Imaging ottico mesoscopico dell'intero cuore del topo

Riepilogo

Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.

Abstract

Sia le malattie cardiache genetiche che quelle non genetiche possono causare gravi processi di rimodellamento nel cuore. Il rimodellamento strutturale, come la deposizione di collagene (fibrosi) e il disallineamento cellulare, può influenzare la conduzione elettrica, introdurre disfunzioni elettromeccaniche e, infine, portare ad aritmia. Gli attuali modelli predittivi di queste alterazioni funzionali si basano su informazioni strutturali non integrate e a bassa risoluzione. Collocare questo quadro su un diverso ordine di grandezza è difficile a causa dell'inefficacia dei metodi di imaging standard nell'esecuzione di immagini ad alta risoluzione in tessuti massicci. In questo lavoro, descriviamo un quadro metodologico che consente l'imaging di interi cuori di topo con risoluzione micrometrica. Il raggiungimento di questo obiettivo ha richiesto uno sforzo tecnologico in cui sono stati combinati i progressi nella trasformazione dei tessuti e nei metodi di imaging. In primo luogo, descriviamo un protocollo CLARITY ottimizzato in grado di trasformare un cuore intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel e priva di lipidi che consente un'elevata trasparenza e una colorazione profonda. Quindi, viene descritto un microscopio a foglio di luce a fluorescenza in grado di acquisire rapidamente immagini di un campo visivo mesoscopico (scala mm) con la risoluzione su scala micron. A seguito del progetto mesoSPIM, il microscopio concepito permette la ricostruzione dell'intero cuore del topo con risoluzione micrometrica in un'unica scansione tomografica. Riteniamo che questo quadro metodologico consentirà di chiarire il coinvolgimento del disordine citoarchitettonico nelle disfunzioni elettriche e aprirà la strada a un modello completo che consideri sia i dati funzionali che strutturali, consentendo così un'indagine unificata delle cause strutturali che portano ad alterazioni elettriche e meccaniche dopo il rimodellamento tissutale.

Introduzione

Il rimodellamento strutturale associato a malattie cardiache può influenzare la conduzione elettrica e introdurre disfunzioni elettromeccaniche dell'organo ^1,2. Gli attuali approcci utilizzati per prevedere le alterazioni funzionali impiegano comunemente MRI e DT-MRI per ottenere una ricostruzione complessiva della deposizione di fibrosi, dell'albero vascolare e della distribuzione delle fibre del cuore e sono utilizzati per modellare percorsi di propagazione del potenziale di azione preferenziale (APP) attraverso l'organo ^3,4. Queste strategie possono fornire una bella panoramica dell'organizzazione del cuore. Tuttavia, la loro risoluzione spaziale è insufficiente per studiare l'impatto del rimodellamento strutturale sulla funzione cardiaca a livello cellulare.

Collocare questo quadro a un diverso ordine di grandezza, in cui le singole cellule possono svolgere ruoli individuali sulla propagazione del potenziale d'azione, è impegnativo. La limitazione principale è l'inefficienza dei metodi di imaging standard per eseguire immagini ad alta risoluzione (risoluzione micrometrica) in tessuti massicci (centimetrici). In effetti, l'imaging dei tessuti biologici in 3D ad alta risoluzione è molto complicato a causa dell'opacità dei tessuti. L'approccio più comune per eseguire ricostruzioni 3D in interi organi è quello di preparare sezioni sottili. Tuttavia, il sezionamento, l'assemblaggio e l'imaging precisi richiedono uno sforzo e un tempo significativi. Un approccio alternativo che non richiede il taglio del campione è quello di generare un tessuto trasparente. Negli ultimi anni sono state proposte diverse metodologie per la chiarificazione dei tessuti 5,6,7,8. La sfida di produrre tessuti massicci, trasparenti e marcati con fluorescenza è stata recentemente raggiunta sviluppando veri approcci di trasformazione tissutale (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). In particolare, il metodo CLARITY si basa sulla trasformazione di un tessuto intatto in una forma nanoporosa, ibridata con idrogel, priva di lipidi che consente di conferire un'elevata trasparenza mediante la rimozione selettiva dei doppi strati lipidici di membrana. In particolare, questo metodo è stato trovato efficace anche nella preparazione cardiaca^11,12,13,14. Tuttavia, poiché il cuore è troppo fragile per essere adatto a una compensazione attiva, deve essere eliminato utilizzando l'approccio passivo, che richiede molto tempo per conferire completa trasparenza.

