Test di protezione enzimatica migliorato per studiare l'internalizzazione dello Staphylococcus aureus e l'efficacia intracellulare dei composti antimicrobici

Riepilogo

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere come studiare l'estensione dell'internalizzazione dello Staphylococcus aureus e la sua capacità di sopravvivere all'interno della cellula ospite umana, nonché l'efficacia intracellulare dei composti antimicrobici.

Abstract

Lo Staphylococcus aureus esprime fattori di virulenza per innescare la sua internalizzazione nelle cellule eucariote e per sopravvivere all'interno di diversi compartimenti subcellulari. Questo articolo descrive un test di protezione enzimatica per studiare l'entità dell'internalizzazione di S. aureus e la sua sopravvivenza intracellulare nelle cellule fagocitiche aderenti non professionali (NPPC), nonché l'efficacia intracellulare dei composti antimicrobici. Le NPPC vengono coltivate in una piastra multi-pozzo fino a raggiungere il 100% di confluenza. Le colture di S. aureus vengono coltivate durante la notte in terreno di coltura cellulare. La sospensione batterica viene diluita in base al numero di cellule per pozzetto per inoculare le cellule ad una molteplicità controllata di infezione. Le cellule inoculate vengono incubate per 2 ore per consentire ai batteri di essere internalizzati dalle NPPC, a seguito delle quali la lisostafina viene aggiunta al terreno di coltura per uccidere selettivamente i batteri extracellulari. La lisostafina è presente nel terreno di coltura per il resto dell'esperimento.

A questo punto, le cellule infette potrebbero essere incubate con composti antimicrobici per valutare la loro attività intracellulare contro S. aureus. Successivamente, le cellule vengono lavate tre volte per rimuovere i farmaci e il carico intracellulare di S. aureus viene quindi quantificato coltivando su piastre di agar. In alternativa, per studiare i fattori di virulenza stafilococcica coinvolti nella sopravvivenza intracellulare e nella tossicità cellulare, la lisostafina potrebbe essere inattivata con la proteinasi K per eliminare la necessità di fasi di lavaggio. Questo suggerimento migliora l'affidabilità della quantificazione della carica batterica intracellulare, soprattutto se le cellule tendono a staccarsi dalla piastra di coltura quando diventano pesantemente infettate a causa della moltiplicazione di S. aureus intracellulare. Questi protocolli possono essere utilizzati praticamente con tutti i tipi di NPPC aderenti e con modelli di coltura cellulare 3D come gli organoidi.

Introduzione

Lo Staphylococcus aureus è sia un agente patogeno potenzialmente letale che un batterio commensale della pelle e della mucosa che colonizza due miliardi di individui in tutto il ^mondo1. Nell'uomo, i portatori nasali di S. aureus hanno un aumentato rischio di infezione con il proprio ceppo di trasporto; tuttavia, i determinanti multifattoriali del trasporto mucoso di S. aureus non sono ancora ^chiari1,2. Oltre alle infezioni acute, i pazienti possono anche sviluppare infezioni croniche da S. aureus che sono spesso difficili da ^curare3. Una migliore comprensione delle interazioni ospite-patogeno durante la colonizzazione e l'infezione è fondamentale per sviluppare nuove strategie terapeutiche e migliorare la gestione del paziente.

In vitro, S. aureus può innescare la sua internalizzazione nelle cellule ospiti che esprimono l'integrina α5β14. L'interazione tripartita tra le proteine leganti la fibronectina stafilococcica ancorate alla parete cellulare di S. aureus, la fibronectina e l'integrina β1 espressa sulla superficie della cellula ospite è ben nota come la principale via di internalizzazione di S. aureus in NPPC come cheratinociti, osteoblasti, fibroblasti e cellule epiteliali ed endoteliali4. Studi recenti dimostrano che S. aureus può essere trovato all'interno delle cellule umane durante la colonizzazione ^nasale5,6 e l'infezione7. Tuttavia, il ruolo del serbatoio intracellulare nella patogenesi dell'infezione da S. aureus rimane poco chiaro. Le cellule ospiti potrebbero fungere da rifugio per S. aureus, che è protetto sia dal sistema ^immunitario8 che dalla maggior parte dei composti ^{antimicrobici6,9}.

