Migliorare la riproducibilità per soddisfare le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 Linee guida nell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle

Riepilogo

L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare le vescicole extracellulari. Questo documento evidenzia i parametri e i controlli sperimentali NTA oltre a un metodo uniforme di analisi e caratterizzazione di campioni e diluenti necessari per integrare le linee guida proposte da MISEV2018 e EV-TRACK per la riproducibilità tra laboratori.

Abstract

L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è stata uno dei numerosi metodi di caratterizzazione utilizzati per la ricerca sulle vescicole extracellulari (EV) dal 2006. Molti ritengono che gli strumenti NTA e i loro pacchetti software possano essere facilmente utilizzati seguendo una formazione minima e che la calibrazione delle dimensioni sia fattibile internamente. Poiché sia l'acquisizione di NTA che l'analisi del software costituiscono la caratterizzazione EV, sono affrontati in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Inoltre, sono stati monitorati da Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) per migliorare la robustezza degli esperimenti EV (ad esempio, ridurre al minimo le variazioni sperimentali dovute a fattori incontrollati).

Nonostante gli sforzi per incoraggiare la segnalazione di metodi e controlli, molti articoli di ricerca pubblicati non riportano le impostazioni critiche necessarie per riprodurre le osservazioni originali NTA. Pochi articoli riportano la caratterizzazione NTA di controlli negativi o diluenti, evidentemente assumendo che i prodotti disponibili in commercio, come la soluzione salina tamponata con fosfato o l'acqua distillata ultrapura, siano privi di particolato. Allo stesso modo, i controlli positivi o gli standard di dimensione sono raramente riportati dai ricercatori per verificare il dimensionamento delle particelle. L'equazione di Stokes-Einstein incorpora la viscosità del campione e le variabili di temperatura per determinare lo spostamento delle particelle. La segnalazione della temperatura stabile della camera laser durante l'intera raccolta video del campione è, quindi, una misura di controllo essenziale per una replica accurata. Anche la filtrazione di campioni o diluenti non viene riportata di routine e, in tal caso, le specifiche del filtro (produttore, materiale della membrana, dimensione dei pori) e le condizioni di conservazione sono raramente incluse. Gli standard minimi di dettaglio sperimentale accettabile dell'International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) dovrebbero includere un protocollo NTA ben documentato per la caratterizzazione dei veicoli elettrici. Il seguente esperimento fornisce la prova che un protocollo di analisi NTA deve essere stabilito dal singolo ricercatore e incluso nei metodi delle pubblicazioni che utilizzano la caratterizzazione NTA come una delle opzioni per soddisfare i requisiti MISEV2018 per la caratterizzazione di singole vescicole.

Introduzione

L'analisi accurata e ripetibile dei veicoli elettrici e di altre particelle su scala nanometrica presenta numerose sfide nella ricerca e nell'industria. La replica della ricerca EV è stata difficile, in parte, a causa della mancanza di uniformità nella segnalazione dei parametri necessari associati alla raccolta dei dati. Per affrontare queste carenze, l'ISEV ha proposto linee guida del settore come un insieme minimo di standard biochimici, biofisici e funzionali per i ricercatori EV e li ha pubblicati come una dichiarazione di posizione, comunemente indicata come MISEV2014¹. Il ritmo accelerato della ricerca sui veicoli elettrici ha richiesto una linea guida aggiornata e il "MISEV2018: una dichiarazione di posizione dell'ISEV" ha ampliato le linee guida MISEV2014². Il documento MISEV2018 includeva tabelle, schemi di protocolli suggeriti e passaggi da seguire per documentare la caratterizzazione specifica associata ai veicoli elettrici. Come ulteriore misura per facilitare l'interpretazione e la replica degli esperimenti, EV-TRACK è stato sviluppato come una knowledge base di crowdsourcing (http://evtrack.org) per consentire una segnalazione più trasparente della biologia dei veicoli elettrici e della metodologia utilizzata per i risultati pubblicati³. Nonostante queste raccomandazioni per la segnalazione standardizzata dei metodi, il campo continua a soffrire per quanto riguarda la replica e la conferma dei risultati pubblicati.