In combinazione con tecniche di imaging avanzate come la microscopia a foglio di luce, CLARITY ha il potenziale per visualizzare tessuti cardiaci massicci 3D a risoluzione micrometrica. Nella microscopia a foglio di luce, l'illuminazione del campione viene eseguita con un sottile foglio di luce confinato nel piano focale dell'obiettivo di rilevamento. L'emissione di fluorescenza viene raccolta lungo un asse perpendicolare al piano di illuminazione¹⁵. L'architettura di rilevamento è simile alla microscopia a campo largo, rendendo l'acquisizione molto più veloce rispetto ai microscopi a scansione laser. Lo spostamento del campione attraverso il foglio luminoso consente di ottenere una tomografia completa di campioni di grandi dimensioni, fino a campioni di dimensioni centimetriche. Tuttavia, a causa delle proprietà intrinseche del fascio gaussiano è possibile ottenere un foglio di luce molto sottile (dell'ordine di pochi micron) solo per una limitata estensione spaziale, limitando così drasticamente il campo visivo (FoV). Recentemente, è stato introdotto un nuovo schema di eccitazione per superare questa limitazione e applicato per l'imaging cerebrale, consentendo ricostruzioni 3d con risoluzione isotropa¹⁶.

In questo documento, viene presentato un approccio di compensazione passiva, che consente una significativa riduzione dei tempi di compensazione necessari per il protocollo CLARITY. Il quadro metodologico qui descritto permette di ricostruire un cuore intero di topo con risoluzione micrometrica in un'unica scansione tomografica con un tempo di acquisizione nell'ordine dei minuti.

Protocollo

Tutte le manipolazioni e le procedure degli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida della Direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e conformi ai principi e ai regolamenti del Ministero della Salute italiano. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Ministero della Salute italiano (numero di protocollo 647/2015-PR). Tutti gli animali sono stati forniti da ENVIGO, Italia. Per questi esperimenti, sono stati utilizzati 5 topi maschi C57BL / 6J di 6 mesi di età.

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (pH 7,6) in una cappa chimica. Conservare le aliquote di PFA al 4% a -20 °C per diversi mesi.
2. Preparare la soluzione di idrogel: mescolare 4% acrilammide, 0,05% bis-acrilammide, 0,25% iniziatore AV-044 in 0,01 M PBS in una cappa chimica. Mantenere i reagenti e la soluzione su ghiaccio durante l'intera preparazione. Conservare le aliquote di idrogel a -20 °C per diversi mesi.
3. Preparare la soluzione di pulizia: Mescolare 200 mM di acido borico, 4% di sodio dodecil-solfato (SDS) in acqua deionizzata; pH 8,6 in una cappa chimica. Conservare la soluzione tra 21-37 °C per evitare la precipitazione di SDS.
4. Preparare la soluzione fresca di Tyrode il giorno dell'esperimento: aggiungere 10 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, 113 mM di NaCl, 1,2 mM di MgCl₂ e 4,7 mM di KCl; titolare a pH 7,4 utilizzando 1 M NaOH.

