Produzione su scala libera da cellule e aggiunta adiuvante a una proteina principale ricombinante della membrana esterna da Chlamydia muridarum per lo sviluppo di vaccini

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di kit di espressione proteica commerciali privi di cellule per produrre proteine di membrana supportate in nanodischi che possono essere utilizzate come antigeni nei vaccini a subunità.

Abstract

I vaccini a subunità offrono vantaggi rispetto ai più tradizionali vaccini inattivati o attenuati derivati da cellule intere in termini di sicurezza, stabilità e produzione standard. Per ottenere un vaccino a subunità efficace basato su proteine, l'antigene proteico deve spesso adottare una conformazione nativa. Ciò è particolarmente importante per gli antigeni di superficie patogeni che sono proteine legate alla membrana. I metodi privi di cellule sono stati utilizzati con successo per produrre proteine funzionali di membrana correttamente ripiegate attraverso la co-traduzione di particelle di nanolipoproteine (NLP), comunemente note come nanodischi.

Questa strategia può essere utilizzata per produrre vaccini a subunità costituiti da proteine di membrana in un ambiente legato ai lipidi. Tuttavia, la produzione di proteine prive di cellule è spesso limitata a piccola scala (<1 ml). La quantità di proteine prodotte in cicli di produzione su piccola scala è solitamente sufficiente per studi biochimici e biofisici. Tuttavia, il processo privo di cellule deve essere scalato, ottimizzato e attentamente testato per ottenere abbastanza proteine per gli studi sui vaccini in modelli animali. Altri processi coinvolti nella produzione di vaccini, come la purificazione, l'aggiunta di adiuvanti e la liofilizzazione, devono essere ottimizzati in parallelo. Questo articolo riporta lo sviluppo di un protocollo scalato per esprimere, purificare e formulare un vaccino a subunità proteica legata alla membrana.

Le reazioni libere da cellule su larga scala richiedono l'ottimizzazione delle concentrazioni e dei rapporti plasmidi quando si utilizzano più vettori di espressione plasmidica, selezione lipidica e aggiunta adiuvante per la produzione ad alto livello di particelle nanolipoproteiche formulate. Il metodo è dimostrato qui con l'espressione di una proteina maggiore della membrana esterna della clamidia (MOMP), ma può essere ampiamente applicato ad altri antigeni proteici di membrana. L'efficacia dell'antigene può essere valutata in vivo attraverso studi di immunizzazione per misurare la produzione di anticorpi, come dimostrato qui.

Introduzione

I lisati procariotici o eucariotici per l'espressione di proteine libere da cellule sono prontamente disponibili come prodotti commerciali per sintetizzare proteine di interesse (per una revisione completa, vedi ¹). Questi sistemi di espressione sono disponibili su varie scale e utilizzano lisati da vari organismi, tra cui E. coli, piante di tabacco e colture di mammiferi. I lisati privi di cellule offrono molteplici vantaggi rispetto ai tradizionali approcci di produzione di proteine ricombinanti, tra cui la facilità d'uso e la produzione di proteine robusta e rapida. Mentre questi approcci sono utilizzati principalmente per produrre proteine solubili, questo gruppo ha aperto la strada a un approccio per il loro uso per esprimere proteine di membrana.

Questo nuovo approccio apporta modifiche minori ai sistemi di espressione libera cellulare esistenti includendo il DNA che codifica due prodotti proteici per l'espressione, un'apolipoproteina e la proteina di membrana di interesse. L'apolipoproteina espressa (derivati di ApoA1 o ApoE4) interagisce con i lipidi aggiunti al lisato privo di cellule per assemblare spontaneamente (~20 nm) PNL. Quando co-tradotto con una proteina di membrana di interesse, la PNL e la proteina di membrana formano un complesso di nanoparticelle solubili in cui la proteina di membrana è incorporata all'interno del doppio strato lipidico della PNL. Pertanto, la proteina di membrana è più accessibile per le applicazioni a valle, poiché è contenuta all'interno di particelle solubili e discrete. Questo approccio può produrre complessi proteici oligomerici funzionali all'interno del^{bistrato 2} della PNL e può produrre la componente antigenica di un vaccino a subunità, che viene successivamente miscelato con adiuvanti lipofili per formare un vaccino a nanoparticelle con antigene colocalizzato e adiuvante adatto per la valutazione in vivo .

Questo metodo corrente viene modificato da^{un protocollo 3} pubblicato in precedenza. Le modifiche chiave sono focalizzate sullo scale-up della reazione cellula-libera e sulla successiva purificazione del complesso proteina-PNL. Un'ulteriore modifica include l'aggiunta di un polimero anfifilico noto come telodendrimer, che viene prima miscelato con i lipidi prima di essere aggiunto alla reazione cellula-free. La co-traduzione dei plasmidi in presenza del telodendrimero e dei lipidi produce una PNL telodendrimero (tNLP). L'aggiunta del telodendrimero aiuta anche a modulare le dimensioni e la monodispersività delle nanoparticelle tNLP risultanti⁴. Questo protocollo è specificamente ottimizzato per studi su larga scala su vaccini per produrre una proteina antigene subunità legata alla membrana, la clamidia MOMP ^5,6. Il metodo produce MOMP ricombinante associato a tNLP per formare un complesso MOMP-tNLP altamente solubile che mantiene l'oligomerizzazione MOMP. Una tipica produzione scale-up di 3 ml produce >1,5 mg di MOMP purificato. Il MOMP-tNLP prodotto senza cellule è suscettibile di aggiunta rapida adiuvante per test di immunogenicità in vivo.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti presso l'Università della California, Irvine, in strutture garantite dal servizio sanitario pubblico (PHS) in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

1. Preparazione della vetreria

NOTA: Tutti i materiali utilizzati nella produzione di formulazioni vaccinali per animali sono privi di endotossine.

