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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, presentiamo un protocollo efficace e riproducibile per isolare le popolazioni immunitarie del sistema respiratorio murino. Forniamo anche un metodo per l'identificazione di tutte le cellule immunitarie innate e adattative che risiedono nei polmoni di topi sani, utilizzando un pannello di citometria a flusso a 9 colori.

Abstract

Il tratto respiratorio è in contatto diretto con l'ambiente esterno e richiede un sistema immunitario regolato con precisione per fornire protezione sopprimendo le reazioni indesiderate agli antigeni ambientali. I polmoni ospitano diverse popolazioni di cellule immunitarie innate e adattative che forniscono sorveglianza immunitaria ma mediano anche le risposte immunitarie protettive. Queste cellule, che mantengono in equilibrio il sistema immunitario polmonare sano, partecipano anche a diverse condizioni patologiche come asma, infezioni, malattie autoimmuni e cancro. L'espressione selettiva delle proteine di superficie e intracellulari fornisce proprietà immunofenotipiche uniche alle cellule immunitarie del polmone. Di conseguenza, la citometria a flusso ha un ruolo strumentale nell'identificazione di tali popolazioni cellulari durante lo stato stazionario e le condizioni patologiche. Questo documento presenta un protocollo che descrive un metodo coerente e riproducibile per identificare le cellule immunitarie che risiedono nei polmoni di topi sani in condizioni di stato stazionario. Tuttavia, questo protocollo può anche essere utilizzato per identificare i cambiamenti in queste popolazioni cellulari in vari modelli di malattia per aiutare a identificare i cambiamenti specifici della malattia nel panorama immunitario polmonare.

Introduzione

Il tratto respiratorio murino contiene un sistema immunitario unico responsabile della lotta contro gli agenti patogeni e del mantenimento dell'omeostasi immunitaria. Il sistema immunitario polmonare è costituito da popolazioni cellulari con significativa eterogeneità nel loro fenotipo, funzione, origine e posizione. I macrofagi alveolari residenti (AM), originati principalmente da monociti fetali, risiedono nel lume alveolare1, mentre i macrofagi interstiziali derivati dal midollo osseo (IM) risiedono nel parenchima polmonare2. I MESSAGGI possono essere ulteriormente sottoclassificati dall'espressione di CD206. I DM CD206+ popolano l'area peribronchiale e perivascolare, mentre i DM CD206- si trovano all'interstizio alveolare3. Recentemente sono state proposte alcune sottoclassificazioni di IM3,4,5,6. Sebbene gli IM siano meno studiati degli AM, prove recenti supportano il loro ruolo cruciale nella regolazione del sistema immunitario del polmone7. Inoltre, CD206 è espresso anche in AM8 attivati alternativamente.

Le cellule dendritiche polmonari (DC) sono un altro gruppo eterogeneo di cellule immunitarie polmonari per quanto riguarda le loro proprietà funzionali, posizione e origine. Quattro sottocategorie di DC sono state descritte nel polmone: DC CD103+ convenzionali (note anche come cDC1), DC CD11b+ convenzionali (note anche come cDC2), DC derivate da monociti (MoDC) e DC plasmacitoidi9,10,11,12,13. Le prime tre sottoclassi possono essere definite come complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. I DC plasmacitoidi esprimono MHC II e sono intermediamente positivi per CD11c ma esprimono alti livelli di B220 e PDCA-19,13,16. Nei polmoni murini naïve, le DC CD103 e le DC CD11b si trovano nell'interstizio delle vie aeree, mentre le DC plasmacitoidi si trovano nell'interstizio alveolare17.

Due principali popolazioni di monociti risiedono nel polmone durante lo stato stazionario: monociti classici e monociti non classici. I monociti classici sono Ly6C+ e sono fondamentali per la risposta infiammatoria iniziale. Al contrario, i monociti non classici sono Ly6C- e sono stati ampiamente visti come cellule antinfiammatorie3,16,18. Recentemente, è stata descritta un'ulteriore popolazione di monociti CD64+CD16.2+, che provengono da monociti Ly6C- e danno origine a CD206+ IM3.

Gli eosinofili compaiono principalmente nei polmoni durante l'infezione da elminti o condizioni allergiche. Tuttavia, c'è un piccolo numero di eosinofili nel parenchima polmonare durante lo stato stazionario, noto come eosinofili residenti. In contrasto con gli eosinofili residenti, gli eosinofili infiammatori si trovano nell'interstizio polmonare e nel lavaggio broncoalveolare (BAL). Nei modelli murini di acaro della polvere domestica (HDM), gli eosinofili infiammatori vengono reclutati nel polmone dopo la stimolazione mediata dall'antigene. È stato proposto che gli eosinofili residenti potrebbero avere un ruolo regolatore nell'allergia inibendo la sensibilizzazione T helper 2 (Th2) a HDM19.