In linea con lo sforzo del National Institutes of Health e della National Science Foundation per gli strumenti di valutazione della qualità, questo documento suggerisce che l'ISEV richiede una segnalazione standardizzata di metodi e dettagli in modo che gli strumenti di valutazione dei dati possano essere applicati con l'obiettivo di replicare i risultati tra i laboratori. La segnalazione di sorgenti cellulari, procedure di coltura cellulare e metodi di isolamento EV sono fattori importanti per definire le qualità della popolazione EV. Tra gli strumenti NTA, fattori come le impostazioni di rilevamento, l'indice di rifrazione del fluido vettore, le popolazioni eterogenee di particelle che contribuiscono alla polidispersità, la mancanza di requisiti di segnalazione standardizzati e l'assenza di risultati di misurazione intra e inter-osservatore rendono difficile o impossibile il confronto NTA tra i laboratori.

In uso dal 2006, nta è un metodo popolare per la determinazione delle dimensioni delle nanoparticelle e della concentrazione che è attualmente utilizzato da circa l'80% dei ricercatori EV⁴. Le linee guida MISEV2018 richiedono due forme di analisi a singola vescicola, di cui NTA è una delle opzioni popolari. L'NTA continua ad essere di uso comune per la caratterizzazione dei veicoli elettrici grazie alla sua ampia accessibilità, al basso costo per campione e alla sua semplice teoria fondante (l'equazione di Stokes-Einstein). La valutazione EV da parte di NTA genera una distribuzione granulometrica e una stima della concentrazione utilizzando lo scattering della luce laser e l'analisi del movimento browniano, con il limite inferiore di rilevamento determinato dall'indice di rifrazione dell'EV. Quando si utilizza un campione fluido di viscosità e temperatura note, le traiettorie dei veicoli elettrici vengono tracciate per determinare il loro spostamento medio quadrato in due dimensioni. Ciò consente di calcolare il coefficiente di diffusione delle particelle e convertirlo in un diametro idrodinamico equivalente alla sfera da un'equazione^di Stokes-Einstein modificata ^5,6,7. L'analisi da particella a particella di NTA ha meno interferenze da parte di agglomerati o particelle più grandi in una popolazione eterogenea di veicoli elettrici rispetto ad altri metodi di caratterizzazione⁷. Mentre alcune particelle più grandi hanno un impatto minimo sulla precisione del dimensionamento, la presenza di quantità anche minime di particelle grandi e ad alta diffusione della luce si traduce in una notevole riduzione del rilevamento di particelle più piccole a causa della riduzione del rilevamento e del tracciamento^{EV del software 8}. Come tecnica di misurazione, l'NTA è generalmente considerato non prevenuto verso particelle più grandi o aggregati di particelle, ma può risolvere popolazioni di dimensioni multiple attraverso l'analisi delle singole particelle⁹. A causa dell'uso della diffusione della luce da parte delle particelle, uno dei limiti dell'analisi NTA è che qualsiasi particolato come polvere, plastica o polvere con attributi di rifrazione e dimensioni simili rispetto ai veicoli elettrici non può essere differenziato dai veicoli elettrici effettivi con questo metodo di caratterizzazione.

Il NanoSight LM10 (analizzatore di dimensioni delle nanoparticelle) e LM14 (modulo laser) sono stati venduti dal 2006 e, sebbene siano stati sviluppati modelli più recenti di questo strumento, questo particolare modello si trova in molte strutture principali ed è considerato un cavallo di battaglia affidabile. La formazione è necessaria per ottimizzare correttamente le impostazioni NTA per misurazioni ad alta risoluzione di dimensioni e concentrazione. Le due impostazioni importanti necessarie per registrazioni video ottimali sono (1) il livello della telecamera e (2) la soglia di rilevamento. Questi devono essere impostati dall'operatore in base alle caratteristiche del campione. Uno dei principali vincoli dell'analisi NTA è la raccomandazione di concentrazioni del campione tra 10⁷ e 10⁹ particelle / mL, per ottenere questa diluizione del campione può essere necessaria¹⁰. Le soluzioni utilizzate per la diluizione, come la soluzione salina tamponata con fosfato, la soluzione salina da 0,15 M o l'acqua ultrapura, sono raramente prive di particelle di dimensioni inferiori a 220 μm, il che può influire sulle misurazioni NTA. La caratterizzazione NTA delle soluzioni utilizzate per la diluizione deve essere eseguita allo stesso livello di telecamera e alla stessa soglia di rilevamento dei campioni di nanoparticelle che vengono analizzati. Le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle presenti nei diluenti utilizzati per le diluizioni di campioni EV sono raramente incluse nelle pubblicazioni che coinvolgono l'analisi NTA dei veicoli elettrici.

