Misurazioni del trasferimento di energia di risonanza di Förster in cellule vegetali viventi

Riepilogo

Viene fornito un protocollo per la creazione di un microscopio a scansione laser confocale standard per misure in vivo di trasferimento di energia di risonanza Förster, seguito da una valutazione dei dati.

Abstract

Gli esperimenti FRET (Sensitized emission-based Förster resonance energy transfer) sono facilmente eseguibili ma dipendono dalla configurazione microscopica. I microscopi a scansione laser confocale sono diventati un cavallo di battaglia per i biologi. I sistemi commerciali offrono un'elevata flessibilità nella regolazione della potenza laser e nella sensibilità del rilevatore e spesso combinano diversi rilevatori per ottenere l'immagine perfetta. Tuttavia, il confronto dei dati basati sull'intensità di diversi esperimenti e configurazioni è spesso impossibile a causa di questa flessibilità. Le procedure di compatibilità con i biologi sono vantaggiose e consentono una regolazione semplice e affidabile delle impostazioni del laser e del rilevatore.

Inoltre, poiché gli esperimenti FRET nelle cellule viventi sono influenzati dalla variabilità nell'espressione proteica e nei rapporti donatore-accettore, i livelli di espressione proteica devono essere considerati per la valutazione dei dati. Qui è descritto un semplice protocollo per misurazioni FRET affidabili e riproducibili, comprese le routine per la stima dell'espressione proteica e la regolazione dell'intensità del laser e delle impostazioni del rilevatore. La valutazione dei dati sarà eseguita mediante calibrazione con una fusione fluoroforica di efficienza FRET nota. Per migliorare la semplicità, sono stati confrontati i fattori di correzione che sono stati ottenuti nelle cellule e misurando le proteine fluorescenti ricombinanti.

Introduzione

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster ((F)RET) è tipicamente osservato dalla spettroscopia di fluorescenza, sebbene il processo stesso non sia limitato a verificarsi tra i fluorofori. L'accoppiamento dipolo-dipolo sottostante richiede semplicemente una molecola donatrice che emette luce e un accettore che assorbe la luce. Questo è derivato dall'integrale J di sovrapposizione spettrale richiesto degli spettri normalizzati di emissione del donatore e di assorbanza dell'accettore1. Tuttavia, poiché ret compete con la fluorescenza, il trasferimento di energia diventa misurabile dalle alterazioni dell'emissione di fluorescenza: RET induce la tempra del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati.

Il RET a base di fluorofori è stato definito trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) per separarlo dal trasferimento di energia di risonanza di bioluminescenza (BRET). La RET dipende fortemente dalla distanza tra donatore e accettore, che è ampiamente nell'intervallo di 0,5-10 ^nm2 e, quindi, nello stesso intervallo delle dimensioni delle proteine e dei loro complessi. In secondo luogo, RET dipende dall'orientamento dipolo-dipolo kappa al quadrato. In combinazione con il fatto che la libertà rotazionale dei fluorofori legati alle proteine può essere trascurata a causa del peso molecolare e del lento rilassamento rotazionale, RET consente l'analisi delle alterazioni conformazionali3.

Il cosiddetto raggio di Förster si basa sull'integrale di sovrapposizione spettrale e sull'intervallo di lunghezze d'onda della sovrapposizione, in modo che i cromofori che assorbono la luce rossa producano raggi di Förster più lunghi rispetto ai coloranti che assorbono la luce blu. Poiché la gamma dinamica delle misurazioni FRET è limitata da 0,5 × _R0 e 1,5 × _R0, la coppia FRET ECFP-EYFP ha una gamma dinamica di 2,5-7,3 nm grazie al suo _R0 di 4,9 ^nm4.

La luminosità di un fluoroforo è data dal prodotto del suo coefficiente di estinzione molare e dalla sua resa quantistica. Per le misurazioni FRET, è vantaggioso scegliere fluorofori di luminosità quasi simile. Ciò migliora il rilevamento della tempra del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati. Favorisce inoltre la calibrazione del sistema di microscopia. Osservando le coppie FRET frequentemente utilizzate di proteine ciano e fluorescenti, la minore luminosità delle proteine fluorescenti ciano diventa evidente (Figura 1A).