A differenza del resto delle cellule mieloidi polmonari, i neutrofili esprimono Ly6G ma non CD68 e sono caratterizzati da una firma dell'immunofenotipo CD68-Ly6G+16,20,21. Studi di visualizzazione hanno dimostrato che durante lo stato stazionario, il polmone riserva un pool di neutrofili nel compartimento intravascolare e ospita un numero considerevole di neutrofili extravascolari22. Simile agli eosinofili, i neutrofili non si trovano in BAL allo stato stazionario; tuttavia, diverse forme di stimolazione immunitaria, come la sfida LPS, l'asma o la polmonite, spingono i neutrofili nel lume alveolare, con conseguente presenza in BAL21,22,23.

Un numero considerevole di cellule CD45+ del polmone rappresentano cellule natural killer (NK), T e B e sono negative per la maggior parte dei marcatori mieloidi24. Nei polmoni di topi naïve, questi tre tipi di cellule possono essere identificati in base all'espressione di CD11b e MHC II18. Circa il 25% delle cellule CD45+ polmonari sono cellule B, mentre la percentuale di cellule NK è più alta nel polmone rispetto ad altri tessuti linfoidi e non linfoidi24,25,26. Tra le cellule T polmonari, una frazione considerevole è CD4-CD8- e svolge un ruolo importante nelle infezioni respiratorie26.

Poiché il polmone ospita un sistema immunitario molto complesso e unico, sono state sviluppate e riportate diverse strategie di gating per l'identificazione delle cellule immunitarie polmonari16,18,20,27. La strategia di gating qui descritta fornisce un modo completo e riproducibile per identificare fino a 12 diverse popolazioni immunitarie mieloidi polmonari e non mieloidi utilizzando 9 marcatori. Ulteriori marcatori sono stati utilizzati per convalidare i risultati. Inoltre, viene fornito un metodo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare che minimizza la morte cellulare e consente l'identificazione del profilo più completo del compartimento cellulare immunitario del polmone. Va notato che l'identificazione delle cellule non immunitarie del polmone, come le cellule epiteliali (CD45-CD326+CD31-), le cellule endoteliali (CD45-CD326-CD31+) e i fibroblasti richiede un approccio diverso28,29. L'identificazione di tali popolazioni non è inclusa nel protocollo e nel metodo qui descritti.

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Protocollo

Tutti gli studi e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati condotti secondo le linee guida secondo l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Beth Israel Deaconess Medical Center. Sei a dieci settimane di topi C57BL / 6 di entrambi i sessi sono stati utilizzati per sviluppare questo protocollo.

1. Escissione chirurgica e preparazione dei tessuti

  1. Eutanasia del topo iniettando per via intraperitoneale 1 mL di tribromoetanolo (preparato secondo il protocollo standard; Tabella dei materiali).
    NOTA: L'asfissia da CO2 deve essere evitata negli studi polmonari in quanto potrebbe causare lesioni polmonari e alterare le caratteristiche e le proprietà delle cellule immunitarie polmonari. Anche la lussazione cervicale dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe causare lesioni meccaniche del polmone.
  2. Trasferire il mouse in un'area pulita e dedicata per l'operazione chirurgica.
  3. Stabilizzare il lato dorsale del topo verso il basso usando aghi o nastro adesivo sulle quattro estremità. Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare la pelle dell'area ventrale.
  4. Eseguire un'incisione nella pelle, dal collo all'addome. Rimuovere con cura la pelle dalla zona toracica.
  5. Rimuovere con attenzione lo sterno e le costole.
  6. Lavare i polmoni iniettando 10 ml di PBS freddo direttamente nel ventricolo destro, usando un ago da 18-21 G, fino a quando i polmoni diventano completamente bianchi.
  7. Rimuovere con cura il timo e il cuore senza toccare i polmoni.
  8. Staccare delicatamente i polmoni dai tessuti circostanti e trasferirli in un tubo con tampone BSA freddo (Tabella 1).
    NOTA: Si dovrebbe fare uno sforzo per rimuovere tutto il grasso adiacente dai polmoni prima di preparare ulteriormente la sospensione unicellulare, in quanto ciò potrebbe influenzare le letture.

