore, a RT.
    5. Incorporare i campioni nella cera di paraffina.
      1. Aggiungere la cera di paraffina al vassoio della cassetta della stazione di incorporamento della paraffina e portare a 60 °C. Immergere i campioni disidratati per almeno 2 ore.
      2. Posizionare la cassetta velina nel vassoio della cassetta e preriscaldare.
      3. Aggiungere la cera di paraffina nel serbatoio di paraffina e portare a 60 °C.
      4. Dopo 2 ore, portare sia la cassetta del tessuto che i campioni nell'area di lavoro. Versare la cera di paraffina preriscaldata dal serbatoio di paraffina nella cassetta dei tessuti. Posizionare il campione nella cera di paraffina, assicurarsi che la cera di paraffina copra completamente il tessuto, quindi spostare immediatamente la cassetta su una stazione di glassa.
      5. Utilizzare un microtomo per tagliare i campioni incorporati in paraffina in sezioni da 5-6 μm. Dispiegare le sezioni in acqua calda a 40 °C per meno di 10 s. Raccogli le sezioni sui vetrini rivestiti di APS (amminosilano). Asciugare i vetrini a RT per 1 ora, quindi spostare i vetrini in un forno impostato a 60 °C per la notte.
  2. Preparazione del reagente TRAP
    1. Preparare la soluzione di incubazione madre di base: sciogliere 9,2 g di acetato di sodio anidro, 11,4 g di acido L-(+) tartarico e 2,8 ml di acido glaciale in 1000 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 4,7-5,0 e conservare a RT per un massimo di 6 mesi.
    2. Preparare la soluzione di naftolo-etere: sciogliere 0,1 g di naftolo AS-BI fosfato in 5 ml di glicole etilenico monoetil etere. Conservare a 4 °C per un massimo di 5 settimane.
    3. Preparare la soluzione di nitrito di sodio: sciogliere 1 g di nitrito di sodio in 25 ml di acqua distillata. Conservare a 4 °C.
    4. Preparare il colorante Pararosanilina: Aggiungere 1 g di base pararosanilina a 20 ml di 2N HCl (83 ml di HCl in 417 ml di acqua). Utilizzare una piastra di mescolare per sciogliere la base e filtrarla prima dell'uso.
  3. Colorazione TRAP
    1. Riempire due vasetti Coplin con 50 ml di soluzione di incubazione madre di base e metterli in forno a 37 °C per 2 ore.
    2. Prendi un barattolo Coplin e aggiungi 0,5 ml di soluzione di naptol-etere.
    3. Posizionare i vetrini nel barattolo Coplin e incubare a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: preparare almeno tre diapositive per ogni gruppo.
    4. Pochi minuti prima della fine del tempo di incubazione, aggiungere 1 ml di soluzione di nitrito di sodio e 1 ml di colorante pararosanilina. Mescolare delicatamente per 30 secondi e lasciare agire per 2 minuti.
    5. Aggiungere la soluzione preparata al punto 5.2.2 all'altro barattolo Coplin preriscaldato contenente la soluzione madre di base. Mescolare bene la soluzione e inserire i vetrini dal barattolo Coplin al punto 5.3.3.
    6. Incubare per 15-20 minuti a RT.
    7. Risciacquare le fette in un altro barattolo Coplin con 200 ml di PBS per 5 minuti.
    8. Contro-colorare le fette con ematossilina al 100% per 30 s in un barattolo Coplin.
    9. Disidratare le fette con alcool all'85%, 95% e 100% (200 ml) per 2 minuti ciascuna e trattare con xilene (200 ml) per 2 minuti per 3x. Usa i barattoli Coplin per eseguire ogni passaggio.
    10. Fissare la sezione sul vetro di copertura con un coprivetrino con resina. Assicurarsi di evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.