Tuttavia, la durata dell'accettore deve essere inferiore alla durata di vita del donatore, garantendo la disponibilità dell'accettore per il trasferimento di energia. Se la vita dell'accettore supera la vita del donatore, l'accettore potrebbe essere ancora nello stato eccitato quando il donatore è di nuovo eccitato. Le proteine fluorescenti ciano avanzate come mTurquoise mostrano una durata prolungata e quindi contribuiscono ad aumentare la probabilità di FRET (Figura 1B). La probabilità di FRET dipende anche dal coefficiente di estinzione molare dell'accettore.

Protocollo

NOTA: Per il seguente protocollo, è stata eseguita la trasfezione transitoria di protoplasti, come descritto in ^precedenza12. Di seguito è riportata una breve descrizione.

1. Trasfezione transitoria di protoplasti

1. Tagliare ~4 g di foglie sane di Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia in fette da 1 mm e trasferirle in 20 ml di soluzione enzimatica (1,5% cellulasi; 0,4% macerozima; 0,1% albumina sierica bovina Frazione V; 0,4 M mannitolo; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morfolino)etanosolfonico (MES), pH 5,7; 10 mM _CaCl2).
2. Infiltrare sottovuoto le fette fogliari seguite da un'incubazione con agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule per centrifugazione per 3 minuti a 100 × g.
3. Lavare i protoplasti con soluzione W5 (154 mM NaCl; 125 mM _CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) e risospenderli in soluzione MMG (0,4 M mannitolo; 15 mM _MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7).
4. Eseguire la trasfezione in uno scivolo a 8 pozzetti mediante shock osmotico in presenza di polietileneglicole (PEG) 4000. Mescolare 20 μL della sospensione del protoplasto con 5 μL di DNA plasmidico (5 μg/μL) e 25 μL di soluzione PEG (0,2 M mannitolo, 0,1 M _CaCl2, 40% PEG 4000).
5. Invertire lo shock osmotico mediante un delicato riaggiustamento delle condizioni osmotiche.
   NOTA: Oltre al campione di interesse, l'espressione del solo donatore e dell'accettore da solo è necessaria per determinare il sanguinamento spettrale del donatore e dell'accettore, rispettivamente. Una proteina di fusione del donatore e dell'accettore deve essere espressa anche ai fini della calibrazione. L'espressione della proteina fluorescente era sotto il controllo di un promotore del virus del mosaico del cavolfiore 35S (pCaMV35S). Per tutte le misurazioni sono stati utilizzati due microscopi a scansione laser confocale (LSM1 e LSM2). LSM1 ha due tipi di rivelatori: per le misurazioni FRET, il segnale donatore è stato rilevato da un rilevatore GaAsP, mentre l'emissione FRET e accettore è stata registrata con un fotomoltiplicatore. LSM2 ha due fotomoltiplicatori, che sono stati utilizzati per il rilevamento dell'emissione di donatori, FRET e accettori.

2. Regolazione laser

NOTA: Qui, linee a 458 nm e 514 nm di un laser agli ioni di argon sono state applicate per l'analisi FRET tra proteine marcate con proteina fluorescente ciano potenziata (ECFP) e proteina fluorescente gialla avanzata (EYFP). Per l'acquisizione dei dati riproducibile, entrambe le linee sono state regolate a un'intensità simile. Ciò è stato ottenuto da un fotomoltiplicatore di trasmissione o dalla modalità di riflessione.

1. Regolazione laser con fotomoltiplicatore a trasmissione
   1. Utilizzare un pozzetto vuoto per la regolazione.
   2. Scegliere la modalità di scansione delle linee e la vista dell'istogramma.
   3. Ridurre al minimo l'intensità del laser e regolare il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile.
   4. Aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% e registrare il segnale corrispondente.
   5. Applicare la routine per entrambe le linee laser.
2. Regolazione laser con modalità di riflessione
   1. Utilizzare un pozzetto vuoto per la regolazione.
   2. Applicare un filtro di riflessione, attivare la modalità di riflessione, se disponibile.
   3. Assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rilevatore copra la lunghezza d'onda del laser.
   4. Scegliere la modalità di scansione delle linee e la vista dell'istogramma.
   5. Ridurre al minimo l'intensità del laser e regolare il guadagno del rilevatore in base al rumore di fondo rilevabile.
   6. Spostare l'obiettivo nella posizione più bassa.
   7. Sposta l'obiettivo verso l'alto fino a quando il riflesso della copertina è visibile.
   8. Aumentare l'intensità del laser a passi dello 0,5% e registrare il segnale corrispondente.
   9. Applicare la routine per entrambe le linee laser.
3. Valutazione dei dati
   1. Tabulare i dati e ordinarli in base alle intensità del segnale.
   2. Traccia le intensità del segnale rispetto alla potenza relativa del laser.
   3. Scegli le intensità del laser che si traducono in un'intensità del segnale simile.