Questo protocollo utilizza l'analisi NTA di liposomi sintetici simili a EV valutati utilizzando livelli di telecamera selezionati, soglie di rilevamento e filtraggio meccanico dei campioni per analizzare gli effetti sistematici del livello della telecamera, della soglia di rilevamento o della filtrazione del campione sul set di dati NTA. I liposomi sono stati sintetizzati come descritto nel file supplementare S1. I liposomi sintetici sono stati utilizzati in questo esperimento a causa della loro uniformità dimensionale, delle caratteristiche fisiche e della stabilità in conservazione a 4 °C. Sebbene fossero stati utilizzati campioni reali di veicoli elettrici, l'eterogeneità e la stabilità dei veicoli elettrici durante lo stoccaggio potrebbero aver complicato questo studio e la sua interpretazione. Le somiglianze nei rapporti NTA dei liposomi (A) e dei veicoli elettrici (B) indicano che gli effetti sistematici rivelati per i liposomi in questo articolo si applicheranno probabilmente anche alla caratterizzazione EV (Figura 1). Insieme, questi risultati supportano l'idea che la reportistica completa delle impostazioni critiche del software e la descrizione dell'elaborazione dei campioni, come diluente, diluizione e filtrazione, influiscano sulla riproducibilità dei dati NTA.

Lo scopo di questo documento è dimostrare che la variazione delle impostazioni NTA (temperatura, livello della telecamera e soglia di rilevamento) e la preparazione del campione cambiano i risultati raccolti: sono state ottenute differenze sistematiche e significative in termini di dimensioni e concentrazione. Poiché NTA è una delle opzioni più popolari per soddisfare le specifiche di caratterizzazione MISEV2018, questi risultati dimostrano l'importanza di riportare la preparazione del campione e le impostazioni NTA per garantire la riproducibilità.

Figura 1: Rapporti NTA rappresentativi per confrontare i liposomi con i veicoli elettrici. (A) Liposomi: campione non filtrato caratterizzato su NTA al 12 marzo 2020. (B) Veicoli elettrici: campione non filtrato caratterizzato su NTA al 26 agosto 2021. Abbreviazioni: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EV = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Linee guida generali del protocollo

1. Mantenere il microscopio su un tavolo d'aria o almeno su un tavolo privo di vibrazioni. Assicurarsi che le vibrazioni estranee (ad esempio, picchiettare il piede sul pavimento, toccare il tavolo, chiudere le porte, il traffico del laboratorio) siano ridotte al minimo.
2. Impostare e mantenere la temperatura del modulo laser a una temperatura costante per tutte le registrazioni video.
   NOTA: la temperatura scelta è stata di 25 °C perché l'analizzatore di dimensioni delle nanoparticelle è stato calibrato a quella temperatura. Pertanto, è importante che tutti gli utenti dello strumento conoscano e utilizzino la temperatura calibrata. La temperatura ambiente non è un'impostazione accettabile perché può variare.
3. Assicurarsi che tutti i diluenti, chiamati anche controlli negativi (ad esempio, soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), acqua distillata ultrapura [DW]), siano tutti caratterizzati da NTA utilizzando lo stesso livello di telecamera e la stessa soglia di rilevamento dei campioni di nanoparticelle misurati. Utilizzare DPBS caratterizzato per il lavaggio del modulo laser e la diluizione dei campioni. Fattori di contaminanti nel DPBS di controllo negativo nei risultati del campione se i loro livelli sono significativi.
4. Conservare i campioni a 4 °C prima della valutazione e non congelarli mai in quanto ciò degraderebbe il campione di liposomi. Campioni caldi / standard / diluenti a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'analisi.
   NOTA: la manipolazione del campione era specifica per il materiale in esame.
5. Valutare il campione e gli standard utilizzando la misurazione rapida per stabilire una diluizione appropriata per ottenere da 10⁷ a 10⁹ particelle / mL (circa 50-100 particelle / schermo video NTA) ritenuti ottimali per le analisi NTA.
   NOTA: Gli autori hanno scoperto che le concentrazioni di particelle all'estremità superiore di questo intervallo producono risultati più coerenti e riproducibili.
6. Compilare tutti i campi applicabili all'interno della casella Acquisizione della scheda SOP per le misurazioni rapide e standard , inclusi la diluizione e il diluente utilizzati.