1. Per distruggere l'endotossina contaminante, cuocere bicchieri puliti che manterranno i tamponi in un forno a 180 ° C per 4 ore.

2. Preparazione del buffer

1. Preparare 250 mL dei tamponi di purificazione di affinità Ni elencati nella Tabella 1. Conservarli a 4 °C per un massimo di 6 mesi.

3. Preparazione della reazione

1. Pesare 20 mg di 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL priva di endotossine. Scioglierlo in 1 mL di acqua priva di endotossine, sondare la sonda almeno quattro volte a 6 A per 1 minuto, con pause di 1 minuto in mezzo, fino a quando non è chiaro. Rimuovere qualsiasi metallo contaminante dalla sonda mediante centrifugazione a 13.000 × g per 2 minuti a 22 °C e quindi trasferire il lipide solubilizzato in una nuova provetta priva di endotossine da 1,5 ml.
2. Pesare 1 mg di telodendrimero PEG5k-CA8 in un tubo privo di endotossine da 1,5 ml. Sciogliere in acqua priva di endotossine fino ad una concentrazione di 20 mg/ml. Vortice fino a completa dissoluzione e diluire a 2 mg/ml.
3. In una nuova provetta priva di endotossine, combinare 210 μL di soluzione DMPC da 20 mg/mL con 210 μL di soluzione di telodendrimero da 2 mg/ml.

4. Produzione cell-free di MOMP-tNLPs per formulazioni di vaccini a subunità

1. Preparare MOMP-tNLP utilizzando metodi cell-free modificati da^{un protocollo 5} precedentemente pubblicato.
   1. Due ore prima di impostare la reazione cell-free, aprire il kit di espressione proteica libera da cellule procariotiche e scongelare uno dei tamponi di ricostituzione. Una volta scongelato, aggiungere una compressa di cocktail inibitore della proteasi privo di EDTA e lasciare sciogliere completamente.
2. Seguire questo protocollo utilizzando un kit progettato per eseguire reazioni 5 x 1 ml.
   NOTA: una tipica produzione scale-up è di 3 x 1 ml.
   1. Per ogni reazione da 1 ml, aggiungere 525 μL di tampone di ricostituzione al flacone di lisato di E. coli e rotolare delicatamente fino a sciogliere. Aggiungere 250 μL di tampone di ricostituzione al flacone contenente additivi di reazione (ad es. ATP, GTP) e rotolare delicatamente fino a sciogliere.
   2. Aggiungere 8,1 mL di tampone di ricostituzione al flacone di alimentazione di reazione, ricapitolare con un tappo di gomma (fare attenzione a non toccare l'interno del tappo di gomma) e capovolgere/arrotolare delicatamente per sciogliere.
   3. Aggiungere 3 ml di tampone di ricostituzione al flacone della miscela di aminoacidi, ricapitolare con un tappo di gomma e capovolgere/arrotolare delicatamente per sciogliere.
      NOTA: Fare attenzione a non toccare l'interno del tappo di gomma in quanto ciò può causare contaminazione.
   4. Aggiungere 1,8 ml di tampone di ricostituzione al flacone di metionina, rotolare delicatamente per sciogliere e quindi conservare su ghiaccio fino all'uso.
3. Preparare la soluzione di reazione.
   1. Al flacone di lisato di E. coli , aggiungere 225 μL di miscela di reazione ricostituita, 270 μL di miscela di aminoacidi ricostituita senza metionina e 30 μL di metionina ricostituita. Inoltre, aggiungere 400 μL della miscela DMPC/telodendrimero, 15 μg di plasmide MOMP e 0,6 μg di plasmide Δ49ApoA1. Arrotolare/agitare delicatamente per mescolare.
      NOTA: Assicurarsi che entrambi i plasmidi siano costruiti dalla stessa spina dorsale plasmidica. Non vortice.
   2. Prelevare 20 μL della soluzione totale e metterla da parte in una provetta da 1,5 mL per la reazione di controllo che esprime la GFP (vedere sotto).
4. Preparare la soluzione di alimentazione. Al flacone della miscela di mangime, aggiungere 2,65 ml di miscela di aminoacidi ricostituita senza metionina e 300 μL di metionina ricostituita. Arrotolare/agitare delicatamente per sciogliere.
   NOTA: In questo momento, il tampone di ricostituzione non utilizzato e la metionina possono essere restituiti al congelatore per la conservazione.
5. Trasferire 1 mL della soluzione di reazione nella camera di reazione interna fornita nel kit di reazione cell-free e sigillare quando riempito. Trasferire 10 mL della soluzione di alimentazione nella camera esterna del recipiente di reazione e sigillare.
   NOTA: Non riempire eccessivamente le camere! La presenza di bolle d'aria nella parte superiore sia della camera di reazione interna che della camera di alimentazione interna influenzerà negativamente la reazione. Qualsiasi soluzione di reazione rimanente può essere collocata in un tubo da 1,5 ml e lasciata miscelare insieme al recipiente principale.
6. Aggiungere 0,5 μL del plasmide di controllo GFP (0,5 mg/ml) alla miscela di reazione da 20 μL precedentemente aliquotata.
   NOTA: Molti kit sono forniti con un plasmide di controllo per scopi di controllo qualità. La maggior parte dei plasmidi che esprimono GFP con un promotore T7 e un sito di legame del ribosoma E.coli (RBS) possono anche essere utilizzati come plasmide di controllo.
7. Porre la reazione in uno shaker a 300 giri/min, 30 °C per un massimo di 18 ore. Per verificare che la reazione abbia avuto successo, utilizzare una sorgente di luce UV per verificare la fluorescenza dovuta alla sintesi della GFP di controllo (Figura 1A) dopo appena 15 minuti di incubazione.
   NOTA: Queste condizioni, in particolare la temperatura, potrebbero dover essere ottimizzate per l'espressione di altre proteine di membrana.