3. Regolazione dei fotomoltiplicatori

NOTA: Dopo la regolazione laser, i fotomoltiplicatori sono stati regolati in base ai singoli guadagni per ottenere una sensibilità simile. Questa calibrazione è stata eseguita con la linea laser a 514 nm, che si trova al centro della gamma di lunghezze d'onda di interesse.

1. Utilizzare un pozzetto vuoto per la regolazione.
2. Applicare un filtro di riflessione e passare alla modalità di riflessione, se disponibile.
3. Assicurarsi che l'intervallo di lunghezze d'onda del rivelatore copra la lunghezza d'onda del laser (514 nm).
4. Scegliere la modalità di scansione della linea e la vista dell'istogramma.
5. Ridurre il guadagno del rilevatore alla metà del massimo e regolare l'intensità del laser per rilevare il rumore di fondo.
6. Spostare l'obiettivo nella posizione più bassa.
7. Sposta l'obiettivo verso l'alto fino a quando il riflesso della copertina è visibile.
8. Aumentare il guadagno del rilevatore a passi da 50 a 100 V e registrare il segnale corrispondente.
9. Applicare i passaggi da 3.1 a 3.8 per entrambi i rilevatori.
10. Valutazione dei dati
    1. Traccia l'intensità rispetto al guadagno del rilevatore per ciascun rilevatore.
    2. Scegli i singoli guadagni del rilevatore per ottenere una sensibilità simile.

4. Acquisizione di immagini FRET

NOTA: iniziare con l'esempio di interesse per l'impostazione dell'acquisizione delle immagini.

1. Scegli i filtri/specchi dicroici appropriati, ad esempio un doppio specchio dicroico MBS 458/514 per la coppia FRET ECFP/EYFP. Utilizzare lo stesso specchio dicroico per tutti i canali per abilitare la scansione riga per riga. Selezionare un obiettivo di immersione in acqua per l'imaging di cellule viventi. Scegli la scansione a 12 bit o a 16 bit e una velocità di scansione moderata.
2. Definire l'intervallo di rilevamento, preferibilmente 470-510 nm per il rilevamento del donatore e 530-600 nm per il rilevamento dell'accettore/FRET nel caso dell'ECFP/EYFP. Quando si utilizza un laser a diodi da 445 nm o 440 nm, utilizzare da 450 a 510 nm come intervallo di rilevamento. Nel caso di uno splitter a fascio acusto-ottico (AOBS), definire il rilevamento del donatore nell'intervallo da 450 a 500 nm per evitare il rilevamento indesiderato di accettori.
3. Applicare l'impostazione del rilevatore secondo il punto 3.10.2.
4. Applicare l'impostazione laser secondo il punto 2.3.2. Rivedere l'intensità del laser in base alla tabella di potenza laser ottenuta, se necessario. Assicurarsi che il rapporto segnale-rumore copra l'intera gamma dinamica dei rilevatori (intensità compresa tra 0 e 4095 per la scansione a 12 bit).
5. Mantieni costanti le intensità del laser e i guadagni del rilevatore. Utilizzare il diametro del foro stenopeico per la messa a punto.
   NOTA: tenere presente che le modifiche del diametro del foro stenopeico influiscono sulla risoluzione spaziale.
6. Eseguire le misurazioni (scattare immagini di almeno 20 celle).

5. Determinazione delle correzioni della diafonia

NOTA: le cellule che esprimono solo il donatore o l'accettore sono tenute a determinare rispettivamente il sanguinamento spettrale del donatore (DSBT) e l'accettore spettrale bleed-through (ASBT). Mantenere le stesse impostazioni descritte nella sezione 4.