2. Isolamento cardiaco

1. Iniettare 0,1 ml di 500 U.I. eparina per via sottocutanea 30 minuti prima della procedura di isolamento cardiaco.
2. Riempire una siringa da 30 ml e tre piastre di Petri da 6 cm con una soluzione fresca di Tyrode. Fai una piccola spaccatura (3-4 mm di profondità) sul bordo di una delle piastre di Petri e mettila sotto un microscopio stereoscopico.
3. Fissare una cannula di 1 mm di diametro alla siringa e inserirla nella spaccatura della capsula di Petri. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella siringa.
4. Riempire una siringa da 20 mL con PFA al 4% e tenerla nel cappuccio chimico. Preparare una capsula di Petri vuota sotto il cofano.
5. Anestetizzare il topo con il 3% di isoflurano/ossigeno ad una portata di 1,0 L/min e sacrificarlo per lussazione cervicale secondo le norme vigenti in materia di benessere animale.
6. Dopo il sacrificio, rimuovere la pelliccia sul petto e aprire il petto per avere pieno accesso al cuore.
7. Isolare il cuore, immergerlo nella capsula di Petri precedentemente riempita con 50 ml di soluzione di Tyrode. Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare l'aorta immediatamente vicino all'arco aortico per avere il cuore esposto.
8. Trasferire il cuore al microscopio stereoscopico ed eseguire con attenzione l'incannulamento. Non inserire la cannula troppo in profondità nell'aorta (non più di 2 mm) per evitare danni ai tessuti.
9. Utilizzare un piccolo morsetto e una sutura (taglia 5/0) per fissare il cuore alla cannula.
10. Perfondere il cuore con 30 mL della soluzione di Tyrode con una pressione costante di 10 mL/min per rimuovere il sangue dai vasi.
11. Staccare la cannula dalla siringa e posizionare il cuore nella capsula di Petri riempita con la soluzione di Tyrode. Fare attenzione a non avere bolle d'aria nella cannula; In caso contrario, rimuovere correttamente le bolle d'aria.
12. Attaccare la siringa da 20 mL riempita con PFA freddo al 4% alla cannula e perfondere il cuore alla stessa pressione costante.
13. Incubare il cuore in 10 mL di PFA al 4% a 4 °C durante la notte (O/N). Per evitare la degradazione dei tessuti, eseguire i passaggi 2.6-2.13 nel più breve tempo possibile.

3. Pulizia del cuore

1. Il giorno seguente, lavare il cuore in 0,01 M PBS 3 volte a 4 °C per 15 min.
   NOTA: Dopo questo passaggio, il cuore può essere conservato in PBS + 0,01% di azoturo di sodio (NaN3) a 4 °C per diversi mesi.
2. Incubare il cuore in 30 mL di soluzione di idrogel agitando (15 rpm) a 4 °C per 3 giorni.
3. Degasare il campione a temperatura ambiente utilizzando un essiccatore, una pompa per vuoto e un sistema di tubi che collega l'essiccatore sia alla pompa che a una tubazione di azoto.
   1. Posizionare il campione nell'essiccatore e aprire il flaconcino, mantenendo il tappo su di esso.
   2. Chiudere l'essiccatore e rimuovere l'ossigeno dal tubo aprendo la tubazione dell'azoto.
   3. Accendere la pompa per vuoto per rimuovere l'ossigeno dall'essiccatore per 10 minuti.
   4. Spegnere la pompa e utilizzare la manopola dell'essiccatore per aprire la tubazione dell'azoto. Una volta che la pressione è uguale alla pressione atmosferica, aprire con attenzione l'essiccatore e chiudere rapidamente il flaconcino.
4. Mantenere il cuore nella soluzione di idrogel degassata a 37 °C per 3 ore a riposo.
5. Quando l'idrogel è correttamente polimerizzato e appare interamente gelatinoso, rimuovere con cura il cuore da esso e metterlo nel supporto del campione.
6. Inserire il portacampioni con il cuore in una delle camere di compensazione e chiuderlo correttamente per evitare perdite della soluzione di pulizia.
7. Accendere il bagno d'acqua in cui è posizionato il contenitore della soluzione di compensazione e la pompa peristaltica per avviare il ricircolo della soluzione di pulizia.
8. Cambiare la soluzione di compensazione nel contenitore una volta alla settimana per accelerare la procedura di chiarificazione.