5. Purificazione MOMP-tNLP

1. Utilizzare la cromatografia di affinità di nichel immobilizzata per purificare il complesso di nanoparticelle MOMP-tNLP dalla miscela di reazione priva di cellule usando il tag His-sulla proteina Δ49ApoA1.
   1. Trasferire 1 mL di un impasto al 50% di His-Tag Purification Resin in una colonna cromatografica monouso da 10 mL ed equilibrarlo con 3 mL di tampone legante.
   2. Lasciare scaricare il tampone, tappare l'uscita e aggiungere 250 μL di tampone legante alla resina.
   3. Prima di aggiungere la reazione cell-free alla colonna, risparmiare 20 μL per un'analisi successiva tramite SDS-PAGE. Mescolare la reazione cell-free con la resina equilibrata e incubarla su un bilanciere da laboratorio a 4 °C per 1 ora.
2. Aprire la colonna, lavare il tappo con 500 μL di tampone legante aggiuntivo e aggiungere questo liquido al resto della colonna.
3. Raccogliere il flusso di liquido dalla colonna per un'analisi successiva tramite SDS-PAGE.
4. Lavare la colonna con 1 mL di tampone di lavaggio contenente 20 mM di imidazolo sei volte e raccogliere le frazioni. Fare attenzione a non lasciare asciugare la resina tra un lavaggio e l'altro. Al secondo lavaggio, agitare vigorosamente la resina pipettando su e giù usando una pipetta da 1 ml.
5. Eluire i MOMP-tNLPs in sei frazioni da 300 μL di Elution buffer 1 (contenente 250 mM di imidazolo), seguita da un'eluizione finale con 300 μL di Elution buffer 2 (contenente 500 mM di imidazolo). Alla seconda eluizione, agitare vigorosamente la resina pipettando su e giù usando una pipetta da 1 ml.

6. Analisi tramite SDS-PAGE

NOTA: Tutte le frazioni di eluizione devono essere analizzate da SDS-PAGE per verificare la quantità e la purezza della proteina di interesse.

1. Caricare 1 μL ciascuno del lisato totale e del flusso e quindi 5 μL per tutti i lavaggi raccolti e le frazioni di eluizione.
   1. Mescolare aliquote dei MOMP-tNLP eluiti, lavaggi, flow-through e lisato totale con 4 buffer di caricamento del campione SDS-PAGE. Miscelare e denaturare a caldo i campioni con un agente riducente del campione 10x, salvo diversa indicazione.
   2. Analizzare le frazioni mediante elettroforesi su gel utilizzando gel Bis-Tris SDS-PAGE da 1,0 mm, dal 4 al 12%, con 1x tampone MES-SDS, insieme a uno standard di peso molecolare appropriato. Eseguire i gel per 35 minuti a 200 V.
2. Macchiare i gel secondo le istruzioni del produttore.
   1. Rimuovere il gel dalla cassetta e metterlo in 60 ml di colorazione di gel. Microonde il gel nella macchia di gel per 30 secondi e cullare delicatamente il contenitore per 30 s per distribuire uniformemente il calore. Microonde il gel nella macchia a 80-85 ° C per altri 30 s e posizionare il gel su uno shaker orbitale a roccia per 5 minuti.
   2. Microonde il gel una terza volta per 30 s, quindi tornare allo shaker orbitale per oscillare per altri 23 minuti.
   3. Trasferire il gel in un contenitore pulito e lavare in 100 ml di soluzione di lavaggio (10% metanolo, 7% acido acetico) per 30 minuti.
      NOTA: Questo è un passaggio critico in quanto è essenziale evitare di riscaldare la soluzione di lavaggio. In caso contrario, si possono verificare colorazioni di sfondo e irregolarità nell'immagine finale del gel.
   4. Dopo il lavaggio, sciacquare il gel in acqua ultrapura due volte per 5 minuti ciascuna.
   5. Immagina i gel usando un gel imager a 600 nm (Figura 2). Utilizzare SDS-PAGE per quantificare la quantità di singola proteina nella soluzione di nanoparticelle se esiste uno standard proteico per il confronto.
      NOTA: In questo esempio, le diluizioni seriali di MOMP espresse in modo ricombinante sono risolte da SDS-PAGE e le densità delle bande sono quantificate utilizzando il software dello strumento.
   6. Generare una curva standard utilizzando le densità delle bande MOMP. Risolvere i campioni MOMP-tNLP sullo stesso gel SDS-PAGE e calcolare la componente MOMP delle particelle utilizzando la curva standard MOMP (Figura 3).