Il test di protezione della lisostafina, descritto da ^Proctor10 all'inizio degli anni 1980, consente lo studio dei fattori batterici e dell'ospite coinvolti nell'internalizzazione degli isolati di S. aureus . La lisostafina è una batteriocina prodotta da Staphylococcus simulans, che mostra una potente attività contro quasi tutti gli isolati di S. aureus , compresi i ceppi resistenti agli ^{antibiotici11}. La lisostafina è stata utilizzata per distruggere solo S. aureus extracellulare per consentire il conteggio dei soli batteri intracellulari ^vitali12. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata e ha contribuito alla scoperta di diversi fattori di virulenza di S. aureus. La gentamicina, da sola e combinata con la lisostafina, è anche ampiamente utilizzata per studiare i batteri intracellulari.

Tuttavia, uno studio recente ha dimostrato che la gentamicina entra nelle cellule eucariotiche e raggiunge i batteri internalizzati in modo dipendente dal tempo e dalla ^{concentrazione13}. Questo studio ha anche dimostrato che la lisostafina non entra nelle cellule eucariotiche, confermando che un saggio di protezione enzimatica a base di lisostafina (EPA) è il test più accurato per quantificare il carico intracellulare di S. aureus per ^coltura13. Indipendentemente da quale composto viene utilizzato per distruggere i batteri extracellulari (ad esempio, lisostafina o gentamicina), deve essere rimosso lavando le cellule prima di placcare S. aureus intracellulare su piastre di agar. I lavaggi successivi possono provocare il distacco di cellule, in particolare cellule scarsamente aderenti (ad esempio, cellule fortemente infette), che porterebbero a una sottostima del carico intracellulare di S. aureus . Questo documento descrive in dettaglio come l'EPA può essere utilizzato per quantificare il carico intracellulare di S. aureus e per misurare l'efficacia intracellulare dei composti antimicrobici utilizzando un modello in vitro . Da notare, è stato proposto un metodo semplice per migliorare l'affidabilità della quantificazione del carico intracellulare evitando lavaggi intensivi.

Protocollo

1. Coltura di cellule epiteliali umane

1. Preparare il terreno di coltura completo con il mezzo di coltura modificato Eagle medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio con rosso fenolo, integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) senza antibiotici.
2. Coltiva cellule epiteliali A549 in terreno di coltura completo a 36 ± 1 °C in 5% di _CO2. Garantire l'uso di un recipiente di coltura di dimensioni adeguate per avere abbastanza cellule per le fasi successive (vedere il passaggio 1.10).
   NOTA: Un pallone da 75 ^cm2 (T-75) è sufficiente per seminare due piastre a 24 pozzetti e sottocoltura le cellule.
3. Due giorni prima dell'infezione, preparare una singola piastra a 24 pozzetti.
4. Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura esaurito dal pallone T-75 e lavare le cellule una volta con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
5. Aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA e incubare le cellule per 5 minuti a 36 ± 1 °C al 5% di _CO2.
6. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo e trasferire le cellule in un tubo.
7. Centrifugare le celle per 5 min a 300 × g.
8. Scartare il surnatante e risospese le cellule in 10 ml di terreno di coltura fresco completo.
9. Contare le celle con un contatore automatico di celle (o una camera di conteggio).
10. Diluire le cellule in terreno di coltura completo per preparare 30 mL di sospensione cellulare ad una concentrazione di 2,0 × ¹⁰⁵ cellule/mL.
11. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, che corrisponde a una densità cellulare di circa 1,0 × ¹⁰⁵ celle/cm² per un'area del pozzo di 2 cm².
12. Incubare le cellule per 48 ore a 36 ± 1 °C in 5% di _CO2 fino a raggiungere il 100% di confluenza.
    NOTA: Oltre alle condizioni da testare, tre pozzetti devono essere riservati al conteggio cellulare il giorno dell'infezione (vedere il punto 3.1.4). In base al numero di condizioni da testare, è possibile preparare contemporaneamente fino a due piastre da 24 pozzetti. I volumi indicati nel protocollo devono essere aumentati di conseguenza.

2. Coltura dei ceppi di S. aureus

1. Due giorni prima dell'infezione, preparare un mezzo di infezione completo con DMEM ad alto glucosio senza rosso fenolo, integrato con FBS al 10% senza antibiotici.
2. Ceppi di S. aureus da testare su piastre di agar.
3. Incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 ± 1 °C.
4. Il giorno prima dell'inoculazione, inoculare una colonia del ceppo S. aureus da testare in 10 ml di terreno di infezione completo.
5. Incubare i batteri per 18-24 ore a 36 ± 1 °C con agitazione a 160 giri/min. Utilizzare tubi da 50 ml tenuti a 45° per evitare che i batteri si depositino.
   NOTA: Prima di iniziare con un nuovo ceppo, si raccomanda di verificarne la suscettibilità alla lisostafina nelle stesse condizioni di coltura che verranno utilizzate per ulteriori esperimenti (media, cariche batteriche e concentrazione di lisostafina e tempo di incubazione). È anche importante determinare la carica batterica corrispondente a un _OD600nm di 0,5 perché potrebbe variare leggermente da un ceppo all'altro. Le condizioni di coltura dei ceppi batterici potrebbero essere adattate in base allo scopo sperimentale.