2. Preparazione della sospensione monocellulare

  1. Trasferire i polmoni in una capsula di Petri vuota e tritarli con due bisturi fini. Trasferire tutti i pezzi del polmone tritato in un nuovo tubo conico da 50 ml. Utilizzare 5 mL di tampone digestivo per lavare la piastra e aggiungerla al tubo da 50 mL contenente il polmone tritato (Tabella 1).
    NOTA: il tampone di digestione deve essere preparato immediatamente prima dell'uso. Utilizzare 5 mg/mL di collagenasi28. La combinazione di 1 o 5 mg di collagenasi con tampone BSA o PBS privo di proteine non ha migliorato i risultati (Figura supplementare S1).
  2. Fissare il coperchio del tubo e digerire il polmone per 30 minuti su uno shaker orbitale ad una velocità di 150 giri/min a 37 °C. Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml di tampone BSA freddo.
  3. Dopo la digestione, utilizzare un ago da 18 G per mescolare e sciogliere i pezzi polmonari. Posizionare un filtro da 70 μm nella parte superiore di un nuovo tubo conico da 50 ml.
    NOTA: l'uso di un filtro micron più piccolo potrebbe comportare la perdita delle principali popolazioni mieloidi.
  4. Trasferire lentamente la miscela polmonare digerita direttamente sul colino. Utilizzare il lato in gomma di uno stantuffo a siringa da 10 mL per distruggere i restanti pezzi polmonari sul filtro. Lavare il materiale lavorato sul filtro con tampone BSA.
  5. Centrifugare la sospensione monocellulare a 350 × g per 8 min a 4 °C.
  6. Scartare con attenzione il surnatante e risospese le cellule in 1 mL di tampone di lisi ACK. Mescolare bene usando un pipetto da 1 mL e incubare per 90 s a temperatura ambiente.
  7. Aggiungere 10 ml di tampone BSA freddo per fermare la reazione e centrifugare a 350 × g per 7 minuti a 4 °C.Scartare con cautela il surnatante e risospesciare il pellet in Staining Buffer per contare le cellule usando un emocitometro.
  8. Risospese le cellule ad una concentrazione di 5 × 106 cellule/mL e utilizzarle per la colorazione superficiale (vedere paragrafo 3).
    NOTA: A tale scopo, placcare le cellule in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti seguita da colorazione anticorpale e lavaggi. Se non è disponibile una centrifuga a piastre, utilizzare tubi di flusso anziché piastre. Con questo protocollo, ~ 15-20 × 106 cellule per polmone possono essere ottenute da un topo C57BL / 6 di 6-10 settimane di dimensioni medie.

3. Colorazione degli anticorpi superficiali

  1. Trasferire 1 × 106 celle in 200 μL per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 350 × g per 7 min a 4 °C. Nel frattempo, preparare la soluzione fc-block diluendo l'anticorpo anti-16/32 (1:100) nel tampone di colorazione (Tabella 1).
  2. Risospescere le cellule in 50 μL della soluzione pre-preparata di Blocco Fc (Tabella dei Materiali) e incubare per 15-20 min a 4 °C o su ghiaccio.
  3. Aggiungere 150 μL di tampone colorante e centrifugare la piastra a 350 × g per 5 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare il cocktail di anticorpi di superficie diluendo gli anticorpi di superficie (1:100; Tabella 2) nel tampone di colorazione.
    NOTA: (i) L'anticorpo anti-16/32 per il blocco della Fc può essere utilizzato con gli anticorpi di superficie nella stessa miscela. (ii) Se si utilizza un colorante di vitalità fissabile, aggiungerlo al cocktail di anticorpi superficiali ad una diluizione di 1:1.000.
  4. Risospesere le cellule in 50 μL del cocktail anticorpale di superficie pre-preparato e incubare per 30-40 minuti a 4 °C al buio. Lavare le cellule con tampone colorante due volte.
    NOTA: Se non è richiesta alcuna colorazione intracellulare, risospesare le cellule in 200 μL di tampone colorante e procedere direttamente all'acquisizione dei dati sul citometro a flusso. In alternativa, le celle potrebbero essere fissate e conservate a 4 °C per l'acquisizione successiva. Si consiglia di utilizzare le cellule per la citometria a flusso entro 24 ore.