7. Western e dot blot e archiviazione

1. Per il western blotting, risolvere i campioni tramite SDS-PAGE e trasferire i gel utilizzando un sistema commerciale di dry blotting con impostazioni standard in base al protocollo del produttore.
   1. Rimuovere le macchie dalla pila al termine del trasferimento e incubare ciascuna macchia per una notte a 4 °C in un tampone bloccante adatto contenente 0,2% Tween 20 e 0,5 mg/mL MAb40 o 0,2 mg/mL MAbHIS anti-His-tag anticorpo diretto contro l'His-tag della proteina Δ49ApoA1.
      NOTA: Le diluizioni anticorpali utilizzate per il blotting sono 1:1.000 per MAb40 e 1:500–1.000 per l'anticorpo MAbHIS.
   2. Lavare ogni tampone 3 volte per 5 minuti con PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Incubare le macchie per 1 ora in tampone bloccante contenente anticorpi secondari coniugati a un fluoroforo (ad esempio, IRDye) ad una diluizione 1:10.000.
   4. Rilavare le macchie 3 volte per 5 minuti con PBS-T. Utilizzare un imager a fluorescenza per visualizzare le macchie dopo il lavaggio finale.
2. Per i dot blots, tamponare 3 μg di MOMP-tNLP purificato e svuotare il tNLP usando un apparecchio dot blot. Bloccare e sviluppare le macchie utilizzando gli stessi metodi descritti sopra per il western blotting.

8. Valutazione delle endotossine

1. Quantificare i livelli di endotossina utilizzando un sistema di test delle endotossine basato sul test Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Preparare 25 mM Tris senza endotossine, pH 7,4, tampone campione utilizzando una soluzione di cloridrato 1 M Tris e acqua priva di endotossine.
   NOTA: in genere, i campioni devono essere diluiti utilizzando questo tampone di campionamento e le diluizioni regolate per trovare l'intervallo adatto per i singoli campioni. Qui, i campioni MOMP-tNLP vengono diluiti 500 volte nel tampone del campione e 25 μL vengono caricati in ciascun pozzetto di una cartuccia del dispositivo con sensibilità di 0,05 EU/mL. I livelli di endotossina di MOMP-tNLP e tNLP vuoto utilizzati negli studi sui topi descritti di seguito sono compresi tra 0,4 e 12 EU/μg di proteine a seconda del campione.

9. Liofilizzazione

1. Liofilizzare e conservare le nanoparticelle MOMP-tNLP per un uso a lungo termine (fino ad anni) a -20 °C. Per preparare le sospensioni di tNLP e MOMP-tNLP per la liofilizzazione, aggiungere trealosio come protettivo durante il processo di congelamento e liofilizzazione.
   NOTA: Questo processo è stato ampiamente convalidato per una varietà di formulazioni tNLP ^7,8.
2. Dividere il volume corrente della soluzione MOMP-tNLP per 9 per ottenere il volume di 1 M di trealosio in acqua deionizzata sterile, priva di endotossine, necessaria per raggiungere una concentrazione finale di 0,1 M di trealosio. Annotare il volume finale e l'aliquota in provette di polipropilene da 15 mL o 50 mL prive di endotossine come desiderato.
3. Congelare la soluzione mista su ghiaccio secco e liofilizzarla durante la notte usando un liofilizzatore. Conservare le formulazioni essiccate a -20 °C fino al momento del bisogno.
4. Ricostituire tNLP liofilizzati utilizzando acqua priva di endotossine. Arrotolare delicatamente fino a quando la torta liofilizzata è completamente sciolta e reidratata. Per rimuovere il trealosio, dializzare la soluzione contro PBS utilizzando una membrana di dialisi cutoff 3,5 kDa.

10. Aggiunta coadiuvante

NOTA: Queste e altre formulazioni di vaccini simili basate su sub-unità di PNL possono facilmente incorporare adiuvanti lipofili come CpG-ODN1826 e FSL-1. CpG-ODN1826 è un oligonucleotide CpG modificato di classe B (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') con una dorsale fosforotioata completa caratterizzata da una porzione di colesterolo 5' (5'-chol-C6). La coniugazione di CpG-ODN1826 a tNLPs è mediata dalle interazioni idrofobiche tra la porzione di colesterolo e il doppio strato fosfolipidico del tNLP ed è stata dimostrata e ben caratterizzata, come precedentemente riportato ^9,10.

1. Prima di incorporarla in queste formulazioni, purificare il CpG modificato con colesterolo mediante cromatografia a fase inversa per rimuovere l'endotossina contaminante e qualsiasi molecola di CpG non modificata.
   1. Dopo aver ricevuto dal fornitore, reidratare il materiale CpG liofilizzato in acqua priva di endotossine e purificarlo su una colonna preparativa C4 RP-HPLC utilizzando un gradiente di separazione costituito da 10 mM di acetato di trietilammonio (TEAA) (fase mobile A) e acetonitrile (fase mobile B).
      NOTA: ulteriori dettagli sono disponibili nella Tabella 2.
   2. Pool e liofilizzare le frazioni contenenti CpG modificato dal colesterolo. Per garantire la completa rimozione del TEAA residuo, ricostituire il CpG con 15 ml di acqua priva di endotossine e ri-liofilizzarlo tre volte.
   3. Dopo la liofilizzazione finale, ricostituire il CpG in acqua priva di endotossine (concentrazione finale di CpG >20 mg/mL), aliquota, e conservarlo a -80 °C fino al momento del bisogno. Oltre alle formulazioni, diluire il CpG a una concentrazione di 1-2,5 mg / ml.
      NOTA: FSL-1 è disponibile come polvere liofilizzata di grado vaccino. Questo viene ricostituito utilizzando acqua sterile e priva di endotossine ad una concentrazione di 1 mg/ml. Il vaccino viene somministrato per via intramuscolare (i.m.), con ogni dose contenente 10 μg di MOMP in un volume totale di 50 μL.
2. Per ottenere la dose di formulazione desiderata, dializzare le nanoparticelle in PBS e concentrarle utilizzando un concentratore di vuoto centrifugo prima dell'aggiunta adiuvante. Quando si esegue questa operazione, prestare attenzione per evitare la completa essiccazione del campione: controllare il volume del campione ogni 20-30 minuti durante la centrifugazione.
3. Aggiungere l'adiuvante in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza. Per valutare il successo dell'incorporazione, analizzare le formulazioni finali e i loro componenti mediante cromatografia analitica ad esclusione dimensionale (SEC).
   NOTA: Per questi preparati, è stata utilizzata una colonna SEC nel buffer PBS (0,5 mL/m di portata) e l'eluizione è stata rilevata utilizzando un rivelatore a diodi UV-vis. L'incorporazione è stata valutata confrontando l'assorbimento delle particelle adiuvate con quello delle particelle non adiuvate a 214 e 280 nm.
4. Conservare il MOMP-tNLP adiuvato e il tNLP vuoto a 4 °C prima dell'uso animale per un periodo massimo di 14 giorni. Per valutare appieno la stabilità di una nuova formulazione di tNLP, analizzare periodicamente i tNLP memorizzati da SEC.
   NOTA: la stabilità varia da formulazione a formulazione.

