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  • Riepilogo
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  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la purificazione di complessi peptidici MHC di classe I e classe II da linee cellulari di topi e umani che forniscono dati immunopeptidomici di alta qualità. Il protocollo si concentra sulla preparazione del campione utilizzando anticorpi disponibili in commercio.

Abstract

L'immunopeptidomica è un campo emergente che alimenta e guida lo sviluppo di vaccini e immunoterapie. Più specificamente, si riferisce alla scienza di studiare la composizione dei peptidi presentati da molecole di classe I e classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) utilizzando piattaforme tecnologiche di spettrometria di massa (MS). Tra tutte le fasi di un flusso di lavoro immunopeptidomico basato sulla SM, la preparazione del campione è di fondamentale importanza per l'acquisizione di dati di alta qualità di rilevanza terapeutica. Qui, vengono descritte istruzioni dettagliate per isolare i peptidi associati a MHC di classe I e II mediante purificazione dell'immunoaffinità da campioni di controllo qualità, da linee cellulari di topo (EL4 e A20) e umane (JY) più specificamente. I vari reagenti e anticorpi specifici sono accuratamente descritti per isolare i peptidi associati all'MHC da queste linee cellulari, compresi i passaggi per verificare l'efficienza di legame delle perline dell'anticorpo e l'efficienza di eluizione dei complessi peptidici MHC dalle perline. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire e standardizzare un flusso di lavoro immunopeptidomico, nonché per confrontare nuovi protocolli. Inoltre, il protocollo rappresenta un ottimo punto di partenza per eventuali non esperti oltre a favorire la riproducibilità intra e interlaboratorio della procedura di preparazione del campione nelle immunopeptidomiche.

Introduzione

Nell'ultimo decennio, l'interesse nello studio del repertorio di peptidi associati a MHC ha superato il settore accademico e ha raggiunto le industrie biotecnologiche e farmaceutiche. Infatti, nel cancro, la scoperta di neoantigeni tumor-specifici attuabili rappresenta un importante focus di ricerca nel settore industriale per sviluppare immunoterapie cliniche che portano all'oncologia personalizzata1,2,3. Fondamentalmente, i peptidi associati all'MHC sono presentati in tutto il corpo, riflettono lo stadio intracellulare della cellula e sono significativi in varie condizioni di malattia come autoimmunità, trapianto, malattie infettive, infiammazione, cancro e allergie1,4. Pertanto, i peptidi associati a MHC, o ligandi dell'antigene leucocitario umano (HLA) negli esseri umani, sono di grande interesse medico e sono collettivamente indicati come immunopeptidome5.

La SM è un potente approccio analitico per caratterizzare l'immunopeptidome6,7, compresa la scoperta di neoantigeni tumore-specifici8,9,10,11. Un tipico flusso di lavoro per eseguire un esperimento di immunopeptidomica comprende tre fasi principali: 1) preparazione del campione per l'isolamento dei peptidi associati a MHC, 2) acquisizione dei dati da parte della SM e 3) analisi dei dati utilizzando vari strumenti software computazionali12. La generazione di campioni di alta qualità descritti in questo protocollo visualizzato è fondamentale per il successo di qualsiasi progetto nell'immunopeptidomica basata sulla SM. Il protocollo descritto di seguito si concentra sull'isolamento di peptidi associati a MHC di classe I e II da linee cellulari ben consolidate che sono adatte a generare dati immunopeptidomici di alta qualità. I risultati rappresentativi di tali linee cellulari sono mostrati nel protocollo corrente.

Protocollo

Il protocollo qui fornito è stato adattato dai protocolli stabiliti13,14,15,16,17,18,19,20. La procedura generale per la purificazione dell'immunoaffinità (IP) dei peptidi MHC di classe I e II è illustrata nella Figura 1. Vedere tabella dei materiali per i dettagli sulle linee cellulari e gli anticorpi utilizzati.

1. Accoppiamento di perline con gli anticorpi (Giorno 1): Anticorpi di accoppiamento a perline attivate da SEPHAROSE CNBr

NOTA: preparare nuove soluzioni per ogni nuovo esperimento. Fare riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella supplementare 1 per l'elenco delle ricette di reagenti e soluzioni. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT). Quando si utilizza un nuovo anticorpo, controllare l'efficienza di legame raccogliendo aliquote chiave (vedere l'indicazione OPZIONALE) ed eseguendo la colorazione blu Coomassie SDS-PAGE (Figura 2).

  1. Attivazione delle perle SEPHAROSE CNBr
    1. Pesare 80 mg di perline attivate da SEpharose CNBr per campione e trasferirle in un tubo conico da 15 ml.
    2. Per facilitare la risospensione delle perline essiccate, in primo luogo, aggiungere 5 ml di HCl da 1 mM e pipettare su e giù 5 volte. Quindi, riempire il tubo conico con ulteriori 8,5 mL di 1 mM HCl.
    3. Ruotare a 20 rpm (giri al minuto) per 30 min a RT utilizzando un dispositivo rotatore. Centrifugare le perline a 200 x g per 2 minuti a RT e rimuovere il surnatante per aspirazione.
    4. Aggiungere 500 μL di tampone di accoppiamento al pellet di perline e trasferirlo in un nuovo tubo centrifuga da 2,0 mL e tenere da parte per il punto 1.2.2.
  2. Accoppiamento di anticorpi a perline attivate da CNBr
    1. Preparare l'anticorpo selezionato per l'isolamento dei peptidi MHC di classe I o II in un nuovo tubo microcentrifuga da 2,0 ml aggiungendo 2 mg dell'anticorpo (in base alla concentrazione specificata dal produttore). Completare il volume a 1 mL con la soluzione tampone di accoppiamento per ottenere una concentrazione finale di 2 mg/mL.
    2. Centrifugare le perline dal punto 1.1.4 a 200 x g per 2 minuti a RT e quindi rimuovere il surnatante mediante aspirazione.
    3. Aggiungere la soluzione anticorpale al tubo microcentrifuga da 2,0 ml contenente le perle attivate.
    4. (FACOLTATIVO) Prendere un'aliquota di 18 μL (INPUT), aggiungere 6 μL di 4x buffer SDS-PAGE e congelare immediatamente.
    5. Ruotare il tubo microcentrifuga dal punto 1.2.3 a 20 giri /min per 120 minuti utilizzando un dispositivo rotatore. Centrifugare le perline a 200 x g per 2 minuti e quindi rimuovere il surnatante.
    6. (FACOLTATIVO) Prendere un'aliquota di 18 μL del surnatante (anticorpo non legato), aggiungere 6 μL di 4x tampone SDS-PAGE e congelare immediatamente.
  3. Blocco e lavaggio delle perle accoppiate agli anticorpi
    1. Aggiungere 1 mL di glicina 0,2 M al tubo microcentrifuga contenente le perle accoppiate agli anticorpi dal punto 1.2.5. Ruota a 20 giri / min per 60 minuti a RT usando un dispositivo rotatore.
    2. Centrifugare le perline a 200 x g per 2 min, quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
    3. Centrifugare le perline a 200 x g per 2 min, quindi rimuovere il surnatante.
    4. (FACOLTATIVO) Prelevare un'aliquota di 18 μL del surnatante (anticorpo non legato, ultimo lavaggio), aggiungere 6 μL di 4x tampone SDS-PAGE e congelare immediatamente.
    5. Aggiungere 1 mL di PBS alle perline nel passaggio 1.3.3.
    6. (FACOLTATIVO) Prelevare un'aliquota di 18 μL di miscela di perline (perline accoppiate con anticorpi), aggiungere 6 μL di 4x tampone SDS-PAGE e congelare immediatamente.
    7. Conservare a 4 °C fino a quando non si utilizza lo stesso giorno al punto 2.5.
      NOTA: Le perline possono essere preparate il giorno prima dell'immunocapture, ma non è stata testata una conservazione più lunga.

2. Lisi cellulare e immunocattura con perline accoppiate a anticorpi (Giorno 1)

NOTA: Il livello delle molecole MHC varia da un tipo di cellula all'altro e viene suggerita la quantificazione delle molecole MHC/HLA per cellula21 (Figura 4A). Si consiglia un minimo di 1 x 108 celle per ogni IP. Questo numero di cellule corrisponde a 6-10 mg di proteine di cellule JY, EL4 e A20 solubilizzate con tampone Chaps allo 0,5%. Per preparare i pellet cellulari per gli IP, le cellule devono essere raccolte, centrifugate e lavate due volte con 5 ml di PBS. Quindi, i pellet di cella possono essere conservati in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL o in un tubo conico da 15 mL a -80 °C fino al momento dell'IP. Si noti che gli IP possono essere eseguiti su pellet cellulari freschi raccolti o congelati.

  1. Per isolare i peptidi MHC di classe I o II, scongelare un pellet congelato di 1 x 108 cellule riscaldando il fondo del tubo con il palmo. Aggiungere 500 μL di PBS al pellet e alla pipetta su e giù fino a quando la sospensione non è omogenea.
    NOTA: a seconda del tipo di cella, il volume del pellet della cella può variare in modo sostanziale. Se 500 μL di PBS non sono sufficienti per sciogliere il pellet cellulare, utilizzare più PBS fino a quando le cellule non si disaggregano facilmente durante il pipettaggio su e giù.
  2. Misurare il volume totale del pellet risospeso in PBS e trasferirlo in un nuovo tubo da 2 mL microcentrifuga. Dividere in più tubi, se necessario.
  3. Aggiungere un volume di tampone di lisi cellulare (tampone chaps all'1% in PBS contenente inibitori della proteasi, 1 pellet/10 ml di tampone) equivalente al volume di pellet cellulare risospeso in PBS misurato nella fase precedente. La concentrazione finale del tampone di lisi è dello 0,5% di Chaps.
  4. Ruotare a 10 giri/min per 60 minuti a 4 °C utilizzando un dispositivo rotatore. Centrifugare il lisato cellulare a 18.000 x g per 20 minuti a 4 °C con freno completo e trasferire il surnatante (contenente i complessi MHC-peptidi) in un nuovo tubo microcentrifuga da 2,0 ml.
  5. Recuperare le perle accoppiate agli anticorpi dal passaggio 1.3.7 mediante centrifugazione a 200 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
  6. Trasferire il surnatante di lisato cellulare nella fase 2.4 alle perle accoppiate agli anticorpi e incubare con rotazione (10 rpm) per 14-18 ore (durante la notte) a 4 °C utilizzando un dispositivo rotatore.

3. Eluizione dei peptidi MHC (Giorno 2)

NOTA: la colonna in polipropilene consente l'eluizione di complessi MHC-peptidi mantenendo le perline nella colonna. Al fine di valutare la proporzione di complessi MHC-peptidi legati alle perline prima e dopo l'eluizione acida con 1% di TFA (acido trifluoroacetico), è possibile eseguire un western blot con aliquote prese nei passaggi chiave durante il protocollo (vedi l'indicazione OPZIONALE). Il western blotting mostrato nella Figura 3 rivela l'arricchimento dei complessi MHC-peptidi a seguito di eluizione acida con TFA all'1%. L'assenza di segnale in questa frazione indicherebbe che la fase di eluizione non ha avuto successo. Si noti che la proporzione di complessi MHC-peptidi non legati alle perline può anche essere valutata in parallelo mediante western blotting usando un'aliquota descritta nel passo 3.1.6.

  1. Eluizione di complessi MHC-peptidi dalle perle accoppiate agli anticorpi
    1. Rimuovere il coperchio inferiore della colonna in polipropilene, posizionare la colonna sulla griglia in polipropilene e installare un contenitore vuoto sotto per raccogliere il flusso.
      NOTA: è necessaria una colonna per campione.
    2. Risciacquare la colonna di polipropilene con 10 ml di tampone A e lasciarla drenare per gravità. Se la velocità di flusso dell'eluizione del liquido è troppo lenta, tagliare ulteriormente la punta inferiore della colonna di polipropilene.
    3. Misurare e raccogliere la miscela di perline-lisato (~2 mL) dal passaggio 2.5 e trasferirla nella colonna di polipropilene.
    4. (FACOLTATIVO) Prendi un'aliquota di 20 μL (o 1/100 del volume totale) per il western blotting e congela immediatamente. Questa frazione corrisponde ai complessi totali MHC-peptidi incubati con le perline.
    5. Lasciare che la miscela liquida eluisca per gravità.
    6. (FACOLTATIVO) Raccogliere e misurare il flusso attraverso e prendere un'aliquota di 20 μL (o 1/100 del volume totale) per il western blotting e congelare immediatamente. Questa frazione rappresenta i complessi residui non legati MHC-peptidi.
    7. Per recuperare il più possibile la miscela di perline-lisato, sciacquare il tubo dal punto 3.1.3 con 1 mL di tampone A e trasferirlo nella colonna di polipropilene.
    8. Lavare le perline trattenute nella colonna di polipropilene aggiungendo 10 ml di tampone A. Lasciare che il tampone di lavaggio eluti per gravità.
    9. Ripetere la fase di lavaggio con 10 mL di tampone B, 10 mL di tampone A e poi 10 mL di tampone C.
    10. Rimuovere la colonna in polipropilene dal rack e posizionarla sulla parte superiore di un nuovo tubo microcentrifuga da 2,0 ml. Tenere la colonna e il tubo insieme con la mano.
    11. Aggiungere 300 μL di TFA all'1% alla colonna di polipropilene e mescolare le perline tubando su e giù 5 volte.
      NOTA: le perline saranno trattenute nella colonna di polipropilene e i peptidi legati all'MHC si eluiranno nel tubo microcentrifuga da 2,0 ml.
    12. Trasferire l'eluato in un nuovo tubo microcentrifuga da 2,0 ml. Ripetere il passaggio 3.1.11 e raggruppare i 2 eluati (gli eluati contenenti i complessi MHC-peptidi devono corrispondere a un totale di 600 μL e saranno utilizzati al punto 3.2.4).
    13. (FACOLTATIVO) Raccogliere un'aliquota di 6 μL (o 1/100 del volume totale) per il western blotting e congelare immediatamente. Questa frazione corrisponde ai complessi MHC-peptidi eluiti dalle perline.
  2. Dissalazione ed eluizione di peptidi MHC
    NOTA: la desalinizzazione e l'eluizione dei passaggi dei peptidi MHC potrebbero essere eseguite installando la colonna C18 su un tubo microcentrifuga da 2,0 ml. Per una migliore vestibilità, installare le ricotte fornite dal produttore tra la colonna C18 e il tubo microcentrifuga da 2,0 ml. In questo protocollo, viene utilizzata una colonna C18 con una capacità di volume di 5-200 μL (6-60 μg). Tutti i passaggi vengono eseguiti a RT.
    1. Aggiungere 200 μL di metanolo sopra la colonna C18, quindi centrifugare a 1546 x g per 3 minuti. Scartare il flusso attraverso.
    2. Aggiungere 200 μL di 80% ACN (acetonitrile) / 0,1% TFA sopra la colonna C18, quindi centrifugare a 1546 x g per 3 min. Scartare il flusso attraverso.
    3. Aggiungere 200 μL di 0,1% TFA sopra la colonna C18, quindi centrifugare a 1546 x g per 3 min. Scartare il flusso attraverso.
    4. Caricare 200 μL dei complessi MHC-peptidi dal passo 3.1.12 sulla parte superiore della colonna C18. Centrifugare a 1546 x g per 3 minuti ed eliminare il flusso attraverso.
    5. Ripetere due volte il passaggio 3.2.4 fino a caricare il volume completo. Si noti che i peptidi MHC vengono mantenuti nella colonna C18.
    6. Aggiungere 200 μL di 0,1% TFA alla colonna C18, quindi centrifugare a 1546 x g per 3 min. Scartare il flusso attraverso.
    7. Trasferire la colonna C18 in un nuovo tubo microcentrifuga da 2,0 ml. Eluire i peptidi MHC dalla colonna C18 aggiungendo 150 μL di 28%ACN/0,1%TFA.
    8. Centrifuga a 1546 x g per 3 min.
    9. Trasferire il flusso attraverso un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Fare attenzione a non scartare il flusso attraverso; contiene i peptidi isolati MHC di classe I o II.
    10. Ripetere due volte i passaggi 3.2.7-3.2.9 per un volume totale di 450 μL.
    11. Congelare i 450 μL di eluato (peptidi MHC purificati di classe I o II) a -20 °C fino a quando i campioni non vengono analizzati da LC-MSMS.
    12. Prima dell'analisi LC-MS/MS, i peptidi MHC di classe I o II purificati dal passaggio 3.2.11 vengono evaporati a secco utilizzando un concentratore di vuoto con preset di 45 °C per 2 h, livello di vuoto: 100 mTorr e rampa di vuoto: 5.
      NOTA: L'evaporazione dei campioni congelati è altamente efficiente. I peptidi essiccati possono essere ricongelati fino all'analisi.