4. Colorazione della membrana cellulare

1. Una volta che il cuore appare completamente chiarificato, rimuoverlo dal portacampioni e lavarlo in 50 ml di PBS riscaldato per 24 ore. Lavare nuovamente in 50 mL di PBS + 1% di Triton-X (PBS-T 1x) per 24 h.
2. Incubare il campione in 0,01 mg/mL di Agglutinina del Germe di Grano (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 mL di PBS-T 1x in agitazione (50 rpm) a temperatura ambiente per 7 giorni.
3. Dopo l'incubazione di 7 giorni, lavare il campione in 50 ml di PBS-T 1x a temperatura ambiente agitando per 24 ore.
4. Incubare il campione in PFA al 4% per 15 minuti e quindi lavarlo 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
   NOTA: Dopo questo passaggio, il cuore può essere conservato in PBS + 0,01% NaN3 a 4 °C per diversi mesi.
5. Incubare il cuore in concentrazioni crescenti di 2,2′-tiodietanolo (TDE) in 0,01 M PBS (20% e 47% TDE/PBS) per 8 ore ciascuna, fino alla concentrazione finale del 68% TDE in 0,01 M PBS per fornire l'indice di rifrazione richiesto (RI = 1,46). Questo è il mezzo corrispondente RI (RI-medium) per acquisire immagini¹⁶.

5. Montaggio e acquisizione del cuore

NOTA: Tutti i componenti del sistema ottico sono elencati in dettaglio nella tabella dei materiali.

1. Riempire delicatamente circa l'80% della cuvetta esterna (quarzo, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) con il mezzo RI.
   NOTA: Qui è possibile utilizzare diverse soluzioni non volatili che garantiscono un RI di 1,46.
2. Riempire delicatamente la cuvetta interna (quarzo, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) con lo stesso mezzo RI.
3. Immergere il campione all'interno della cuvetta interna. Le incubazioni del campione sopra descritte consentono al campione di rimanere stabile all'interno del mezzo IR senza essere trattenuto.
4. Spostare delicatamente il campione sul fondo della cuvetta usando una pinzetta sottile e disporre il cuore con il suo asse longitudinale parallelo all'asse principale della cuvetta per ridurre al minimo il percorso della luce di eccitazione attraverso il tessuto durante la scansione.
5. Fissare delicatamente il tappo su misura sopra la cuvetta interna con due viti.
6. Montare il campione sullo stadio del microscopio utilizzando i magneti.
7. Traslare manualmente lo stadio di campionamento verticale per immergere la cuvetta interna in quella esterna.
8. Accendere la sorgente luminosa di eccitazione (lunghezza d'onda di 638 nm), impostando una potenza bassa (nell'ordine di 3 mW).
9. Spostare il campione utilizzando il traduttore motorizzato per illuminare un piano interno del tessuto.
10. Accendere il software di imaging (HCImageLive) e impostare il trigger della telecamera sulla modalità esterna (foglio luminoso) per pilotare il trigger di acquisizione della telecamera dal software personalizzato che controlla l'intera configurazione.
11. Abilita il salvataggio automatico nel pannello Impostazioni scansione e imposta la cartella di output in cui devono essere salvate le immagini.
12. Regolare manualmente la posizione del campione nel piano XY con i traslatori lineari per spostare il campione al centro del FoV del sensore della fotocamera.
13. Spostare il campione lungo l'asse Z utilizzando il traslatore motorizzato lineare per identificare i bordi del cuore per la ricostruzione tomografica.
14. Aumentare la potenza del laser a ~20 mW, pronto per la sessione di imaging.
15. Avviare l'acquisizione tomografica, fare clic sul pulsante Start nel pannello Sequenza del software di imaging e contemporaneamente spostare il campione lungo l'asse Z alla velocità costante di 6 μm/s utilizzando il traduttore motorizzato.

Risultati

La configurazione di compensazione passiva sviluppata consente di ottenere un cuore di topo adulto cancellato (con una dimensione dell'ordine 10 mm x 6 mm x 6 mm) in circa 3 mesi. Tutti i componenti della configurazione sono montati come illustrato nella Figura 1. Il gradiente di temperatura trascurabile tra ciascuna camera di compensazione (dell'ordine di 3 °C) consente di mantenere la temperatura in un intervallo adeguato in tutte le camere.

Discussione

In questo lavoro, è stato introdotto un approccio di successo per chiarire, colorare e visualizzare un intero cuore di topo ad alta risoluzione. In primo luogo, è stato ottimizzato ed eseguito un protocollo di trasformazione tissutale (CLARITY), leggermente modificato per la sua applicazione sul tessuto cardiaco. Infatti, per ottenere un'efficace ricostruzione in 3D di un cuore intero, è fondamentale prevenire il fenomeno della diffusione della luce. La metodologia CLARITY ci permette di ottenere un cuore intatto alta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB