Stimolazione durale e test di von Frey periorbitale nei topi come modello preclinico di cefalea

Riepilogo

Il sintomo più notevole dell'emicrania è il forte dolore alla testa, e si ipotizza che questo sia mediato dai neuroni sensoriali che innervano le meningi. Qui, presentiamo un metodo per applicare localmente sostanze alla dura in modo minimamente invasivo mentre si utilizza l'ipersensibilità facciale come output.

Abstract

Si ritiene che le meningi craniche, composte da dura madre, aracnoide e pia madre, servano principalmente funzioni strutturali per il sistema nervoso. Ad esempio, proteggono il cervello dal cranio e ancorano / organizzano l'apporto vascolare e neuronale della corteccia. Tuttavia, le meningi sono anche implicate in disturbi del sistema nervoso come l'emicrania, dove il dolore sperimentato durante un'emicrania è attribuito all'infiammazione sterile locale e alla successiva attivazione di afferenze nocicettive locali. Tra gli strati nelle meningi, la dura madre è di particolare interesse nella fisiopatologia dell'emicrania. È altamente vascolarizzato, ospita neuroni nocicettivi locali ed è sede di una vasta gamma di cellule residenti come le cellule immunitarie. Sottili cambiamenti nel microambiente meningeo locale possono portare all'attivazione e alla sensibilizzazione dei nocicettori perivascolari durali, portando così al dolore emicranico. Gli studi hanno cercato di affrontare il modo in cui le afferenze durali vengono attivate / sensibilizzate utilizzando elettrofisiologia in vivo, tecniche di imaging o modelli comportamentali, ma questi comunemente richiedono interventi chirurgici molto invasivi. Questo protocollo presenta un metodo per l'applicazione relativamente non invasiva di composti sulla dura madre nei topi e un metodo adatto per misurare la sensibilità tattile simile alla cefalea utilizzando il test periorbitale di von Frey dopo stimolazione durale. Questo metodo mantiene l'integrità della dura e del cranio e riduce gli effetti confondenti delle tecniche invasive iniettando sostanze attraverso una cannula modificata di 0,65 mm alla giunzione di suture sagittali e lambdoidi non fuse. Questo modello preclinico consentirà ai ricercatori di studiare una vasta gamma di stimoli durali e il loro ruolo nella progressione patologica dell'emicrania, come l'attivazione dei nocicettori, l'attivazione delle cellule immunitarie, i cambiamenti vascolari e i comportamenti del dolore, il tutto mantenendo condizioni prive di lesioni al cranio e alle meningi.

Introduzione

Il dolore emicranico rimane un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo. L'Organizzazione Mondiale della Sanità la classifica come la sesta malattia più diffusa al mondo, che affligge poco meno del 15% della popolazione della Terra¹ e causa un notevole onere socioeconomico sulla società ^2,3. Le opzioni di trattamento e la loro efficacia sono state non ottimali e forniscono solo sollievo sintomatico e non modificano significativamente gli eventi fisiopatologici che sono alla base dell'insorgenza di emicrania ^4,5. La mancanza di successo del trattamento è probabilmente dovuta al fatto che l'emicrania è un disturbo multifattoriale la cui patologia è poco conosciuta, portando a un numero limitato di bersagli terapeutici. L'emicrania è anche difficile da catturare completamente nei modelli animali, soprattutto dato che la diagnosi di emicrania è fatta sulla base della comunicazione verbale con i pazienti che descrivono la loro esperienza con segni distintivi di emicrania come aura, mal di testa, fotofobia e allodinia. Ciononostante, è importante notare che i recenti progressi nei trattamenti per l'emicrania stanno attualmente superando i trattamenti per molte condizioni neurologiche che sono state ben convalidate dai modelli preclinici. Ad esempio, gli anticorpi monoclonali e le piccole molecole che colpiscono il peptide correlato al gene della calcitonina o il suo recettore hanno avuto molto successo nel migliorare la qualità della vita di chi soffre di emicrania e possono potenzialmente trasformare la gestione clinica dell'emicrania. Mentre c'è stato un progresso nella comprensione di questo disturbo, continua ad esserci molto ancora da chiarire.

Sulla base di modelli animali preclinici e studi sull'uomo, è ampiamente accettato che l'emicrania è iniziata dall'attivazione aberrante delle fibre nocicettive all'interno delle meningi che segnalano attraverso i gangli della radice dorsale del trigemino e della cervicale superiore ^6,7,8,9,10. Nonostante questa teoria, molti studi usano ancora la somministrazione sistemica di farmaci per comprendere i meccanismi sottostanti che contribuiscono all'emicrania. Mentre il dosaggio sistemico dei farmaci ha sostanzialmente rafforzato la nostra comprensione, questi risultati non valutano direttamente se le azioni locali all'interno del tessuto bersaglio di interesse svolgono un ruolo nell'emicrania. Al contrario, diversi studi hanno adottato un approccio per stimolare la dura; tuttavia, questi esperimenti richiedono l'impianto di cannula tramite una craniotomia invasiva e tempi di recupero prolungati^11,12. A causa di queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio minimamente invasivo per stimolare localmente la dura in cui la mancanza di una craniotomia elimina il recupero post-chirurgico e consente test immediati in animali svegli 12,13,14. Queste iniezioni vengono eseguite in anestesia con isoflurano leggero e somministrate alla giunzione delle suture sagittale e lambdoide nei topi.

Sono stati sviluppati diversi approcci per valutare le risposte comportamentali nocicettive nei roditori¹⁵. L'allodinia cutanea è stata riportata in circa l'80% dei malati di emicrania^16,17 e rappresenta un potenziale endpoint traslazionale per l'uso nei roditori. Nei modelli preclinici, l'applicazione di filamenti di von Frey alla regione plantare della zampa del roditore è stata utilizzata per valutare i comportamenti del dolore nei modelli preclinici di emicrania. Il limite principale di questo approccio è che non testa la regione cefalica. Il punteggio della smorfia facciale è stato utilizzato per catturare i comportamenti del dolore nei roditori analizzando le espressioni facciali dopo l'induzione di stimoli dolorosi^18,19. Tuttavia, i suoi limiti includono solo la cattura di risposte a stimoli acuti e non condizioni di dolore orofacciale cronico. La toelettatura facciale e la diminuzione dell'allevamento sono anche considerate output di risposte comportamentali in modelli preclinici di emicrania^20,21. I limiti del primo includono difficoltà nel differenziare le risposte al dolore dalla normale toelettatura di routine e altre sensazioni come il prurito. Nel caso di quest'ultimo, i comportamenti di allevamento in genere diminuiscono rapidamente dopo l'introduzione dei roditori in nuovi ambienti. Sebbene ciascuno di questi endpoint comportamentali sia prezioso nella comprensione di vari meccanismi che contribuiscono alle condizioni del dolore, vi è un bisogno critico di modelli preclinici di disturbi del dolore come l'emicrania per includere endpoint che catturano specificamente le risposte di ipersensibilità cefalica. Valutare l'ipersensibilità tattile della pelle periorbitale dopo stimolazione durale è un metodo che può fornire una migliore comprensione dei meccanismi che contribuiscono all'emicrania in cui i sintomi sensoriali sono prevalentemente di natura cefalica. Qui, descriviamo un metodo per somministrare sostanze sulla dura del topo come modello preclinico di emicrania. Dopo l'applicazione durale, presentiamo anche un metodo dettagliato per testare l'ipersensibilità tattile periorbitale utilizzando filamenti di von Frey calibrati applicati nel metodo Up-down di Dixon.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte previa approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Texas a Dallas. In questo studio sono stati utilizzati topi ICR (CD-1) (30-35 g) e C57/BL6 (25-30 g) di età compresa tra 6-8 settimane.