4. Identificazione di peptidi MHC di classe I e II da parte di LC-MS/MS

NOTA: Analizzare l'immunopeptidome MHC di classe I e II utilizzando un Orbitrap ad alte prestazioni e spettrometri di massa a tempo di volo a quadrupolo ad alta risoluzione6. Le seguenti informazioni sono fornite solo a titolo indicativo, tenendo conto del fatto che i vari strumenti di spettrometria di massa tandem esistenti operano secondo diversi standard operativi. Di seguito viene discusso un breve schema dei passaggi:

  1. Solubilizzare i campioni essiccati (dal punto 3.2.12) in 50 μL di acido formico al 4% (FA).
  2. Caricare tre iniezioni di 16 μL per ogni campione e separarle su una colonna di fase inversa fatta in casa (150-μm i.d. per 250 mm di lunghezza, Jupiter 3 μm C18 300 Å) con un gradiente dal 5% -30% ACN-0,1% FA e una portata di 600 nL/min su un UHPLC nano-flusso collegato a un MS.
  3. Acquisire ogni spettro MS completo con una risoluzione di 120000, un AGC di 4 x 105 con modalità automatica per il tempo di iniezione e spettri utilizzando tandem-MS (MS-MS) sugli ioni precursori a carica multipla più abbondanti per un massimo di 3 s.
    NOTA: gli esperimenti Tandem-MS vengono eseguiti utilizzando la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) con un'energia di collisione del 30%, una risoluzione di 30.000, un AGC di 1,5 x 105 e un tempo di iniezione di 300 ms.
  4. Elaborare i file di dati delle tre iniezioni/campioni utilizzando un software di analisi proteomica LC-MS/MS (ad esempio, PEAKS X) utilizzando i database del mouse e umani (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Selezionare "Digestione enzimatica non specificata" per il parametro enzimatico e 10 ppm e 0,01 Da per le tolleranze di massa rispettivamente sugli ioni precursore e frammento.
    NOTA: le modifiche variabili sono la deamidazione (NQ) e l'ossidazione (M). Tutti gli altri parametri di ricerca sono i valori predefiniti. Le liste peptidiche finali vengono filtrate utilizzando ALC dell'80% e con un tasso di falsa scoperta (FDR) dell'1% utilizzando il software di analisi proteomica LC-MS/MS.

5. Visualizzazione dei dati immunopeptidomici

NOTA: La qualità dei dati immunopeptidomici generati dalla SM può essere valutata in diversi modi, come recentemente descritto22,23. Per visualizzare i dati e valutarne la qualità complessiva, la composizione e la specificità MHC, è possibile utilizzare lo strumento software MhcVizPipe (MVP).

  1. Seguire tutte le istruzioni e la relativa documentazione per installare ed eseguire il software MVP disponibile sul sito Web GitHub di Caron Lab24.
    NOTA: MVP fornisce una visione rapida e consolidata della qualità, della composizione e della specificità MHC del campione. MVP parallelizza l'uso di algoritmi immunopeptidomici consolidati (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 e GibbsCluster27) e genera report organizzati e di facile comprensione in formato HTML (HyperText Markup Language). I report sono completamente portatili e possono essere visualizzati su qualsiasi computer con un moderno browser web. Vedere Dati supplementari 1-4 per esempi di report HTML.

Risultati

Il flusso di lavoro generale per isolare i complessi MHC-peptidi per l'analisi delle immunopeptidome da parte della SM è illustrato nella Figura 1. Vengono mostrati risultati rappresentativi per la verifica dell'efficienza di legame delle perline dell'anticorpo (Figura 2) (utilizzando l'anticorpo Y3 anti-H2Kb) e dell'efficienza di eluizione dei complessi peptidici MHC dalle perline (Figura 3) (utilizzando l'anticorpo anti-HLA-ABC W6/32). Sono stati inoltre applicati saggi di quantificazione basati sulla citometria a flusso21 per misurare il numero assoluto di molecole MHC di classe I per cellula EL4 (H2Kb e H2Db) e cellula JY (HLA-ABC), come mostrato nella Figura 4A.

La riproducibilità intra- e inter-individuale dei risultati utilizzando il protocollo corrente è mostrata nella Figura 4B-E. I risultati rappresentativi sono mostrati per i peptidi MHC di classe I identificati da 1 x 108 cellule EL4 e 1 x 108 cellule JY. I risultati sono stati generati da due diversi membri del laboratorio (Utente 1 e Utente 2). Per l'utente 1, il numero medio di peptidi specifici MHCI rilevati dalle cellule EL4 e JY è stato rispettivamente 1341 e 6361; per l'utente 2, 1933 e 7238, rispettivamente (Figura 4B,D). Il coefficiente medio di variazione (CV) per il numero di peptidi rilevati in tre diverse repliche/esperimenti biologici varia dall'1,9% all'11% (Figura 4B,D). Sebbene i CV per il numero di peptidi rilevati nei tre diversi esperimenti fossero relativamente piccoli, l'identità dei peptidi variava considerevolmente (Figura 4C, E). In effetti, i diagrammi di Venn rappresentativi mostrano che la proporzione di peptidi che sono stati rilevati in modo riproducibile attraverso tre repliche biologiche variava dal 39% (utente 2, cellule EL4) al 63% (utente 1, cellule JY) (Figura 4C, E e Tabella supplementare 2).

Le mappe di calore generate dal software MVP mostrano la forza di legame MHC prevista dei peptidi identificati utilizzando gli strumenti della suite NetMHCpan25,26,28. Due opzioni di routine GibbsCluster, che sono chiamate "GibbsCluster non supervisionato" e "GibbsCluster allele-specifico", vengono eseguite anche da MVP per estrarre motivi leganti i peptidi MHC. Si noti che MVP ha delle limitazioni; il suo obiettivo primario non è quello di estrarre motivi allele-specifici e annotare peptidi in modo altamente accurato, ma piuttosto di fornire una visione a volo d'uccello sulla qualità complessiva, la composizione e la specificità MHC dei campioni.