11. Test del siero

1. Ottenere topi femmina di 3 settimane (BALB/c, n = 6).
2. Vaccinare i topi per via intramuscolare (i.m.) in ciascun arto posteriore con 10 μg di MOMP sotto forma di MOMP-tNLP adiuvato con 5 μg di CpG e 1 μg di FSL-1 (volume totale per iniezione = 50 ml).
3. Dopo la vaccinazione, osservare i topi fino a quando non sono in grado di mantenere la recumenza sternale.
4. Quattro settimane dopo la vaccinazione iniziale (prime), vaccinare gli animali una seconda volta (boost) con 10 μg di MOMP sotto forma di MOMP-tNLP adiuvato con 5 μg di CpG e 1 μg di FSL-1 (volume totale per iniezione = 50 ml).
5. Il giorno 56 dopo la vaccinazione iniziale, raccogliere il sangue per valutare i titoli anticorpali. Iniziare anestetizzando i topi iniettando una soluzione i.p. di xilazina (0,3 mg/20 g di peso corporeo) e ketamina (3,0 mg/20 g di peso corporeo). Pizzicare le zampe anteriori e posteriori per assicurarsi che non si verifichino strappi. Applicare vaselina intorno agli occhi per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia.
6. Utilizzando un tubo capillare micro-ematocrito, perforare il plesso retro-orbitale. Raccogliere 100 ml di sangue in una provetta da microcentrifuga.
7. Dopo la raccolta del sangue, osservare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia e possono mantenere la recumenza sternale.
8. Lasciare coagulare il sangue a temperatura ambiente per 30 minuti e poi girare a 2.000 × g per 10 minuti. Raccogliere il siero e congelare a -80 °C.
9. In questo momento, sfida gli animali con Chlamydia muridarum o eutanasi. Eutanasia dei topi iniettando prima una soluzione i.p. di xilazina (0,3 mg/20 g di peso corporeo) e ketamina (3,0 mg/20 g di peso corporeo) seguita da lussazione cervicale.
10. Testare gli anticorpi sierici specifici per MOMP utilizzando tecniche di western blotting come descritto sopra. Tutti i topi immunizzati sono sieri, utilizzare il siero aggregato al posto di un anticorpo primario alla diluizione di 1:5.000.

Risultati

Il profilo SDS-PAGE della purificazione di affinità Ni di MOMP-tNLP da una reazione libera da cellule da 1 mL è mostrato in Figura 1B. La reazione ha determinato alti livelli di espressione sia per la MOMP che per la proteina Δ49ApoA1. Risultati precedenti hanno mostrato che l'espressione libera da cellule di Δ49ApoA1 in presenza di DMPC e telodendrimero ha determinato la formazione di particelle nanolipoproteiche di telodendrimero (tNLPs)⁴. La co-eluizione di MOMP con Δ49ApoA1 ha indicato che MOMP è associato a tNLPs, poiché il tag His-è presente solo sullo scaffold tNLP Δ49ApoA1 e non su MOMP. La MOMP è una proteina altamente insolubile che può essere eluita solo attraverso la complessazione con tNLP, che hanno dimostrato di facilitare la solubilizzazione delle proteine di membrana.

Le frazioni di eluizione contenenti MOMP-tNLP sono state raggruppate e la concentrazione totale di proteine determinata utilizzando un dispositivo di quantificazione basato sulla fluorescenza o un dispositivo che misura la concentrazione attraverso l'assorbanza a 280 nm, seguendo le istruzioni del produttore per la quantificazione delle proteine. Per consentire un dosaggio preciso del vaccino MOMP, è anche importante determinare la concentrazione di MOMP nei complessi purificati. Abbiamo sviluppato un metodo per quantificare la MOMP basata sulla densitometria su gel (Figura 2) in cui è stato utilizzato come standard un MOMP ricombinante purificato con concentrazione nota. Stabilendo la curva standard e confrontandola con il campione MOMP-tNLP, la concentrazione di MOMP può essere quantificata con precisione. La determinazione della concentrazione di MOMP nel campione purificato ha permesso di stimare la resa di MOMP nelle reazioni prive di cellule a varie scale, che è importante per pianificare la configurazione della reazione appropriata agli studi a valle (Tabella 3).