2. Preparazione degli standard di calibrazione delle dimensioni di 50 nm e 100 nm

NOTA: Vedere la Tabella dei Materiali.

1. Standard di trasferimento di dimensioni 50 nm diluiti 1:5.000
   1. Aggiungere 2 μL degli standard da 50 nm a 9.998 μL di cloruro di potassio (KCl) filtrato da 0,22 μm da 10 mM/0,03% Tween 20 in DW ultrapuro in un tubo conico da 15 mL risciacquato due volte. Conservare lo standard diluito a 50 nm a 4 °C per un massimo di un anno.
2. Dimensioni 100 nm Standard di trasferimento diluiti 1:333
   1. Aggiungere 30 μL degli standard 100 nm a 9.970 μL di 0,22 μm filtrati 10 mM KCl/0,03% Tween 20 in DW ultrapuro in un tubo conico da 15 mL risciacquato due volte. Conservare lo standard diluito a 100 nm a 4 °C per un massimo di un anno.

3. Pulizia e montaggio del modulo laser

1. Ispezionare visivamente il modulo laser e le finestre di copertura delle celle di flusso per rilevare eventuali graffi o imperfezioni.
   NOTA: se una delle superfici del vetro è graffiata, l'imaging potrebbe essere interessato.
2. Pulire delicatamente entrambe le superfici in vetro con un detergente per lenti di buona qualità e carta per lenti. Non utilizzare salviette in tessuto o asciugamani di carta su superfici di vetro.
3. Assicurarsi che la guarnizione dell'O-ring sia posizionata correttamente nella scanalatura del coperchio della cella di flusso prima del montaggio.
4. Posizionare il coperchio della cella di flusso sul modulo laser, assicurandosi che i contatti elettrici siano nel corretto orientamento. Posizionare le 4 viti a molla attraverso la piastra a cella di flusso e innestare i fili del modulo laser, ma non stringere individualmente.
5. Esercitando una pressione uniforme sul coperchio della cella di flusso, stringere uniformemente le viti a pollice in modo diagonale alternato fino a quando non si adattano. Stringere solo le viti del pollice fino a quando non si stringono le dita. Non stringere troppo.
   NOTA: il serraggio irregolare delle viti a pollice può rompere la superficie del modulo laser. Le viti a pollice di nuova concezione "bottom out" alla pressione corretta, evitando possibili serramenti eccessivi.

4. Procedura di lavaggio per il modulo laser prima e tra i campioni

1. Utilizzare un contenitore di DPBS appena aperto e aliquota in tubi di polipropilene da 15 mL a triplo risciacquo. Assicurarsi che i prodotti utilizzati per lavare o diluire i campioni siano caratterizzati da NTA prima dell'uso (vedere il punto 1.3).
2. Lavare due siringhe di tubercolina da 1 mL con adattatori antiscivolo 3 volte con 1 mL di DPBS per rimuovere eventuali residui di particolato. Utilizzare una delle due porte come input, ma utilizzarla in modo coerente durante l'esperimento. Non utilizzare siringhe più grandi a causa del pericolo di rottura delle porte della siringa a causa dell'aumento del peso e delle dimensioni della siringa.
3. Rimuovere e scartare lo stantuffo dalla siringa da^1a tubercolina e inserirlo nella porta rimanente per fungere da serbatoio di diluente/campione vuoto.
   NOTA: la mancata rimozione dello stantuffo causerà un aumento della pressione nella camera del campione e perdite intorno alla guarnizione.
4. Riempire la^2a siringa con 1 mL di DPBS e fissarla alla porta di ingresso del coperchio della cella di flusso.
5. Tenere il modulo laser inclinato con la porta della siringa di uscita sollevata per consentire l'eliminazione dell'aria dalla camera mentre il DPBS viene iniettato lentamente nel modulo laser.
6. Lavare il DPBS rimanente dal modulo laser iniettando 1 mL di aria nella porta di ingresso. Ripeti il lavaggio altre 2 volte.
7. Svuotare il modulo laser nel modo più completo possibile dopo l'ultimo lavaggio.
   NOTA: dopo l'analisi NTA dello standard a 50 nm è necessario un lavaggio accurato e accurato, poiché queste particelle persistono nel modulo laser. Il modulo laser è ora pronto per essere utilizzato.