Per i peptidi MHC di classe I (H2Db e H2Kb) di topo nelle cellule EL4 (Figura 5A; pannelli superiori e dati supplementari 1), una mappa di calore rappresentativa mostra che l'89% di tutti i peptidi 8-12-mer rilevati sono previsti come leganti forti (SB: NetMHCpan %Rank <0.5) o leganti deboli (WB: NetMHCpan %Rank <2) per molecole H2Db o H2Kb. I cluster di sequenza generati dai peptidi 8-12-mer sono in concordanza con i loghi riportati per H2Db (asparagina a P5 e Leucina a P9) e H2Kb (fenilalanina a P5 e leucina a P8) (Figura 5)29. Vale la pena ricordare che un terzo motivo dominante (istidina a P7 e leucina a P9) e ulteriori motivi "artefatti" possono essere osservati usando l'anticorpo M1 (Dati supplementari 1). Infatti, l'anticorpo M1 è noto per reagire in modo incrociato con la molecola Qa2 non classica e, pertanto, i peptidi associati a Qa2 vengono rilevati anche dalla SM (Dati supplementari 1). Qui, per semplicità, la Figura 5 si concentra sulla visualizzazione dei motivi di legame peptidico ben consolidati per i due alleli H2b classici (cioè H2Db o H2Kb) espressi nelle cellule EL4.

Per i peptidi umani HLA di classe I (HLA-ABC) nelle cellule JY (Figura 5A; pannelli inferiori e dati supplementari 2), una mappa di calore rappresentativa mostra che il 97% di tutti i peptidi 8-12-mer rilevati sono previsti essere SB o WB per HLA-A * 0201, -B * 0702 o -C * 0702. I peptidi sono stati raggruppati per visualizzare i motivi di legame peptidico per HLA-A * 0201 e -B * 0702. Il motivo di legame per HLA-C*0702 non è mostrato nella Figura 5A perché l'allele C*0702 ha un livello di espressione relativamente basso. Pertanto sono stati isolati e identificati troppo pochi peptidi C*0702 per generare un motivo C*0702 rappresentativo. Si noti che il motivo C*0702 può essere visualizzato in altri studi30,31,32 o dal sito web NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33.

Per i peptidi umani HLA classe II (HLA-DR) nelle cellule JY (Figura 5B; pannelli superiori e dati supplementari S3), una mappa di calore rappresentativa mostra che il 70% di tutti i peptidi 9-22-mer rilevati sono previsti essere SB o WB per HLA-DRB1 * 0404 e -DRB1 * 1301. Sono mostrati motivi di legame peptidico per questi due alleli (Figura 5B). Si noti che i motivi leganti i peptidi mostrati qui potrebbero non essere in completa concordanza con i loghi recentemente riportati per HLA-DRB1 * 0404 e -DRB1 * 130134. Questa discrepanza evidenzia l'attuale incapacità di MVP/NetMHCpan di annotare con precisione i peptidi in alleli HLA di classe II che sono meno caratterizzati, come HLA-DRB1*0404 e -DRB1*1301 espressi nelle cellule JY. Ulteriori informazioni sui motivi di legame peptidico di classe II possono essere trovate in altri studi34,35 e dal sito web NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36.

Infine, per i peptidi MHC di classe II (H2-IAd e H2-IEd) di topo nelle cellule A20 (Figura 5B; pannelli inferiori e dati supplementari 4), una mappa di calore rappresentativa mostra che l'87% di tutti i peptidi 9-22-mer rilevati sono previsti essere SB o WB per H2-IAd o H2-IEd. I motivi leganti peptidici per questi due alleli sono in concordanza con i loghi riportati37.

I report HTML completi generati dal software MVP per valutare la qualità complessiva e la specificità MHC dei campioni sono disponibili nei dati supplementari 1-4.