MOMP ha bisogno di formare oligomeri per suscitare una robusta risposta immunitaria¹¹. Per testare lo stato oligomerico di MOMP, MOMP-tNLP è stato analizzato in presenza e assenza sia di calore che dell'agente riducente ditiotreitolo (DTT, 50 mM, Figura 3A). Gli oligomeri di ordine superiore di MOMP sono stati identificati attraverso SDS-PAGE quando i campioni non sono stati trattati con calore e DTT. In confronto, i campioni trattati con calore in presenza di DTT hanno mostrato principalmente due bande distinte sul gel, corrispondenti a MOMP e Δ49ApoA1 (circa 40 kDa e 22 kDa, rispettivamente). Questi risultati assomigliano molto al modello di bande di gel attribuito alla formazione di oligomeri di MOMP, che è fondamentale per la sua efficacia.

Un'ulteriore analisi del western blot utilizzando MAb40, un anticorpo contro l'epitopo lineare sul dominio variabile della proteina MOMP, ha mostrato un modello di banding simile, confermando la formazione dell'oligomero da parte della proteina MOMP nel suo stato non denaturato (Figura 3B). Un fattore importante che influenza la formazione di oligomeri MOMP è il rapporto tra il plasmide MOMP e il plasmide Δ49ApoA1 durante la configurazione della reazione cell-free. La Tabella 4 elenca il rapporto tra plasmidi e il conseguente tasso di inserimento di MOMP nei tNLP. Studi precedenti hanno indicato che la clamidia MOMP e altre proteine della membrana esterna possono esistere principalmente come trimeri¹². Per massimizzare la formazione del trimero nella reazione cellula-free, è auspicabile avere il tasso di inserzione vicino a tre proteine MOMP per PNL, che corrisponde a un rapporto plasmidico ~25:1 MOMP-to-Δ49ApoA1.

Un test dot blot è stato utilizzato come metodo più snello per rilevare la presenza di MOMP e tNLP. L'anticorpo MAb40 è stato utilizzato per rilevare la MOMP totale. L'anticorpo MAbHIS mirato al tag His-sullo scaffold Δ49ApoA1 del tNLP è stato utilizzato per valutare la presenza di tNLP. La co-segnalazione degli anticorpi MAb40 e MAbHIS ha indicato la formazione di MOMP-tNLP. La reazione di controllo ha prodotto tNLP vuoto, che ha mostrato solo un segnale positivo da MAbHIS (Figura 3C). Per testare l'immunogenicità dei MOMP-tNLP prodotti nella reazione libera da cellule, abbiamo adiuvato MOMP-tNLP con CpG + FSL-1 e iniettato per via intramuscolare (i.m.) nei topi in un regime prime-boost come descritto sopra. I sieri sono stati raccolti dai topi immunizzati e l'anticorpo IgG specifico MOMP è stato misurato utilizzando un saggio western blot (Figura 4). I sieri di topi iniettati con MOMP-tNLP adiuvato hanno mostrato un forte legame MOMP, indicando che MOMP-tNLP potrebbe suscitare una risposta immunitaria in vivo.