3. Saggio di infezione con S. aureus

1. Determinazione della densità e della vitalità cellulare
   1. Rimuovere e scartare il terreno di coltura esaurito dai tre pozzetti dedicati al conteggio delle celle A549.
   2. Aggiungere 1 mL di mezzo infettivo completo contenente 5 μg/mL di Hoechst 33342 e 1 μg/mL di ioduro di propidio.
      NOTA: Hoechst 33342 è un mutageno noto e deve essere maneggiato con cura. Lo ioduro di propidio, un potenziale mutageno, deve essere maneggiato con cura e smaltito in modo sicuro secondo le normative applicabili.
   3. Incubare le cellule per 30 minuti a 36 ± 1 °C in 5% di _CO2.
   4. Contare il numero di cellule e calcolare la vitalità cellulare utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo di esercizio.
      NOTA: Se non è disponibile un microscopio a fluorescenza, la densità e la vitalità cellulare possono essere calcolate con la colorazione blu tripano utilizzando una camera di conteggio delle cellule.
2. Preparazione della sospensione batterica
   1. Erogare 25 mL di mezzo di infezione completo in un tubo e preriscaldare a 36 ± 1 °C.
   2. Regolare la sospensione di S. aureus su _unOD600nm di 0,5 in mezzo di infezione completo utilizzando un densimetro cellulare.
   3. Preparare 20 mL di sospensione batterica per l'inoculazione cellulare diluendo lo 0,5 _OD600nm in mezzo di infezione completo per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 1 in base al numero di cellule per pozzetto.
      NOTA: Il MOI corrisponde al numero di batteri aggiunti per cellula in ciascun pozzetto. Ad esempio, per ottenere un MOI di 1 con 1,0 × ¹⁰⁶ cellule per pozzetto, preparare una sospensione batterica a 2,0 × ¹⁰⁶ CFU/mL in modo che possano essere aggiunti ¹⁰⁶ CFU in un volume di 500 μL (vedere il passaggio 3.3.3). Il MOI può essere regolato in base ai tipi di cellule e ai ceppi batterici da testare.
   4. Utilizzare una piastra a spirale automatica per determinare la carica di S. aureus della sospensione batterica diluita da utilizzare per la fase di inoculazione cellulare.
   5. Incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 ± 1 °C.
   6. Il giorno successivo, conta il numero di colonie con un contatore di colonie per calcolare il MOI accurato per ogni ceppo testato.
      NOTA: se non è disponibile una piastra a spirale automatica, la carica batterica potrebbe essere determinata mediante diluizione seriale su una piastra di agar. Vedere il manuale analitico batteriologico per i ^dettagli14.
3. Inoculazione cellulare
   1. Osservare ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti al microscopio a basso ingrandimento per assicurarsi che le cellule siano sane e crescano come previsto.
   2. Rimuovere e scartare il terreno di coltura cellulare esaurito dalla piastra a 24 pozzetti.
   3. Aggiungere 500 μL di sospensione batterica per l'inoculazione a ciascun pozzetto con cellule confluenti al 100%.
   4. Incubare le cellule per 2 ore a 36 ± 1 °C e 5% di _CO2.
      NOTA: si raccomanda di utilizzare tre pozzetti della piastra per ogni condizione da testare (triplice) e di eseguire almeno tre esperimenti indipendenti. Il ritardo di incubazione può essere adattato in base allo scopo sperimentale.
4. Quantificazione dei batteri intracellulari con un migliore saggio di protezione enzimatica (iEPA)
   1. Preparare 7 mL di tampone di lisi 4x con 3,5 mL di Triton X-100 al 2% in acqua sterile e 3,5 mL di tripsina-EDTA.
   2. Preparare una soluzione madre di lisostafina a 10 mg/mL in tampone di acetato e aliquota 25 μL in crioviali. Conservare a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
   3. Preparare 250 μL di una soluzione di lavoro fresca di lisostafina a 1 mg/mL mescolando 25 μL della soluzione madre di lisostafina (10 mg/mL) e 225 μL di 0,1 M Tris-HCl. Conservare a 4 °C per un massimo di 48 ore.
   4. Preparare 6,25 mL di terreno di infezione completo integrato con lisostafina aggiungendo 6 mL di terreno di infezione completo a 250 μL della soluzione di lavoro di lisostafina.