4. Fissazione cellulare e colorazione intracellulare

  1. Preparare il tampone di fissazione/permeabilizzazione (Fix/Perm Buffer) mescolando tre parti di concentrato di fissazione/permeabilizzazione e 1 parte di diluente di fissazione/permeabilizzazione del set di buffer di colorazione FoxP3/Transcription Factor (Tabella 1).
  2. Risospesare le cellule in 50 μL del Fix/Perm Buffer pre-preparato per pozzetto della piastra a 96 pozzetti, dove le cellule sono state placcate come descritto nella sezione 3, e incubarle per 20-25 min a 4 °C al buio.
  3. Diluire il tampone di permeabilizzazione 10x come 1: 10 in acqua deionizzata purificata per preparare 1x tampone di permeabilizzazione.
  4. Lavare le cellule una volta con 1x tampone di permeabilizzazione. Nel frattempo, preparare il cocktail di anticorpi intracellulari diluendo gli anticorpi intracellulari (1:100) in 1 mL di tampone di permeabilizzazione.
  5. Risospese le cellule utilizzando 50 μL del cocktail di anticorpi di superficie pre-preparato per cellula della piastra a 96 pozzetti e incubare per 40 minuti a 4 °C al buio.
  6. Lavare le cellule una volta con tampone di permeabilizzazione e una volta con tampone di colorazione. Dopo il lavaggio finale, risospesere le cellule in 200 μL di tampone colorante.
    NOTA: Se non è disponibile alcun citometro a flusso con lettore di piastre, trasferire le cellule in provette citometriche a flusso.
  7. Acquisire un minimo di 1,5 × 106 cellule per campione sul citometro a flusso.
    NOTA: per i campioni di controllo a colori singoli e non macchiati, saranno sufficienti 0,5-1 × 106 celle per campione. Si raccomanda di titolare i singoli anticorpi utilizzati per ottenere una colorazione ottimale e ridurre i costi. Il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando Fix/Perm Buffer preparato utilizzando il set di buffer di colorazione FoxP3. Poiché CD68 è un marcatore citoplasmatico e non nucleare, potrebbero essere sufficienti altre soluzioni di permeabilizzazione come una bassa concentrazione di paraformaldeide o kit di citofisso / citoperma di vari fornitori.

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Risultati

Strategia di Gating
Il primo passo della nostra strategia di gating è l'esclusione dei detriti e dei doppietti (Figura 1A). Un'attenta esclusione dei doppietti è fondamentale per evitare popolazioni di falsi positivi (Figura supplementare S2). Quindi, le cellule immunitarie vengono identificate utilizzando CD45+, un marcatore per le cellule ematopoietiche (Figura 1B). La macchia morta può essere aggiunta per esc...

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Discussione

L'identificazione delle cellule immunitarie polmonari può essere difficile a causa dei molteplici tipi di cellule immunitarie che risiedono nel polmone e delle loro caratteristiche immunofenotipiche uniche rispetto alle loro controparti che risiedono in altri tessuti. In diverse condizioni patologiche, le cellule con caratteristiche fenotipiche distinte appaiono nei polmoni. Ad esempio, la lesione polmonare indotta dalla bleomicina provoca il reclutamento di macrofagi derivati da monociti circolanti nello spazio alveola...

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Divulgazioni

V.A.B. ha brevetti sul percorso PD-1 concessi in licenza da Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis e Dako. Gli autori non dichiarano altri interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01CA238263 e R01CA229784 (VAB).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL syringe plungerEXELINT26265
18 G needlesBD Precision Glide Needle305165
21 G needlesBD Precision Glide Needle305195
50 mL conical tubesFalcon3520
70 μm cell strainerThermoFisher22363548
96-well platesFalcon/corning3799
ACK Lysing BufferThermoFisherA10492-01
anti-mouse CD11bBiolegend101215For details see Table 2
anti-mouse CD11cBiolegend117339 / 117337For details see Table 2
anti-mouse CD45Biolegend103115For details see Table 2
anti-mouse CD64Biolegend139319For details see Table 2
anti-mouse CD68Biolegend137009For details see Table 2
anti-mouse GR-1Biolegend108433For details see Table 2
anti-mouse Siglec FBiolegend155503For details see Table 2
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419For details see Table 2
CD24Biolegend138503For details see Table 2
CD3Biolegend100205For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005For details see Table 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
Ethanol
F4/80Biolegend123133For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301For details see Table 2
Fetal Bovine SerumR&D Systems
Fine Serrated ForcepsRoboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermoFisher00-5523-00
Futura Safety ScalpelMerit Medical SystemsSMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain KitThermoFisherL34973For details see Table 2
MERTKBiolegend151505For details see Table 2
MHC-IIBiolegend107621For details see Table 2
NK1.1Biolegend108705For details see Table 2
Orbital ShakerVWRModel 200
Petri dishFalcon351029
Refrigerated benchtop centrifugeSORVAL ST 16R
Small curved scissorRoboz Surgical Instrument Co

Riferimenti

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