1. Infusore durale

1. Creare gli infusori/iniettori del mouse modificando una cannula interna e un infusore disponibili in commercio per iniezioni unilaterali con un cappuccio in plastica silice fusa non metallica regolabile e che si inserisce/si estende al di sotto di una cannula guida da 28 G con diametro interno (I.D.) di 0,18 mm e diametro esterno (O.D.) di 0,35 mm (Figura 1A).
2. Utilizzare una pinza o un altro dispositivo di misurazione per regolare il cappuccio in plastica silicea fusa sull'infusore a una lunghezza di 0,6 mm; misurato dalla punta dell'infusore al bordo del cappuccio di plastica di silice.
   1. Prestare attenzione a non piegare o opacizzare l'infusore quando si regola il tappo di plastica.
   2. Per altri ceppi di topo che non sono stati precedentemente utilizzati per iniezioni durali, determinare la lunghezza ottimale dell'infusore impostando la lunghezza a 0,6 mm e conducendo iniezioni pilota con inchiostro o colorante, regolando la lunghezza dell'infusore fino a quando non si osserva che il colorante è solo nella dura madre e non sul cervello o sul cranio.
3. Fissare l'estremità lunga (o l'estremità che non è stata misurata come 0,6 mm) dell'infusore regolato al tubo di plastica (tubo della pompa, 2 stop, ID 0,19 mm, lunghezza 406 mm).
   1. Tagliare il tubo a una lunghezza minima di 8 pollici per garantire che vi sia una linea sufficiente per contenere un volume di 5 μL.
   2. Assicurarsi che il tubo copra la parte metallica e la parte superiore del tappo di plastica situato sull'infusore. Ciò contribuirà a prevenire l'accumulo di bolle d'aria nella linea.
4. Attaccare l'altra estremità del tubo a una microsiringa di vetro da 10 μL (a tenuta di gas; ago cementato; 21 G con una proiezione di 10 mm), assicurandosi di avere una tenuta ermetica sulla parte metallica della siringa (Figura 1A).
5. Una volta collegata la linea, riempire la siringa con 5 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), liquido interstiziale sintetico (SIF) o altri veicoli di scelta per evitare la formazione di bolle d'aria.
   1. Se si osservano bolle d'aria nella linea, inondare la linea con il veicolo fino a quando le bolle non si sono dissipate.
      NOTA: può essere utile riempire la siringa con il veicolo prima di collegarla alla linea e quindi spingere il fluido attraverso la linea una volta collegato.
6. Dopo che la linea è stata riempita con 5 μL del veicolo e sta funzionando in modo efficiente, caricare 5 μL del farmaco / soluzione nella siringa Hamilton (inchiostro o colorante possono essere utilizzati come alternativa al farmaco / soluzione se si impara o si pratica questa tecnica).
   1. Assicurarsi che tutte le soluzioni per veicoli somministrate sulla dura siano mantenute a pH 7,4 e misurate ad un'osmolalità di 310. Ciò riduce la potenziale attivazione dei canali ionici sensibili all'acido e di altri canali osmosensibili all'interno della dura.
7. Il volume massimo testato nei topi che non hanno causato perdite nel cervello è di circa 10 μL. Gli effetti comportamentali dopo iniezioni con questo volume non sono stati testati. Per questo motivo, somministrare solo 5 μL della soluzione sulla dura.
   NOTA: Queste osservazioni si basano sui ceppi di topo/ età / peso di topi CD1 / ICR di 6-8 settimane.

2. Iniezioni di durale

1. Una volta preparata la siringa e caricato il farmaco, posizionare un topo piatto sull'addome e anestetizzarlo sotto un breve isoflurano al 3% con una portata di ossigeno di 0,5-1 L / min tramite naso.
   1. Dopo che il mouse non mostra più un riflesso di pizzico, regolare l'anestesia e sostenerla a un isoflurano dell'1,5%.
2. Una volta anestetizzato, applicare un unguento oftalmico sterile sugli occhi e radersi la testa dell'animale, quindi disinfettare la pelle con povidone-iodio ed etanolo. Successivamente, mettiti in una posizione favorevole a un'iniezione di successo.
3. Usa una mano per fissare la testa dell'animale e tieni l'infusore con l'altra mano.
4. Sondare attentamente e localizzare la giunzione delle suture sagittale e lambdoidale sul cranio del topo (Figura 1B, C).
   1. Per individuare questa giunzione discreta attraverso la pelle, utilizzare le caratteristiche topografiche del cranio e sondare delicatamente la posizione generale della giunzione con l'infusore.
   2. Verificare la posizione della giunzione riposizionando l'infusore lungo il cranio e sentendo la posizione esatta.
5. Una volta che la sutura è posizionata e l'infusore è in posizione, molto lentamente e delicatamente muovere l'infusore avanti e indietro fino a quando non perfora la pelle e scende nella giunzione fino al tappo di plastica.
   NOTA: assicurarsi di inserire l'intera punta da 0,6 mm dell'infusore nella giunzione.
6. Per verificare l'accuratezza, utilizzare inchiostro o colorante come soluzione per iniezione ed eutanasizzare e decapitare il mouse.
   1. Rimuovere la calotta cranica per visualizzare il colorante all'interno della dura madre (Figura 1C).
      NOTA: La tintura non deve essere osservata sul cervello o all'esterno del cranio. Allo stesso modo, i topi in qualsiasi esperimento dovrebbero essere controllati post-mortem per verificare l'accuratezza dell'iniezione e per garantire che l'integrità della dura madre non sia stata danneggiata.
7. Dopo l'iniezione, rimuovere il topo dall'anestesia, attendere che riprenda conoscenza e quindi tornare alla sua gabbia o metterlo in una camera di prova per iniziare i test desiderati.
   NOTA: consentire al mouse di recuperare dall'anestesia per un minimo di 30 minuti prima di eseguire qualsiasi esperimento comportamentale.