5. Posizionamento del modulo laser sullo stadio del microscopio

1. Individuare le guide di allineamento della messa a fuoco del modulo laser sul braccio del microscopio (Figura 2) e allinearle utilizzando la manopola di messa a fuoco.

Figura 2: Guida all'allineamento della messa a fuoco del modulo laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Di fronte al microscopio, posizionare il modulo laser nello stadio scanalato e farlo scorrere delicatamente il più a destra possibile.
   NOTA: se fatto con attenzione, l'allineamento e il punto focale saranno più facili da individuare tra i campioni.
3. Accendere l'interruttore a bilanciere sulla scatola di controllo laser.

6. Messa a fuoco e posizionamento del modulo laser

NOTA: Questo deve essere eseguito con fluido nella camera.

1. Caricare il software NTA (vedere la tabella dei materiali) dal desktop.
   NOTA: potrebbe essere visualizzato un errore "Temperatura H/W non trovata in COM3". Basta chiudere e riaprire il software per risolverlo.
2. Fai clic su Avvia fotocamera nella scheda Acquisizione nella casella nell'angolo in alto a sinistra. Se la fotocamera si spegne automaticamente dopo 5 minuti, è sufficiente fare clic su Avvia nuovamente la fotocamera per riavviarla.
3. Nella stessa scheda, regolare il livello della fotocamera su 14-16 per illuminare la linea laser e semplificare l'identificazione e la messa a fuoco delle particelle.
4. Devia l'immagine dalla fotocamera agli oculari spostando il cursore superiore sul lato sinistro del copricapo dentro o fuori.
5. Trova l'area di maggiore densità, comunemente indicata come l'impronta digitale. Centrare e mettere a fuoco l'identificazione personale verticalmente nel campo visivo.
   NOTA: la linea laser si troverà a sinistra dell'identificazione personale. L'oscuramento della stanza può aiutare a facilitare l'individuazione dell'impronta digitale e la messa a fuoco sulla linea laser.
6. Centrare la linea laser nel campo visivo; spostare il dispositivo di scorrimento superiore per deviare la luce verso la fotocamera come osservato sullo schermo del computer.
   NOTA: la linea laser ora visibile sullo schermo è un'immagine speculare della vista oculare; sinistra negli oculari sarà proprio sullo schermo del computer.
7. Regola la messa a fuoco per rendere più nitida l'immagine delle singole particelle in movimento sullo schermo con la manopola di messa a fuoco.
   NOTA: a causa della profondità di messa a fuoco, tutte le particelle non saranno a fuoco, il che è accettabile. Anche le particelle leggermente sfocate verranno catturate dalla fotocamera e analizzate dal software.

7. Caricamento di standard/campioni/diluente nel modulo laser per l'analisi NTA

1. Aspirare 1 mL di standard/campione/diluente in una siringa di tubercolina da 1 mL risciacquata e fissarla alla porta di ingresso del coperchio della cella di flusso. Far avanzare lo stantuffo fino a quando il fluido è evidente nella siringa aperta attaccata alla porta di uscita.
2. Nella vista della telecamera, spostarsi a destra della linea laser in un'area di un numero uniforme di particelle. Se necessario, regolare l'orientamento verticale per centrare le bande orizzontali di luce. Rimettere a fuoco fino a quando non viene visualizzato il numero più alto di particelle. Garantire che per tutte le misure successive, questa posizione sia mantenuta il più vicino possibile.
3. Regolare il livello della fotocamera in modo che il simbolo delle informazioni scure lampeggi a intermittenza in alto a destra nella vista della fotocamera.
   NOTA: in questo modo viene effettuata una selezione coerente del livello della fotocamera al livello di sensibilità minimo per ogni serie di raccolta dati.
   NOTA: il livello della fotocamera non può essere modificato durante l'acquisizione.

8. Convalida della calibrazione

NOTA: si consiglia di convalidare la calibrazione del modulo utilizzando gli standard di dimensione (vedere la sezione 2) prima dell'analisi del campione. La convalida di routine è necessaria per garantire misurazioni accurate. In un laboratorio multiutente, le regolazioni individuali delle impostazioni di configurazione del software possono inavvertitamente causare una raccolta di dati imprecisa. Per la raccolta di dati critici, la convalida quotidiana è una questione di buona pratica di laboratorio. La riproducibilità quotidiana della convalida deve essere inclusa nei risultati riportati. In genere, la calibrazione viene impostata dal tecnico e non è regolabile dal singolo utente a meno che l'utente non disponga dell'accesso come amministratore. Ciò impedisce la riconfigurazione non autorizzata da parte dei singoli utenti.