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Figura 1: Schema della procedura completa per l'isolamento dei peptidi MHC di classe I e II. (A-B)100 milioni di celle vengono pellettizzate e lisate con tampone Chaps allo 0,5%. (C) Il lisato cellulare viene centrifugato e il surnatante viene aggiunto alle perle cnbr-sefarosio accoppiate all'anticorpo desiderato in anticipo e (D) incubato 14-18 ore a 4 °C. (E) Dopo l'immunocaptura, le perle vengono trasferite in una colonna di polipropilene e lavate e i complessi peptidici MHC vengono eluiti con una soluzione di TFA all'1%. (F) I peptidi vengono dissalati ed eluiti utilizzando una colonna C18. (G) Successivamente, i peptidi vengono essiccati e analizzati mediante spettrometria di massa tandem. (H) La qualità dei peptidi isolati MHC di classe I e II può essere valutata in base ai sottotipi HLA utilizzando il software MhcVizPipe liberamente disponibile. Figura creata con BioRender.com (NT22ZL8QSL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Colorazione del gel Coomassie per monitorare l'efficienza di legame degli anticorpi alle perle attivate da SEPHAROSE CNBr. Aliquote di volumi equivalenti sono state caricate su gel SDS-PAGE al 12% seguito da colorazione blu Coomassie: perline + pre-accoppiamento anticorpale (1), anticorpo non legato dopo la fase di accoppiamento (2), surnatante dopo ultimo lavaggio dopo accoppiamento (3) e perline accoppiate con anticorpo (4). L'efficienza del legame è illustrata da una significativa diminuzione dell'intensità di colorazione del segnale delle catene leggere e pesanti di H2Kb quando le perle sono legate covalentemente (Lane 4) alle perline CNBr rispetto all'anticorpo prima dell'accoppiamento (Lane 1). La figura è stata ristampata e adattata da bioRxiv38. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Western blotting per il monitoraggio di complessi MHC-peptidi a seguito di eluizione acida da perline attivate da CNBr accoppiate ad anticorpi. Le aliquote prelevate dai passaggi indicati nel protocollo (1/100 del volume totale misurato) sono state caricate su un gel SDS-PAGE al 12% e trasferite sulla membrana nitrocellulosa: perline + lisato dopo immunocapture e ultimo lavaggio (A); surnatante di ultimo lavaggio (B) e complessi MHC-peptidici eluiti dalle perline (C). Il forte segnale di rilevazione dei complessi MHC-peptide in (C) utilizzando anticorpi a catena pesante anti-HLA-ABC (Abcam, #ab 70328, 1:5000) ha confermato l'isolamento dei complessi MHC-peptidi a seguito di eluizione acida. Si noti che è possibile valutare la proporzione di complessi MHC-peptidi che non sono stati catturati dalle perle accoppiate agli anticorpi raccogliendo il flusso attraverso il passaggio dal passaggio 3.1.6. Un'aliquota può essere aggiunta alla macchia occidentale (non mostrata su questo gel). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Identificazione di peptidi MHC di classe I da cellule JY ed EL4. (A) Istogramma che mostra il numero assoluto di molecole H2Db e H2Kb della superficie cellulare per cellula EL4 e di molecole HLA-ABC per cellula JY. La quantificazione è stata eseguita mediante citometria a flusso. L'errore medio e standard della media sono stati ottenuti da tre repliche biologiche. (B, D) Istogramma che mostra il numero medio e la deviazione standard della media dei peptidi MHC di classe I identificati da due utenti indipendenti (USER_1 [U1] e USER_2 [U2]). Vengono mostrati il numero medio e la deviazione standard della media dei peptidi MHC di classe I rilevati dalle cellule EL4 di topo (B) e dalle cellule JY umane (D). Sono indicati i coefficienti di variazione (CV) su tre repliche biologiche indipendenti. (C, E) Diagrammi di Venn che mostrano il numero di peptidi che sono stati rilevati in modo riproducibile nelle cellule EL4 (C) e JY (E) da due utenti indipendenti (U1 e U2) attraverso tre repliche biologiche indipendenti. La Figura 4A è stata ristampata e adattata da bioRxiv38. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Visualizzazione dei dati immunopeptidomici utilizzando lo strumento software MVP. Analisi dei dati dei peptidi MHC di classe I E (B) di topo e umani (A) MHC di classe II. Vengono mostrate le mappe di calore di affinità di legame rappresentative (pannelli di sinistra) e i motivi di legame peptidico (pannelli di destra). I colori delle mappe di calore rappresentano l'affinità di legame MHC prevista da NetMHCpan 4.1 (%rank). I leganti forti sono rossi (%rank <0.5), i leganti deboli sono blu (%rank <2) e i non-Binders sono gialli (%Rank >2). La proporzione (%) di peptidi 8-12meri (A) e peptidi 9-22meri (B) che sono SB o WB è indicata tra parentesi. I motivi di legame peptidico sono stati generati da MVP utilizzando l'opzione "Gibbscluster specifico per allele". Questi risultati rappresentativi sono stati ottenuti da 1 x 108 cellule e utilizzando i seguenti anticorpi e linee cellulari: anticorpo M1 e cellule EL4 per peptidi MHC di classe I di topo; Anticorpo W6/32 e cellule JY per peptidi umani MHC classe I; Anticorpo M5 e cellule A20 per peptidi MHC di classe II di topo; Anticorpo L243 e cellule JY per peptidi umani MHC classe II. Fare riferimento ai dati supplementari 1-4 per accedere ai report HTML completi generati dal software MVP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dati supplementari 1-4: Fare clic qui per scaricare questo file.

Dati supplementari 1: report HTML generato dal software MVP da peptidi isolati da 1 x 108EL4 cellule utilizzando l'anticorpo M1. Vengono mostrate tre repliche biologiche. Questo rapporto è correlato alla Figura 4 e alla Figura 5 e i peptidi rappresentativi sono elencati nella Tabella supplementare 2.

Dati supplementari 2: report HTML generato dal software MVP da peptidi isolati da 1 x 108 celluleJY utilizzando l'anticorpo W6/32. Vengono mostrati tre replati biologici. Questo rapporto è correlato alla Figura 4 e alla Figura 5 e i peptidi rappresentativi sono elencati nella Tabella supplementare 2.

Dati supplementari 3: report HTML generato dal software MVP da peptidi isolati da 1 x cellule 108JY utilizzando l'anticorpo L243. Questo rapporto è correlato alla Figura 5 e i peptidi rappresentativi sono elencati nella Tabella supplementare 2.

Dati supplementari 4: report HTML generato dal software MVP da peptidi isolati da 1 x 108A20 cellule utilizzando l'anticorpo M5. Questo rapporto è correlato alla Figura 5 e i peptidi rappresentativi sono elencati nella Tabella supplementare 2.

Tabella supplementare 1: Elenco delle riserve. Vengono descritte le ricette per tutti i buffer utilizzati nel protocollo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Elenchi rappresentativi di peptidi associati a H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR e H2-IAd/IEd. Questa tabella contiene gli elenchi di peptidi rappresentativi MHC di classe I e II isolati da linee cellulari EL4 e A20 di topo, rispettivamente, e HLA di classe I e II da linee cellulari JY umane. Questi dati sono stati depositati sul ProteomeXchange (PXD028633). Fare clic qui per scaricare questa tabella.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I set di dati utilizzati in questo manoscritto sono stati depositati sul ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussione

Due linee cellulari di topo (EL4 e A20), una linea cellulare umana (JY) e cinque anticorpi disponibili in commercio [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IAd/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) e L243 (anti-HLA-DR)] sono stati testati e convalidati nel contesto di questo protocollo e forniscono dati immunopeptidomici di alta qualità. Altri anticorpi anti-HLA sono disponibili (ad esempio, anti-HLA-A2 BB7.2) ma non sono stati testati qui. Si noti che l'anticorpo W6/32 è ampiamente utilizzato e l'anticorpo più affermato nel campo; consente l'isolamento di peptidi presentati da tutte le molecole HLA-ABC nell'uomo ed è stato precedentemente segnalato da laboratori esperti per lavorare da varie fonti biologiche come tessuti freschi o congelati8,39, cellule mononucleate del sangue periferico e cellule mononucleate del midollo osseo40, biopsie41, xenotrapianti41,42, autopsie43 e campioni di plasma44,45.