3. Periorbitale von Frey

1. Inizia lo studio con una coorte di circa 16-20 topi.
2. Uno il giorno prima dell'assuefazione, maneggia ogni mouse per almeno 5 minuti.
3. Circa 24 ore dopo la manipolazione, abituare i topi alle condizioni della sala prove e all'apparato di prova di von Frey (Figura 2A).
   NOTA: L'apparecchio di prova acrilico è costituito da singoli scomparti con coperchi che sono circa 3 in x 3,5 in x 5 in (L x A x P) e sono supportati da supporti in alluminio collegati tramite filo di rete in acciaio zincato quadrato 0,25 in 19 G.
   1. Posiziona i topi all'interno di un bicchiere di carta bianca da 4 once posizionato orizzontalmente che è inodore e non contiene polietilene o cera di paraffina.
      NOTA: Questi tipi di tazze sono preferiti perché riducono i disturbi gastrointestinali nei topi se ingeriti (Figura 2B).
4. Mentre gli animali sono nelle rispettive camere, posizionare un pellet della normale dieta chow nella camera individuale di ciascun topo per calmare gli animali ed evitare qualsiasi stress inutile per gli animali. Fallo per 3 giorni prima di qualsiasi test comportamentale di von Frey.
   1. Assicurarsi che ogni volta che i topi sono nella camera che ci sia accesso al cibo.
   2. Numerare e assegnare ogni animale allo stesso spazio nel rack di prova. Metti il mouse nella stessa tazza ogni giorno del periodo di prova per assicurarti che ogni animale si acclimati al suo ambiente di test.
      NOTA: i topi rosicchieranno le tazze e successivamente distruggeranno le tazze. Se ciò dovesse accadere, sostituisci la tazza ed etichettala con il numero del mouse corrispondente.
5. Dopo i primi 3 giorni di assuefazione, posizionare i topi nelle loro camere individuali.
   1. Lasciare che gli animali si acclimatino alla sala di prova e alle camere per almeno 1 ora prima di qualsiasi test di von Frey per consentire ai topi di calmarsi e successivamente sono più facili da testare.
6. Dopo l'acclimatazione alla stanza il giorno del test, rimuovere un mouse mentre è ancora nella sua tazza dalla rispettiva camera.
   1. Mantenere la tazza in posizione orizzontale in modo che il mouse sia su entrambe le zampe anteriori e posteriori per aiutare a mantenere il loro peso uniformemente distribuito.
      NOTA: la distribuzione ineguale del peso può alterare le risposte degli animali e persino impedire agli animali di rispondere.
7. Posizionare la tazza con il mouse all'interno sul tavolo sotto il rack di prova sul pad assorbente.
8. Per il test di von Frey periorbitale, posizionare il filamento di von Frey da 0,07 g direttamente al centro del viso e tra gli occhi.
9. Applicare una pressione sufficiente sul filamento per far piegare i capelli di von Frey in una formazione a forma di "C".
   1. Mantenere il contatto con la regione almeno 3 s ma non più di 5 s o fino a quando il mouse ritira la testa e striscia sul filamento con la zampa.
      NOTA: se il filamento scivola o più della punta del filamento tocca l'animale durante il test, le eventuali risposte non devono essere conteggiate. Queste risposte possono essere in risposta al pennello che sono attivate da diversi meccanorecettori e quindi potrebbero non riflettere risultati accurati.
   2. Applicare i filamenti di von Frey secondo il metodo "up-down" di Dixon^22,23.
      1. Inizialmente, applicare il filamento di von Frey che ha un peso di 0,07 g. Il filamento più basso possibile e il filamento più testato in questo studio sono filamenti con pesi di 0,008 g e 0,6 g, rispettivamente.
      2. Utilizzare i filamenti di peso 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g per eseguire questo test.
      3. In questo metodo, se un animale non mostra una risposta al filamento, applicare il filamento del prossimo peso in grammi più alto.
      4. Se il mouse risponde a un filamento, considera che il mouse risponde a quel filamento. In tal caso, applicare il filamento del prossimo peso in grammi inferiore.
      5. Ripetere questo schema fino a quando l'animale non viene testato 4 volte dopo la risposta iniziale o si determina che l'animale non risponde a qualsiasi filamento testato nel test.
         NOTA: Astenersi dall'applicare qualsiasi pressione aggiuntiva derivante dal braccio o dal polso. Una scala può essere utilizzata per praticare l'applicazione del filamento.