6. ELISA

  1. Preparazione del campione
    1. Rimuovere i tessuti molli dal femore e dalla tibia del topo. Pulire le ossa con una garza.
    2. Introdurre i campioni ossei in una provetta da microcentrifuga da 1 mL e conservare le provette a -80 °C.
      NOTA: I campioni possono anche essere conservati in un serbatoio di azoto liquido per non più di 6 mesi.
    3. Pesare il campione osseo. Diluire con 0,9% PS in un rapporto di 1:10. Ad esempio, diluire 0,1 g di osso con 1 ml di PS.
    4. Aggiungere perle di zirconia da 3 mm nel tubo e macinare i campioni 3 volte a 70 Hz per 30 s con 20 s di riposo in mezzo.
    5. Centrifugare i campioni a 4 °C e 12.000 x g per 5 minuti. Raccogli il surnatante.
  2. Kit di analisi ELISA
    NOTA: Eseguire ELISA secondo il protocollo di analisi specificato dal produttore.
    1. Aggiungere 100 μL di ogni diluizione di standard, bianco e campione nei pozzetti appropriati. Incubare per 90 min a 37 °C.
    2. Decantare il liquido da ciascun pozzetto e aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro anticorpale di rilevamento biotinilato. Incubare per 1 h a 37 °C.
    3. Decantare la soluzione, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Immergere per 1 minuto, ripetere 3x.
    4. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro coniugata HRP a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
    5. Decantare la soluzione. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte come descritto al punto 6.2.3.
    6. Aggiungere 90 μL del reagente del substrato. Incubare per 15 minuti a 37 °C al riparo dalla luce.
    7. Aggiungere 50 μL della soluzione di arresto.
  3. Utilizzare un lettore di piastre per registrare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm.
  4. Generazione di curve standard
    1. Tracciare i rispettivi valori medi di assorbanza rispetto alle concentrazioni proteiche diluite in serie.
    2. Unisci i punti per creare la curva di adattamento migliore. Utilizzare qualsiasi applicazione informatica appropriata (foglio di calcolo) per generare l'equazione della curva standard.
  5. Sostituire il valore di assorbanza di ciascun campione nell'equazione della curva standard per ottenere la concentrazione del rispettivo campione.

Risultati

Il peso corporeo dei topi diabetici alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi e indotti da STZ è diminuito rispetto a quello dei gruppi di controllo da 0-8 settimane dopo il trattamento con STZ. La perdita di peso dei topi trattati con naringenina è stata significativa rispetto ai topi non trattati (gruppo STZ) alla settimana 4. I gruppi di controllo e STZ sono stati somministrati con lo stesso volume di PS (Tabella 1). Il livello di glucosio nel sangue nei topi diabetici è aumentato drasticame...

Discussione

La preparazione della soluzione fitochimica è la base per la sua applicazione in vivo. In questo protocollo, la preparazione della soluzione di naringenina è stata dimostrata utilizzando diversi solventi, come etanolo, DMSO, Tween 80 e 0,9% PS. La soluzione in stato completamente disciolto deve essere ulteriormente monitorata lasciandola rimanere a temperatura ambiente per alcune ore prolungate, e quindi filtrata prima di essere utilizzata in vivo.

La determinazione del sol...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81973607 e 81573992).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL  microtubesCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding liquid
Automatic DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDehydrate samples
Blood glucose test stripsJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.4130392
CentrifugeMIULABMinute centrifugeCentrifugal solution
DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDehydration
DMSOSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E918BA0041Co-Solvent
ELISA assay kitElabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absoluteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl etherSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.A501118-0500TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617Decalcification
FilterMerck Millpore LTD.Millex-GP, 0.22 µmfilter solution
Glacial acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218TRAP staining
Glucose meterJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueSerial number:COJJG8GW
GrinderShanghaijingxin Experimental TechnologyTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005TRAP staining
Insulin syringeShanghai Kantaray Medical Devices Co.0.33 mm x 13 mm, RW LBIntraperitoneal injection
L-(+) tartaric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008TRAP staining
MicroscopeOLYMPUSsz61Observation
MicrotomeLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135Section
Mini centrifugeHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. Mini-6KCCentrifuge
Naphthol AS-BI phosphateSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP staining
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd102764Solute
Paraffin Embedding stationLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  samples
Pararosaniline baseBBI Life SciencesE112BA0045TRAP staining
Pipetteseppendorf2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL  transferre Liquid
Plate readerBioTek Instruments USA, Inc.BioTek CYTATION 3 imaging readerELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Neutral balsamTRAP staining
saline (0.9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvent
Sodium acetate anhydrousSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP staining
Sodium nitriteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP staining
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E819BA0006Emulsifier
Zirconia beadsShanghaijingxin Experimental Technology11079125z 454gGrinding

Riferimenti

  1. Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
  2. Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
  5. Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
  6. Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
  7. Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
  8. Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
  9. Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
  10. Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
  11. Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
  12. Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
  13. Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
  14. Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
  15. Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
  16. Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
  17. Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
  18. Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
  19. Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
  20. Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
  21. Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
  22. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
  23. Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
  24. Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
  25. Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
  26. Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
  27. Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
  28. van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  29. Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
  30. Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
  31. Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
  32. Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
  33. Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).

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