   5. Aggiungere 250 μL di mezzo di infezione completo integrato con lisostafina in ciascun pozzetto e agitare delicatamente la piastra ruotando la piastra a mano.
   6. Incubare le cellule per 1 ora a 36 ± 1 °C in 5% di _CO2 per lasciare che la lisostafina uccida i batteri extracellulari.
   7. Alla fine del tempo di incubazione, aggiungere 10 μL di proteinasi K a 20 mg/mL in ciascun pozzetto per inattivare la lisostafina.
   8. Incubare le cellule per 2 minuti a temperatura ambiente.
   9. Aggiungere 250 μL di tampone di lisi 4x per lisare le cellule mediante shock osmotico.
   10. Incubare le cellule per 10 minuti a 36 ± 1 °C.
   11. Mescolare accuratamente tubando su e giù dieci volte su tutto il fondo del pozzo per garantire che le cellule siano completamente lisate e omogeneizzate.
   12. Utilizzare una piastra a spirale automatica per determinare il carico di S. aureus di ciascun pozzo.
   13. Incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 ± 1 °C.
   14. Il giorno dopo, conta il numero di colonie con un contatore di colonie per calcolare il carico intracellulare di S. aureus di ciascun pozzo.
5. Misurazione dell'efficacia intracellulare di composti antimicrobici con saggio di protezione enzimatica (EPA)
   1. Preparare 25 mL di tampone di lisi 1x con 3,125 mL di Triton X-100 al 2% in acqua sterile, 6,25 mL di tripsina-EDTA e 15,625 mL di acqua sterile.
   2. Preparare 250 μL di una soluzione di lavoro fresca di lisostafina a 1 mg/mL mescolando 25 μL di una soluzione madre di lisostafina (10 mg/mL) e 225 μL di 0,1 M Tris-HCl.
   3. Preparare 25 mL di terreno di infezione completo integrato con lisostafina aggiungendo 24,75 mL di terreno di infezione completo a 250 μL della soluzione di lavoro della lisostafina.
   4. Per ogni composto antimicrobico da testare, preparare 3,1 mL di terreno di infezione completo integrato con lisostafina e il composto antimicrobico alla concentrazione da studiare.
   5. Rimuovere e scartare il terreno di coltura cellulare esaurito dalla piastra a 24 pozzetti.
   6. Aggiungere 1 mL di mezzo di infezione completo integrato con lisostafina.
   7. Incubare le cellule per 1 ora a 36 ± 1 °C in 5% di _CO2 per lasciare che la lisostafina uccida i batteri extracellulari.
   8. Rimuovere e scartare il mezzo integrato con lisostafina dalla piastra a 24 pozzetti.
   9. Riempire tre pozzetti con 1 mL di mezzo integrato con lisostafina più il composto antimicrobico da testare.
   10. Ripetere il passaggio 3.5.9 per ciascun composto antimicrobico da testare.
   11. Per la condizione di controllo, riempire tre pozzetti con 1 mL di mezzo integrato con lisostafina senza alcun composto antimicrobico.
   12. Incubare le cellule per 24 ore a 36 ± 1 °C in 5% di _CO2.
   13. Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere e scartare il mezzo esaurito e lavare delicatamente ogni pozzetto tre volte con DPBS sterile con _CaCl2 e _MgCl2.
   14. Aggiungere 1 mL di 1x tampone di lisi a ciascun pozzetto per staccare e lisare le cellule per shock osmotico.
   15. Incubare le cellule per 10 minuti a 36 ± 1 °C.
   16. Mescolare accuratamente tubando su e giù dieci volte tutto il pozzo per garantire che le cellule siano completamente lisate e omogeneizzate.
   17. Utilizzare una piastra a spirale automatica per determinare il carico di S. aureus di ciascun pozzo.
   18. Incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 ± 1 °C.
   19. Il giorno dopo, conta il numero di colonie con un contatore di colonie per calcolare il carico intracellulare di S. aureus di ciascun pozzo.
       NOTA: L'attività intracellulare di ciascun composto antimicrobico deve essere calcolata in base alla carica batterica della condizione di controllo. È anche importante controllare la citotossicità di tutti i composti antimicrobici per dimostrare che le differenze osservate tra il controllo e i composti non sono dovute alla morte cellulare.