1. Eseguire misurazioni FRET con cellule che esprimono il fluoroforo del donatore.
2. Eseguire misurazioni FRET con celle che esprimono il fluoroforo dell'accettore.

6. Calibrazione delle misure secondo Beemiller et ^al.13

NOTA: sono necessarie cellule che esprimono una fusione donatore-accettore di efficienza FRET nota. Qui è stata utilizzata una fusione ECFP-5 aa-EYFP con un'efficienza FRET di 0,464. Mantenere le stesse impostazioni descritte nella sezione 4.

1. Eseguire misurazioni FRET con cellule che esprimono la fusione donatore-accettore

7. Valutazione dei dati

1. Ottenere profili di linea delle celle, assicurando che ogni profilo non contenga più di una cella. Salvare i profili come file di testo.
2. Importare i file di testo in un foglio di calcolo utilizzando l'opzione di importazione del file di testo nella sezione Dati .
3. Leggere i valori massimi applicando la funzione Max .
4. Elencare i valori ottenuti in una tabella, avere una colonna ciascuno per l'emissione del donatore _ID, l'emissione FRET _IF, l'emissione dell'accettore _IA e almeno quattro set di dati: solo donatore, solo accettore, fusione donatore-accettore e misurazione.
   NOTA: l'eccitazione del donatore comporta anche l'eccitazione diretta dell'accettore e causa ASBT descritto dal valore α.
5. Calcolare i valori asBT α con il set di dati solo accettore utilizzando l'equazione (1).
   (1)
   NOTA: utilizzare la mediana di tutti i valori α nelle equazioni seguenti. Il donatore mostra un ampio spettro di emissione che si traduce in una diafonia di emissione con l'emissione sensibilizzata dell'accettore. Questo DSBT è dato dal valore β.
6. Calcola i valori di β di sanguinamento spettrale del donatore con il set di dati solo donatore usando l'equazione (2).
   (2)
   NOTA: utilizzare la mediana di tutti i valori β nelle equazioni seguenti. Il fattore di calibrazione ξ descrive la relazione lineare tra la tempra del donatore derivata da FRET e l'emissione sensibilizzata dell'accettore. Utilizzare le mediane di 7,5 e 7,6 nelle seguenti equazioni.
7. Calcola i fattori di calibrazione ξ con il set di dati di fusione donatore-accettore e la sua efficienza FRET E (0,46) usando l'equazione (3).
   (3)
   NOTA: utilizzare la mediana di tutti i valori ξ nelle seguenti equazioni.
8. Calcola le efficienze FRET della coppia proteica di interesse usando le equazioni (4) e (5).
   (4)
   (5)
9. Stimare gli effetti della forza di espressione e/o del rapporto donatore-accettore: tracciare la somma di _ID, _IF e _IA rispetto alle efficienze FRET. Eseguire una regressione lineare; si noti che più ripido è il grafico e più alto è ^R2 , maggiore è l'impatto del livello di espressione o maggiore è la differenza di abbondanza del donatore e dell'accettore.

Risultati

Regolazione del microscopio a scansione laser confocale
La regolazione laser ha rivelato un aumento lineare dell'emissione con l'aumentare dell'intensità del laser (Figura 2 e Tabella 1). Come previsto per i laser agli ioni di argon, l'emissione della linea a 514 nm è stata molto superiore all'emissione della linea a 458 nm, come evidenziato da una pendenza più ripida. Per gli esperimenti successivi, la potenza del laser del 4,5% e del 6,5% è stata sc...

Discussione

L'estinzione del donatore e l'emissione di accettori sensibilizzati sono caratterizzate da una relazione lineare che consente il calcolo basato sul donatore o sull'accettore di FRET. I corrispondenti fattori di linearità sono chiamati fattore G (da donatore ad accettore) o xi (da accettore a donatore), che sono valori ^reciproci4. La misurazione del FRET tra proteine fluorescenti mediante microscopia a fluorescenza richiede spesso correzioni per DSBT e ASBT a causa dell'ampio spettro di assorbimen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well slides	Ibidi	80821
Immersion oil Immersol  W2010	Zeiss	444969-0000-000	refraction index of water
LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope	Zeiss
LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope	Zeiss