La preparazione di soluzioni fresche che vengono utilizzate in tutto il protocollo è fondamentale. In particolare, l'uso di soluzioni acide fresche in bottiglie di vetro è fondamentale per evitare la successiva contaminazione dei campioni analizzati da MS. Inoltre, quando il protocollo viene eseguito per la prima volta e/o con un nuovo anticorpo, è importante valutare che l'anticorpo sia effettivamente accoppiato alle perle di sefarosio CNBr utilizzando un gel coomassie blu. Anche le fasi di lavaggio delle perle accoppiate agli anticorpi dopo l'immunocaptura dei complessi MHC-peptidi sono fondamentali per evitare la contaminazione di peptidi non MHC. Infine, è necessaria particolare attenzione a non scartare gli eluati a seguito dell'eluizione dei complessi peptidici MHC con TFA all'1% e dell'eluizione dei peptidi dalla colonna C18 con ACN28%/0,1% FA.

I protocolli esistenti disponibili in letteratura descrivono ulteriori passaggi per purificare ulteriormente i peptidi al termine della procedura di isolamento, ad esempio il frazionamento peptidico con metodi diversi14,46 o l'ultrafiltrazione utilizzando filtri 10-30 kDa13,47. L'attuale protocollo non fornisce dettagli su tali passaggi aggiuntivi ed è sufficiente per fornire dati immunopeptidomici di alta qualità. Tuttavia, tali passaggi potrebbero essere presi in considerazione dai non esperti per modificare e risolvere i problemi per ottimizzare ulteriormente la procedura di isolamento dei peptidi.

Il tipo di perline e il tipo di tampone di eluizione acida utilizzati per eluire i complessi MHC dalle perline possono anche essere modificati per la risoluzione dei problemi13,14,15,16,17,18,19. A questo proposito, le perle attivate da SEpharose CNBr sono generalmente un buon punto di partenza poiché sono relativamente poco costose oltre a mostrare flessibilità in termini di legame con vari tipi di anticorpi. Nel protocollo attuale, le perle attivate da SEpharose CNBr hanno dimostrato di funzionare relativamente bene utilizzando cinque diversi anticorpi disponibili in commercio (cioè M1, Y3, W6/ 32, L243 e M5). Oltre alle perle attivate da SEPHAROSE CNBr, anche le perle a flusso rapido di sefarosio 4 di proteina A o G o A / G sono facili da maneggiare e, sebbene relativamente più costose, possono generare risultati simili. Un altro fattore da considerare è l'affinità dell'anticorpo per la proteina A o G. Inoltre, le perle magnetiche di sefarosio sono anche molto facili da usare ma sono relativamente costose. Indipendentemente dal tipo di perline selezionate da non esperti, si incoraggia a raccogliere aliquote nelle fasi critiche del protocollo ed eseguire gel SDS-PAGE blu colorati di Coomassie per monitorare l'efficienza di legame dell'anticorpo alle perline, come mostrato nella Figura 2.

Un altro fattore importante che influenza il successo dell'isolamento dei peptidi MHC si riferisce al tipo di tampone di eluizione acida utilizzato per isolare i complessi MHC-peptidici dalle perline. Sono stati riportati diversi tamponi tra cui 0,1%, 1% o 10% TFA, 0,2% FA e 10% acido acetico. L'1% di TFA era il tampone di eluizione che funzionava per tutti gli anticorpi testati. Questo passaggio potrebbe anche essere tracciato dal western blotting contro le molecole MHC utilizzate per catturare i peptidi MHC, come mostrato nella Figura 3.

Tutti i tamponi contenenti acetonitrile (ACN) e/o acido trifluoroacetico (TFA) sono aggressivi e possono portare alla contaminazione del campione con piccole sostanze molecolari e polimeriche come i plastificanti se a contatto con la plastica. Per evitare tali problemi, tutte le soluzioni contenenti un solvente organico e / o TFA vengono preparate fresche ogni giorno e conservate in una bottiglia di vetro fino all'uso. La maggior parte dei passaggi viene eseguita in tubo di plastica Protein LoBind. Questi tubi sono specificamente progettati per la proteomica e sono realizzati in polipropilene vergine di altissima qualità privo di biocidi, plastificanti e lattice. Sono inoltre prodotti con stampi ottimizzati e altamente lucidati senza l'uso di agenti antiscivolo. Queste precauzioni sono importanti da considerare per consentire la generazione di dati immunopeptidomici di alta qualità.

L'anticorpo è una limitazione importante per l'isolamento dei peptidi legati all'MHC. L'anticorpo W6/32 consente l'isolamento dei peptidi presentati da tutte le molecole HLA-ABC di classe I nell'uomo ed è l'anticorpo più utilizzato e consolidato nel campo. La tipizzazione HLA ad alta risoluzione di linee cellulari umane non caratterizzate o di biocampioni non è una necessità in caso di applicazione dell'anticorpo W6/32, ma è comunque raccomandata per alcune applicazioni per facilitare l'interpretazione dei dati48. Le informazioni di digitazione HLA/MHC sono disponibili anche nelle risorse pubbliche per più linee cellulari e modelli murini49. Oltre all'anticorpo W6/32, gli altri quattro anticorpi (M1, M5, Y3 e L243) che sono stati testati e convalidati nel contesto di questo protocollo sono tutti disponibili in commercio. D'altra parte, molti altri anticorpi che sono stati riportati in precedenti studi immunopeptidomici non sono stati ampiamente adottati dalla comunità e non sono disponibili in commercio o sono disponibili attraverso la coltura di linee cellulari di ibridoma, che è relativamente costoso.