4. Test per le soglie di prelievo di base

1. Prima di essere inclusi in un esperimento, assicurarsi che i topi raggiungano una soglia di astinenza al basale compresa tra 0,5-0,6 g.
   1. Un topo raggiunge la linea di base se non risponde a qualsiasi filamento testato nella serie menzionata al punto 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g).
2. Testare i topi ogni giorno quando si stabiliscono le soglie di astinenza al basale.
   1. I test consentono agli animali di acclimatarsi alle condizioni di prova e alla pressione dei filamenti di von Frey.
   2. Se i topi sono ancora estremamente ipersensibili dopo il terzo giorno di test, provare ad aspettare 1 o 2 giorni prima di testare di nuovo.
      NOTA: troppo tempo tra i giorni di prova può comportare che l'animale non riesca ad adattarsi al peso del filamento sulla regione periorbitale, non raggiungendo così la soglia di sospensione mirata.
3. Testare i topi per circa 7 giorni prima di determinare quali animali non soddisfano i criteri di inclusione per un esperimento.
   NOTA: Circa il 70% dei topi raggiungerà il livello basale target.
   1. Prima della stimolazione durale, analizzare i dati basali per escludere qualsiasi topo che non abbia raggiunto un valore basale di 0,5-0,6 grammi o superiore.
   2. Dopo l'esclusione, allocare in modo casuale ogni mouse rimanente a un gruppo di test. Raggiungi questo obiettivo disegnando da una tazza o scrivendo uno script su un foglio di calcolo per randomizzare i numeri in un gruppo.

5. Analisi dei risultati di von Frey

1. Una volta ottenuta la serie di risposte, determinare il delta, il valore k, la soglia del 50% e la soglia di prelievo in grammi secondo i metodi precedentemente pubblicati²⁴.
2. Calcola la soglia di prelievo usando questa formula WT = 10 ^{(x * F + B),} dove WT = soglia di prelievo, F = soglia di prelievo della zampa calcolata tramite il metodo Chaplan e B = regressione lineare del log (forza di flessione) = x * Numero di filamento + B.
3. Traccia i dati come soglia di prelievo del 50% o soglia media di prelievo in grammi.

Risultati

Questo metodo di iniezione viene utilizzato per somministrare stimoli sulla dura dei topi in modo che possano verificarsi successivi test comportamentali. L'output comportamentale più comune misurato con questo modello è l'ipersensibilità facciale cutanea valutata tramite von Frey 12,13,14. Qui mostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare i potenziali contributi specifici del sesso alla patologia dell'emi...

Discussione

I cambiamenti disadattivi nel sistema nocicettivo locale nella dura sono considerati un contributo chiave alla fase di mal di testa degli attacchi di emicrania nonostante la mancanza di lesioni tissutali^25,26. Qui lo studio presenta un metodo in base al quale la stimolazione minimamente invasiva della dura può indurre ipersensibilità tattile facciale. Chiarire i meccanismi e gli eventi coinvolti nell'attivazione del nocicettore durale senza causare danni al cra...

Materiali

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Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html