1. Standard diluiti caldi (vedere paragrafo 2) a temperatura ambiente per 30 min.
2. Ruotare brevemente gli standard e quindi caricare come descritto nella sezione 7.
3. Eseguire l'NTA del campione come descritto nella sezione 10 e registrare i valori per il successivo calcolo del coefficiente di variazione, che deve essere inferiore al 2% se correttamente calibrato.

9. Ottimizzazione della concentrazione del campione per NTA

NOTA: lo schermo deve contenere tra 50 e 100 particelle misurabili quando il livello della telecamera e la concentrazione del campione sono regolati correttamente. Se c'è qualche dubbio sul fatto che un campione abbia un numero di particelle appropriato, a questo punto è possibile eseguire una misurazione rapida sul campione (vedere i passaggi da 9.1 a 9.7). Viene utilizzato per valutare rapidamente le caratteristiche del campione prima di acquisizioni video più lunghe. La scheda Misurazione rapida si trova all'interno della scheda SOP nella casella centrale in basso.

1. Impostare la durata dell'acquisizione su 30 s.
2. Accettare il nome file di base esistente o immettere un nuovo nome file facendo clic sulla scheda ... per un nuovo sito di archiviazione per i dati generati.
3. Selezionare la casella Temperatura target e immettere la temperatura desiderata.
4. Caricare l'esempio come descritto in precedenza (passaggio 7.1) e fare clic su Crea ed esegui script.
5. Attendere che il numero di particelle per fotogramma venga visualizzato in basso a destra dello schermo video dopo il completamento del video di 30 s. Se il numero di particelle è maggiore di 100, lavare il modulo laser 3 volte (come descritto in precedenza nel passaggio 4.6).
6. Diluire il campione nell'intervallo di concentrazione desiderato utilizzando il diluente caratterizzato.
7. Caricare il campione correttamente diluito nel modulo laser lavato ed eseguire la misurazione rapida per verificare che il campione rientri nell'intervallo accettabile.

10. NTA campione

NOTA: la scheda Misurazione standard si trova all'interno della scheda SOP nella casella centrale in basso e viene utilizzata per l'analisi di routine dei campioni (vedere i passaggi da 10.1 a 10.12).

1. Imposta la durata su 30 o 60 s e il numero di video su 5.
2. Accettare il nome file di base esistente o immettere un nuovo nome file facendo clic sulla scheda ... per un nuovo sito di archiviazione per i dati generati.
3. Selezionare la casella Temperatura target e immettere la temperatura desiderata.
4. Fare clic su Crea script per riutilizzare questa misurazione standard.
5. Una volta caricato l'esempio come descritto nella sezione 7 e l'esperimento è pronto per l'esecuzione, fare clic su Crea ed esegui script.
6. Compilare i campi nella schermata popup Imposta dettagli report con informazioni sull'operatore, la descrizione del campione, la diluizione del campione e il diluente utilizzato.
   NOTA: Queste informazioni saranno registrate e stampate sul rapporto sperimentale finale.
7. Quando tutti i campi desiderati sono stati compilati, fare clic su OK per avviare lo script.
   NOTA: se è stata selezionata la temperatura target , il riscaldatore stabilizzerà il campione nel modulo laser alla temperatura desiderata per 5 s prima di consentire allo script di procedere con la misurazione. Il pannello diagnostico nell'angolo in basso a sinistra dello schermo leggerà HEATER ON e visualizzerà la temperatura del campione.
8. Prima di ogni acquisizione video, cerca un prompt per far avanzare manualmente lo stantuffo. Iniettare ~ 0,05 ml del campione nella camera laser e consentire alle particelle di "riposare" (cioè non scorrere), quindi fare clic su OK.
9. Attendi che venga visualizzata una casella di conferma delle impostazioni al completamento della^5a acquisizione video e che la casella Processo lampeggi. Impostare la soglia di rilevamento per l'elaborazione del campione annotando il numero di particelle di marcatura delle croci blu sullo schermo mentre i fotogrammi vengono avanzati manualmente dalla parte inferiore dello schermo video. Se ci sono più di 3-4 croci blu che segnano le particelle su ogni schermo man mano che i fotogrammi sono avanzati, aumentare la soglia di rilevamento.
   NOTA: Le croci blu sulle singole particelle sono analoghe all'effetto "sciame" nella citometria a flusso e devono essere ridotte al minimo per un'accuratezza e una riproducibilità ottimali della raccolta dei dati.
10. Fare clic su Impostazioni OK quando la soglia di rilevamento è accettabile.
11. Attendere che i video vengano elaborati automaticamente e che venga visualizzato un istogramma dei risultati e una notifica di completamento nella finestra di dialogo prima di fare clic su OK.
12. Una volta visualizzata la casella Impostazioni di esportazione , salvare i risultati facendo clic su Esporta.
    NOTA: tutti i risultati dei video e delle analisi verranno memorizzati nel file di destinazione definito nel passaggio 10.2. Ciò richiede una grande quantità di spazio di archiviazione. Monitorare e trasferire a un dispositivo di archiviazione secondario, se necessario.