Un'altra importante limitazione per l'isolamento dei peptidi legati all'MHC è la quantità di materiale di partenza richiesta. La quantità richiesta è inversamente proporzionale al livello di espressione delle molecole MHC sulla superficie cellulare, che può essere quantificato mediante citometria a flusso (Figura 4A). Le cellule che mostrano alti livelli di espressione delle molecole MHC (ad esempio, cellule dendritiche e cellule ematopoietiche in generale) generalmente producono dati immunopeptidomici di alta qualità. I laboratori esperti utilizzano da un minimo di 50 milioni di cellule50, ma da 100 a 1 miliardo di cellule sono raccomandate per i non esperti. È stato riportato anche l'uso di campioni di biopsia tissutale (<13 mg)41, xenotrapianto42,43, autopsia44 e plasma45,46, ma rimane difficile per i laboratori non esperti. Inoltre, il numero totale di peptidi associati a MHC attesi è ben documentato per le linee cellulari stabilite (qui, tra ~ 2000 e ~ 10000 peptidi a seconda della linea cellulare e degli anticorpi utilizzati), ma le quantità assolute di peptidi presentati naturalmente che vengono efficacemente tirati giù dalla tecnica rimangono dibattuti. In effetti, studi precedenti hanno stimato che l'efficienza della procedura di isolamento è peptidica-dipendente e può essere da un minimo di 0,5% a 2%51. Altre limitazioni nelle immunopeptidomiche sono la riproducibilità dei metodi e l'incapacità degli strumenti della suite NetMHCpan di annotare correttamente i peptidi agli alleli MHC che sono meno caratterizzati. A questo proposito, ulteriore sviluppo e applicazione di metodi MS di acquisizione relativamente nuovi indipendenti dai dati7,32,52, nonché nuovi algoritmi di clustering peptidico e di previsione del legame peptidico MHC31,34,53,54 si prevede che miglioreranno la riproducibilità e l'accuratezza dell'annotazione peptidica nelle immunopeptidomiche. L'immunopeptidomico sta affrontando altre limitazioni per quanto riguarda l'acquisizione della SM e l'analisi computazionale dei peptidi associati a MHC e sono trattate altrove1,6,55.

Poiché l'isolamento dei peptidi associati a HLA-ABC da campioni umani utilizzando l'anticorpo W6/32 è ben consolidato e ampiamente applicato da molti gruppi di ricerca, l'isolamento dei peptidi associati mHC di classe I e II di topo è relativamente meno stabilito. Pertanto, sono necessari protocolli robusti per l'isolamento dei ligandi MHC del topo. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'isolamento di peptidi MHC classe I e peptidi MHC classe II da due linee cellulari di topo di origine C57BL / 6 e BALB / c, rispettivamente. In particolare, il protocollo consente l'isolamento di peptidi associati a H2Kb e H2Db di classe I utilizzando l'anticorpo M1, nonché peptidi H2-IAd e H2-IEd di classe II associati utilizzando l'anticorpo M5. Pertanto, la diffusione e l'applicazione dell'attuale protocollo dovrebbero facilitare la ricerca immunopeptidomica di base e traslazionale in vari modelli murini.

Il protocollo può essere utilizzato per stabilire e standardizzare un flusso di lavoro immunopeptidomico, nonché per confrontare nuovi protocolli. Ad esempio, può essere adattato e ulteriormente ottimizzato per eseguire lo screening immunopeptidomico in varie matrici biologiche che vanno dal sangue / plasma al tessuto fresco o congelato a FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Inoltre, il protocollo favorirà la riproducibilità intra e interlaboratorio della procedura di preparazione del campione in immunopeptidomica e si prevede pertanto che troverà ampia applicazione nella ricerca di base e clinica.

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Ringraziamo Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Istituto di ricerca in immunologia e cancro, Université de Montréal) e Anthony Purcell (Monash University) per i loro commenti perspicaci. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), della Cole Foundation, CHU Sainte-Justine e delle Charles-Bruneau Foundations, Canada Foundation for Innovation, National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) e Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
A20 cell lineATCCTIB-208mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS GradeFisherScientificA955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class IBioXcellBE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class IIBioXcellBE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class IBioXcellBE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class IIBioXcellBE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class IBioXcellBE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS)ThermoFisher28372Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)EMDMilipore220201-10MG
CNBr-activated SepharoseCytivia# 17-0430-01
EL4 cell lineATCCTIB-39mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/EppendorfFisherScientific02-717-352Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/EppendorfFisherScientific02-717-351Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS GradeFisherScientificA117-50
GlycineFisherScientificRDCG0250500
Hydrochloric acid solutionFisherScientific60-007-11
JY cell lineSigma Aldrich94022533-1VLEBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS GradeFisherScientificA456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column)Bio-Rad731-1550referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitorThermoFisherA329631 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
QifikitDakoK007811-8
Sodium BicarbonateAmresco# 0865-1kg
Sodium ChlorideFisherScientificMSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18The nest groupSEMSS18Vcapacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS GradeFisherScientificPI85183
TrisFisherScientificT395-500
Tris-HClFisherScientific#10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/EppendorfFisherScientificE925000090Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/EppendorfFisherScientific13-698-795Better results with low retention material
Water, LC/MS GradeFisherScientificW64

Riferimenti

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