Figura 1: Espressione e purificazione di MOMP-tNLP. (A) Immagine di tubi contenenti piccole aliquote di una reazione cell-free che ha espresso con successo i controlli GFP che si illuminano sotto sorgente di luce UV (a destra) rispetto ai lisati senza plasmide GFP (a sinistra). (B) Gel proteico colorato con SYPRO Ruby dopo SDS-PAGE mostra il profilo di purificazione di MOMP-tNLP. MOMP migra a 40 kDa e 49ApoA1 migra a 22 kDa. Abbreviazioni: MOMP = proteina principale della membrana esterna della clamidia; tNLP = particella nanolipoproteica di telodendrimero; MOMP-tNLP = complesso MOMP-tNLP; GFP = plasmide fluorescente verde codificante proteine; MW = Marcatore di peso molecolare; T = lisato totale privo di cellule; FT = flusso continuo; R1-R3 = aliquote di reazione cell-free; W1, W6 = Lavaggi 1 e 6; E1-E7 = Eluzioni da 1 a 7; Δ49ApoA1 = Derivato ApoA1 del topo con tag His. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Quantificazione del MOMP nei campioni MOMP-tNLP . (A) SDS-PAGE gel colorato con SYPRO Ruby per la quantificazione di MOMP. Il MOMP ricombinante con concentrazione nota è stato caricato sul gel per ottenere la curva standard. Ogni corsia conteneva 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg e 4,0 μg di MOMP. I campioni MOMP-tNLP che venivano quantificati sono stati caricati sullo stesso gel. (B) La curva standard di concentrazione MOMP è stata generata utilizzando la densitometria. È stata stabilita un'equazione che mette in relazione la densità di banda normalizzata e la quantità di MOMP. L'equazione è stata utilizzata per calcolare il contenuto MOMP nei campioni sconosciuti. Abbreviazioni: MOMP = proteina principale della membrana esterna della clamidia; tNLP = particella nanolipoproteica di telodendrimero; MOMP-tNLP = complesso MOMP-tNLP; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato poliacrilammide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: MOMP-tNLP prodotto senza celle consente a MOMP di formare strutture di ordine superiore. (A) SDS-PAGE gel di MOMP-tNLP con e senza trattamento termico e agente riducente DTT, colorato con SYPRO Ruby. Con il calore e il DTT, il MOMP è apparso principalmente come una banda monomerica a ~ 40 kDa, poiché il calore e l'agente riducente hanno rotto la maggior parte della struttura MOMP di ordine superiore. In assenza di calore e DTT, erano presenti le bande di ordine superiore, indicando la conformazione dell'oligomero MOMP. (B) Macchia occidentale di MOMP-tNLP e MOMP da soli, non trattati e trattati con calore e DTT. Dopo il trasferimento, la membrana è stata sondata con MAb40 (diluizione 1:1.000). È stato osservato un modello di banding simile al gel colorato con SYPRO Ruby, confermando che le bande di peso molecolare più elevato erano effettivamente oligomeri MOMP. (C) Dot blot di MOMP-tNLP e campioni tNLP vuoti (in duplicato) sondati con MAb40 e MAbHIS. Abbreviazioni: MOMP = proteina principale della membrana esterna della clamidia; tNLP = particella nanolipoproteica di telodendrimero; MOMP-tNLP = complesso MOMP-tNLP; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato poliacrilammide; DTT = ditiotreitolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Il MOMP-tNLP prodotto senza cellule è altamente immunogenico. Il siero di topi immunizzati ha mostrato un forte segnale IgG anti-MOMP. MOMP-tNLP adiuvato con CpG + FSL-1 è stato utilizzato per immunizzare i topi. I sieri di sei topi immunizzati sono stati raccolti, raggruppati e utilizzati per sondare MOMP-tNLP. Il siero è stato in grado di legarsi a MOMP in un test western blotting e ha mostrato un forte segnale IgG (a sinistra). Il western blot che utilizzava MAb40 come anticorpo primario (a destra) mostrava bande simili, indicando che il siero conteneva IgG MOMP-specifiche. Abbreviazioni: MOMP = proteina principale della membrana esterna della clamidia; tNLP = particella nanolipoproteica di telodendrimero; MOMP-tNLP = complesso MOMP-tNLP; CpG = coadiuvante CpG modificato per il colesterolo; FSL-1 = adiuvante lipofilo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nome buffer	NaH2PO4	NaCl	Imidazolo	ph
Buffer di associazione	50 mM	300 mM	10 mM	8.0
Tampone di lavaggio	50 mM	300 mM	20 mM	8.0
Elution Buffer 1	50 mM	300 mM	250 mM	8.0
Elution Buffer 2	50 mM	300 mM	500 mM	8.0

Tabella 1: Elenco dei tamponi necessari per la purificazione dell'affinità del nichel, specificando le concentrazioni di ciascun componente e il pH.

Runtime	50 minuti
Portata	6,0 ml/min
Tipo di sfumatura	Binario
Buffer A	10 mM TEAA in H20
Buffer B	MeCN
Gradiente	% Buffer B
0 min	25%
30 minuti	60%
30,5 minuti	100%
40 minuti	100%
40,5 minuti	25%
50 minuti	25%

Tabella 2: Condizioni per la purificazione HPLC in fase inversa di CpG modificato per colesterolo. Abbreviazioni: TEAA = acetato di trietilammonio; MeCN = acetonitrile.

Lisato (mL) privo di cellule	Lipidi DMPC (mg)	Telodendrimer (mg)	Plasmide MOMP (μg)	Resa MOMP purificata (mg)
1	4	0.4	15	0.5
2	8	0.8	30	1.1
3	12	1.2	45	1.6
5	20	2	75	2.7

Tabella 3: La quantità di lipidi, telodendrimero e plasmidi utilizzati per reazioni prive di cellule a scala diversa e le rese corrispondenti. Abbreviazioni: MOMP = proteina principale della membrana esterna della clamidia; DMPC = 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina.

Rapporti di ingresso plasmide, MOMP : Δ49ApoA1		1:1	5:1	10:1	25:1	50:1	100:1
Rapporti della quantità di proteina prodotta, MOMP : Δ49ApoA1		0.02	0.32	0.64	3.46	6.55	20.04
Numero stimato di inserimento MOMP per tNLP		0.03	0.37	0.75	4.04	7.65	23.39

Tabella 4: I rapporti plasmidici in una reazione cellula-free e i tassi di inserzione MOMP risultanti. Abbreviazioni: MOMP = proteina principale della membrana esterna della clamidia; tNLP = particella nanolipoproteica di telodendrimero; Δ49ApoA1 = Derivato ApoA1 del topo con tag His.

Discussione

La clamidia è l'infezione sessualmente trasmissibile più comune che colpisce sia gli uomini che le donne. Sebbene la ricerca sui vaccini sulla clamidia si estenda da decenni, un vaccino sicuro ed efficace che può essere scalato alla produzione di massa è rimasto elusivo¹³. La clamidia MOMP è considerata il candidato principale come antigene protettivo del vaccino; tuttavia, MOMP è altamente idrofobo e incline a piegare in modo errato^14,15. Ulteriori studi hanno rivelato che MOMP esiste in stati oligomerici che sono essenziali per la sua immunogenicit๹. Dettagliato qui è un metodo di co-espressione convalidato e privo di cellule che produce MOMP oligomerici formati all'interno di nanoparticelle tNLP come vaccino, con rese di circa 1,5 mg di MOMP purificato per 3 ml di lisato. Questa procedura completamente collazionata può essere ulteriormente ridimensionata per la produzione industriale, aumentando le sue prospettive come approccio utile per la generazione di vaccini.