11. Rianalisi del campione attuale a diverse soglie di rilevamento

NOTA: immediatamente dopo l'analisi NTA (passaggio 10), i dati possono essere rianalizzati utilizzando diverse impostazioni della soglia di rilevamento. Tuttavia, il livello della fotocamera non può essere modificato dopo l'acquisizione.

1. Evidenzia tutti e 5 i video di acquisizione elencati nell'esperimento corrente.
2. Fare clic su Elabora file selezionati e attendere che venga visualizzata la casella Conferma impostazione e che venga visualizzata la casella Processo lampeggiante per modificare la soglia di rilevamento.
3. Regolare la soglia di rilevamento al livello desiderato e fare clic su Impostazione OK.
4. Attendere che i video vengano elaborati automaticamente e che venga visualizzato un istogramma dei risultati e una notifica di completamento nella finestra di dialogo prima di fare clic su OK.
5. Fare clic su Esporta impostazioni. Quando vengono eseguite ulteriori valutazioni sull'esempio più recente, assicurarsi di fare clic sulla casella Esporta risultati nell'esperimento corrente poiché la finestra popup Esporta risultati non verrà visualizzata dopo la rianalisi di esempio.
   NOTA: poiché non ci sono promemoria per farlo, può essere facilmente trascurato e l'analisi andrà persa. Tuttavia, i dati sottostanti rimarranno e potranno essere rianalizzati in un secondo momento.

12. Analisi dei file archiviati

NOTA: se gli esperimenti analizzati in precedenza non sono stati salvati o è necessario eseguire ulteriori analisi su questi campioni, i singoli file possono essere ricaricati nel software NTA per ulteriori valutazioni della soglia di rilevamento . Le modifiche al livello della fotocamera non possono essere modificate dopo l'acquisizione.

1. Caricare il software NTA dal desktop.
2. Fate clic sulla scheda Analisi (Analysis ) nel pannello centrale inferiore.
3. Fare clic su Apri esperimento e passare al file .nano desiderato.
   NOTA: i file video associati all'esperimento .nano selezionato devono trovarsi nella stessa cartella del file dell'esperimento principale; in caso contrario, verrà visualizzato un errore quando si tenta di elaborare i file. Le prime 6 cifre del nome del file sono la data di esecuzione dell'esperimento (xx-xx-xx). Le ultime 6 cifre del nome del file sono l'ora in cui il video è stato registrato (xx-xx-xx) e il singolo identificatore video. Il file PDF di ogni esperimento combinato elenca i file .nano inclusi per tale analisi.
4. Fate clic su Elabora file selezionati (Process Selected Files ) per eseguire l'analisi.
5. Una volta visualizzata la casella Processo lampeggiante per consentire le modifiche in Soglia di rilevamento, impostare la soglia sul livello desiderato e fare clic su OK.
6. Attendere che i video vengano elaborati automaticamente e che venga visualizzato un istogramma dei risultati e una notifica di completamento nella finestra di dialogo prima di fare clic su OK.
7. Fai clic su Esporta risultati. Assicurarsi di fare clic sulla casella Esporta risultati nell'esperimento corrente, poiché la finestra popup Esporta risultati non verrà visualizzata dopo la nuova analisi.
   NOTA: poiché non ci sono promemoria per farlo, può essere facilmente trascurato e l'analisi andrà persa.