Risultati

I risultati dell'internalizzazione di S. aureus da parte delle cellule epiteliali A549 sono rappresentati nella Figura 1A. Le cellule A549 sono state inoculate con S. aureus SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B, che manca delle proteine leganti la fibronectina A e B, ad un MOI di 1 per 2 ore. Per distruggere S. aureus extracellulare, la lisostafina è stata aggiunta al terreno di coltura e le cellule sono state incubate per 1 ora. Successivamente, la lisostafina è stata rimossa mediante lavaggio per EPA o inattivata con proteinasi K per iEPA. Quindi, le cellule sono state interrotte nel tampone di lisi e la carica batterica è stata quantificata dalla coltura. Utilizzando l'EPA, i carichi intracellulari medi erano rispettivamente di 4,46 e 0,49 Log CFU/mL per SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B (Figura 1A, barre verdi). Utilizzando iEPA, i carichi intracellulari medi erano rispettivamente di 4,53 e 0,56 Log CFU/mL per SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B (Figura 1A, barre rosse). È interessante notare che sia l'EPA che l'iEPA hanno mostrato risultati simili, il che può essere spiegato dalla facilità di eseguire i lavaggi quando le cellule sono in buone condizioni e perché la citotossicità indotta da S. aureus è molto bassa in questi contesti sperimentali (dati non mostrati).

I risultati dell'attività intracellulare di vancomicina, rifampicina e levofloxacina contro S. aureus sono descritti nella Figura 1B. Per misurare l'attività intracellulare di questi antibiotici, le cellule HaCaT sono state inoculate con S. aureus ATCC 29213 ad un MOI di 1 per 2 ore. Le cellule sono state incubate con lisostafina, con o senza i composti antimicrobici da testare, per 24 ore. Successivamente, la lisostafina e i composti antimicrobici sono stati rimossi mediante lavaggio. Le cellule sono state interrotte nel tampone di lisi e la carica batterica è stata quantificata dalla coltura. I carichi intracellulari medi erano 4,57, 4,51, 3,03 e 2,91 log CFU/mL per il controllo, vancomicina (50 μg/mL), rifampicina (7 μg/mL) e levofloxacina (10 μg/mL), rispettivamente (Figura 1B).

Figura 1: Carico intracellulare di Staphylococcus aureus nelle cellule epiteliali . (A) Saggio di protezione enzimatica (barre verdi) e saggio di protezione enzimatica migliorato (barre rosse) in cellule A549 infette da S. aureus SF8300 WT e ΔfnbA/B. (B) Attività intracellulare di composti antimicrobici in cellule HaCaT infette da S. aureus ATCC 29213. Le barre rappresentano i valori medi di tre esperimenti indipendenti eseguiti in triplice copia. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. p < 0,0001. Abbreviazioni: Ctrl = controllo; cfu = unità formanti colonie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I saggi qui descritti sono preziosi per studiare l'entità dell'internalizzazione e la sopravvivenza intracellulare di S. aureus nelle NPPC, nonché l'efficacia intracellulare dei composti antimicrobici6,15,16. Alcuni passaggi in entrambi i protocolli di analisi possono essere critici. Le condizioni di salute e la densità delle cellule devono essere perfettamente controllate e coerenti tra esperimenti indipendenti. L'inoculo batterico deve essere accuratamente standardizzato per ottenere un MOI reale vicino al MOI teorico mirato. In generale, bisogna fare attenzione a non staccare nessuna delle cellule durante il pipettaggio. I lavaggi per rimuovere la lisostafina e gli antibiotici sono passi critici nell'EPA. L'uso della proteinasi K è stato trovato per migliorare questo passaggio quando non viene utilizzato alcun antibiotico (vedi sotto). Ultimo ma non meno importante, le cellule dovrebbero essere completamente staccate in ogni pozzetto e completamente omogeneizzate dopo l'incubazione con il tampone di lisi per quantificare in modo affidabile il carico intracellulare di S. aureus.