Abbiamo precedentemente pubblicato sull'uso dell'espressione libera da cellule per produrre proteine di membrana incorporate all'interno di NLPs ^3,16, così come l'espressione in dischi stabilizzati con telodendrimer. Tuttavia, quest'ultima tecnica ha prodotto particelle proteiche di membrana con maggiore eterogeneità e minore solubilità. ⁴ Inoltre, l'immunogenicità delle particelle MOMP-telodendrimer non è chiara rispetto alle particelle MOMP-tNLP⁶.

Questa procedura può essere adattata per aumentare l'espressione delle proteine della membrana batterica che sono candidati promettenti come antigeni per l'uso nei vaccini a subunità. Non solo questa procedura produce proteine di membrana batterica solubilizzate, ma la struttura complessiva delle nanoparticelle è suscettibile di ulteriori modifiche utilizzando una varietà di adiuvanti di vaccino lipofili inclusi, ma non limitati a, CpG coniugato a una porzione di colesterolo o FSL-1. L'espressione di altri antigeni candidati dai batteri è fattibile, anche se potrebbe essere necessario esplorare parametri come la temperatura di espressione, la scelta dei lipidi e il tipo di sistema di espressione per ottenere rese ottimali.

Inoltre, la scelta e il rapporto del plasmide sono fondamentali in questo processo. Entrambi i plasmidi utilizzati dovrebbero essere costruiti dalla stessa spina dorsale. Se gli inserti hanno approssimativamente la stessa lunghezza, i rapporti possono essere basati sulla massa del plasmide aggiunto, come descritto qui. Tuttavia, il rapporto basato sulle talpe darà risultati più riproducibili, in particolare quando si scalano le reazioni. I rapporti che funzionano bene nelle reazioni su scala di schermo (< 0,5 ml) potrebbero non essere applicabili a reazioni più grandi e potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Le proteine non di membrana possono ancora essere espresse utilizzando kit privi di cellule, ma potrebbero non richiedere la nanoparticella lipidica (co-espressione) per produrre un prodotto solubile. Inoltre, mentre questo protocollo descrive l'adiuvante con CpG e FSL-1, questo sistema è suscettibile di formulazione con altri adiuvanti lipofili o miscelazione con adiuvanti solubili come desiderato.

È essenziale evitare la contaminazione quando si imposta la reazione di espressione libera da cellule in quanto ciò può influire sui rendimenti. Qualsiasi additivo alla reazione, compresi i plasmidi stessi, dovrebbe essere altamente puro. Inoltre, le proteine espresse devono essere a contatto solo con materiali e soluzioni privi di contaminazione da endotossine. La contaminazione da endotossine nelle formulazioni candidate può portare a risultati incoerenti e spuri dei test immunologici e può essere dannosa in quantità sufficienti. Sebbene non descritto qui, può essere necessaria un'ulteriore purificazione dopo cromatografia di affinità di nichel se si osservano molti contaminanti nelle fasi di analisi successive, ad esempio tramite SDS-PAGE. Ciò potrebbe essere realizzato con SEC, sebbene le condizioni possano richiedere un'ottimizzazione formulazione per formulazione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder	Avanti Polar Lipids	850345
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes	Eppendorf	2600028
1 M Trizma hydrochloride solution	Millipore Sigma	T2194
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7%	Millipore Sigma	695092
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Buffer Dam for XCell SureLock	Life Technologies	EI0012
C24 Incubator shaker	New Brunswick Scientific
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit	BiotechRabbit	BR1400201
cOmplete His-Tag Purification Resin	Roche Molecular Diagnostics	5893682001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche Molecular Diagnostics	4693132001
CpG-ODN1826	Biosearch Technologies	T9449
D-(+)-Trehalose dihydrate	Millipore Sigma	71509
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi	Millipore Sigma	71508-3
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity	Bio-Rad	7311550EDU
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS)	Millipore Sigma	D8537
Electrophoresis Power Supply
Endosafe PTS cartridge	Thermo Fisher Scientific	NC9594798
Endosafe-PTS Testing System	Charles River
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid
HCl and NaOH solutions for pH adjustment
HPLC with UV-vis diode array detector	Shimadzu
HyClone HyPure culture-grade water	VWR	82007-328
iBlot 2 Dry Blotting System	Life Technologies
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF	Life Technologies	IB24001
Image Studio V2.0 software	Li-COR Biiosciences
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immun-Blot PVDF Membrane	Bio-Rad	1620177
LI-COR Odyssey Fc imager	Li-COR Biiosciences
Lyophilizer	Labconco
Methanol (≥99.9%)	Millipore Sigma	34860
Microcentrifuge
Microwave oven
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	NP000202
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Life Technologies	NP0009
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20	Li-COR Biosciences	927-50000
Orbital Shaker
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)
pIVEX2.4d vector	Roche Molecular Diagnostics
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody	Qiagen	34660
Probe sonicator
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Qubit Protein Assay Kit	Life Technologies	Q33212
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL	Rainin	17002428
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL	Rainin	17002429
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL	Rainin	17002426
Rainin Pipettes	Rainin
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)	Li-COR Biosciences	926-32210
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Life Technologies	LC5925
Sodium chloride NaCl	Millipore Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4	Millipore Sigma	S0751
Superdex 200, 5/150 GL column	Cytiva	GE28-9909-45
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1	Invivogen	tlrl-fsl
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Life Technologies	S12001
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379
UV light source
Vacufuge Bench Top Centrifuge	Eppendorf
Vortexer
VWR 15 mL conicals (89039-666)	VWR
VWR 50 mL conicals (89039-656)	VWR
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )	Life Technologies	EI0001