13. Pulizia e smontaggio del modulo laser

1. Spegnere la scatola di controllo laser.
2. Lavare l'intero campione dal modulo laser ed eliminarlo correttamente.
3. Tenere il modulo laser inclinato con la porta della siringa aperta sollevata per consentire l'eliminazione dell'aria dalla camera mentre il DPBS viene iniettato lentamente nel modulo laser e viene lavato dalla porta della siringa di uscita.
4. Lavare il DPBS rimanente dal modulo laser ed eliminarlo.
5. Ripetere il lavaggio altre 2 volte e svuotare il modulo laser nel modo più completo possibile dopo l'ultimo lavaggio.
6. Esercitando una pressione uniforme sul coperchio della cella di flusso, allentare uniformemente le viti a pollice in modo diagonale alternato fino a quando non si disinnestano dai fili, rimuovere le viti e riporre nella custodia del modulo laser.
7. Rimuovere il coperchio della cella di flusso dal modulo laser.
8. Pulire delicatamente entrambe le superfici in vetro con un detergente per lenti di buona qualità e carta per lenti. Non utilizzare carta velina o carta assorbente su superfici di vetro.
9. Ispezionare visivamente il modulo laser e le "finestre" di copertura della cella di flusso per eventuali graffi o imperfezioni dopo l'uso e riferire al supervisore.
10. Sostituire il modulo laser e il coperchio della cella di flusso nelle loro custodie per evitare danni alle superfici vetrate durante lo stoccaggio.

14. Protocollo di analisi del campione

1. Campioni non filtrati
   1. Ruotare il campione prima del caricamento e registrare video 5 x 60 s al livello 12 della fotocamera e al livello di soglia di rilevamento 3 come descritto sopra. Rianalizzate questi video utilizzando le soglie di rilevamento 2 e 5.
   2. Ripetete le raccolte video dello stesso campione ai livelli 13 e 14 della fotocamera e al livello di soglia di rilevamento 3. Rianalizzate questi 2 video aggiuntivi utilizzando le soglie di rilevamento 2 e 5. Ripeti l'intero processo utilizzando video 5 x 30 s nell'impostazione SOP .
2. Campioni filtrati
   1. Ruotare il campione e quindi contemporaneamente caricarlo e filtrarlo (filtro a siringa da 0,22 μm) direttamente nel modulo laser.
      NOTA: il filtro della siringa è stato lavato con 2 volte il volume dello spazio morto del filtro prima dell'uso per rimuovere eventuali particelle residenti. I filtri a siringa (vedi tabella dei materiali) avevano uno spazio morto misurato di 0,5 ml e sono stati lavati con 1,0 ml del campione prima delle misurazioni. Prendere nota del tipo di filtro nei campi dati SOP . Il campione filtrato è stato elaborato esattamente come descritto per i campioni non filtrati nella fase 14.1.

15. Analisi statistica dei risultati NTA

1. Per l'analisi dei principali effetti o interazioni, eseguire l'analisi della varianza a seguito di un controllo delle ipotesi ANOVA (normalità, unimodale, omogeneità della varianza). Utilizzare Kruskal-Wallis ANOVA unidirezionale sui ranghi in caso di fallimento delle ipotesi ANOVA.
2. Dopo il ritorno di effetti principali significativi, utilizzare il metodo di Dunn per eseguire test dei mezzi per confronti prepianificati. Si consideri un valore p di 0,05 significativo nei test a due code.
   NOTA: I file di dati generati qui sono disponibili presso gli autori a seguito del completamento di un accordo di trasferimento dei materiali.

Risultati

La tabella 1 contiene i risultati dei video NTA per i campioni di liposomi (18 filtrati e 18 non filtrati) e un diluente DPBS rappresentativo. I confronti tra i due gruppi sono stati completati indipendentemente dal livello della telecamera o dalla soglia di rilevamento in questo documento. I campioni filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 108,5 nm, una modalità particellare di 86,2 nm e una concentrazione di 7,4 × 10⁸ particelle/ml. Al contrario, i campioni non filtrati avev...

Discussione

Esistono diversi metodi disponibili per stimare le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle¹¹. Questi includono metodi di ensemble che generano una stima delle dimensioni da una popolazione, tra cui lo scattering dinamico della luce (DLS), la sedimentazione centrifuga e l'analisi a livello di singola particella: microscopia elettronica, NTA, microscopia a forza atomica e rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili. Di questi, DLS e NTA sono metodi di misurazione delle dimensioni e d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container