In alcuni casi, possono verificarsi problemi e diversi punti devono essere controllati prima. In caso di mancanza di riproducibilità, si deve tenere presente che S. aureus può formare grumi, rendendo imprecisa la quantificazione per assorbanza. L'aggregazione dei batteri può essere aumentata mediante centrifugazione e fasi di lavaggio se il terreno di coltura deve essere sostituito (ad esempio, per eliminare una proteina secreta). La sospensione batterica deve essere utilizzata rapidamente perché i batteri continuano a crescere a temperatura ambiente. L'efficacia della lisostafina potrebbe diminuire a causa di condizioni di conservazione errate, pH subottimale per l'attività enzimatica nei terreni di coltura, variabilità nell'attività enzimatica tra lotti e fornitori e mancanza di sensibilità alla lisostafina di alcuni ceppi in specifiche condizioni di crescita. Il rosso fenolo potrebbe avere un leggero effetto batteriostatico, soprattutto quando il terreno di coltura è relativamente povero di sostanze nutritive rispetto ai tipici brodi utilizzati per la crescita dei batteri. Pertanto, è consigliabile utilizzare un terreno di coltura cellulare senza rosso fenolo, che migliora anche le osservazioni microscopiche a fluorescenza riducendo il rumore di fondo.

Sebbene questo metodo sia uno strumento prezioso per studiare il destino intracellulare di diversi ceppi, alcuni limiti del metodo dovrebbero essere considerati. L'uso di un MOI molto elevato può sovraccaricare la capacità di internalizzazione da parte delle NPPC e livellare le differenze tra i diversi ceppi testati. L'entità dell'internalizzazione dei ceppi più citotossici può essere sottovalutata perché la lisostafina (o antibiotici) distrugge rapidamente S. aureus che viene rilasciato dalle cellule danneggiate. Pertanto, gli esperimenti con durate estese (cioè per studiare la sopravvivenza intracellulare o l'attività intracellulare degli antibiotici) sono più facili da impostare con ceppi con bassa citotossicità. Pertanto, il tempo di incubazione e il MOI devono essere regolati accuratamente in base alla virulenza del ceppo, al tipo di cellula e allo scopo sperimentale.

Il metodo qui descritto con l'uso della lisostafina è più affidabile di quelli a base di gentamicina perché, a differenza della lisostafina, la gentamicina tende ad essere internalizzata dalle cellule ^ospiti13. L'altro vantaggio è la possibilità di inattivare la lisostafina. L'inibizione dell'attività della lisostafina è stata riportata da Kim et ^al.13 con l'uso di EDTA per chelare ioni di zinco o 1,10-fenantrolina; tuttavia, sono ancora necessari lavaggi intensivi per rimuovere l'enzima prima della placcatura dei batteri. Qui, la proteinasi K consente una rapida inattivazione della lisostafina. Abbiamo osservato che le cellule tendono a staccarsi dalla piastra di coltura quando diventano pesantemente infettate a causa della moltiplicazione di S. aureus intracellulare. Saltando la fase finale di lavaggio, il metodo iEPA ha notevolmente semplificato la gestione tecnica e ha permesso il recupero dei batteri interiorizzati in cellule vagamente aderenti o già staccate.

I reagenti e i tamponi più concentrati utilizzati in iEPA hanno anche contribuito a ridurre lo sforzo di pipettaggio e minimizzare la perdita di cellule. Inoltre, iEPA può essere utilizzato con celle in sospensione, nonché con organoidi difficili da lavare. In conclusione, i saggi di protezione enzimatica consentono lo studio dell'entità dell'internalizzazione e del destino intracellulare di S. aureus, nonché dell'attività intracellulare di farmaci antimicrobici con diversi modelli in vitro . Dovrebbero essere apportati miglioramenti per caratterizzare meglio la relazione tra internalizzazione e citotossicità per apprezzare meglio l'importanza di sviluppare farmaci in grado di raggiungere S. aureus all'interno della cellula.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	CORNING-FALCON	353047
A549 cell line	ATCC	CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6	Fluka	31048	Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin)	AMBI	LSPN-50	Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood	Biomerieux	43049	Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000	Biochrom Ltd.	80-3000-45	Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red	Sigma-Aldrich	D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red	Sigma-Aldrich	D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral dilute	Interscience	414000	Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum	Gibco	10270-106
HaCaT cell line	Cell lines service (CLS)	300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water	Fisher scientific	11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water	Invitrogen	P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000	Interscience	438000	Automatic colony counter
Sterile water	OTEC	600500
T-75 culture flask	CORNING-FALCON	353136
TC20 Automated cell counter	Biorad	1450102	Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0	Invitrogen	AM9855G	Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin - EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924	0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope	Nikon	Ti2