In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come utilizzare l'optogenetica wireless combinata con la videografia ad alta velocità in un singolo compito di reach-to-grasp del pellet per caratterizzare i circuiti neurali coinvolti nell'esecuzione del comportamento motorio qualificato nei topi che si muovono liberamente.

Abstract

Le capacità motorie sono essenziali nella vita di tutti i giorni e possono essere compromesse in diversi disturbi del sistema nervoso. L'acquisizione e l'esecuzione di questi compiti richiedono l'integrazione senso-motoria e comportano un controllo preciso dei circuiti cerebrali bilaterali. L'implementazione di paradigmi comportamentali unimanuali in modelli animali migliorerà la comprensione del contributo delle strutture cerebrali, come lo striato, al comportamento motorio complesso in quanto consente la manipolazione e la registrazione dell'attività neurale di nuclei specifici in condizioni di controllo e malattia durante l'esecuzione del compito.

Fin dalla sua creazione, l'optogenetica è stata uno strumento dominante per interrogare il cervello consentendo l'attivazione o l'inibizione selettiva e mirata delle popolazioni neuronali. La combinazione di optogenetica con saggi comportamentali fa luce sui meccanismi alla base di specifiche funzioni cerebrali. I sistemi wireless montati sulla testa con diodi a emissione di luce miniaturizzati (LED) consentono il controllo optogenetico remoto in un animale completamente libero. Ciò evita che le limitazioni di un sistema cablato siano meno restrittive per il comportamento degli animali senza compromettere l'efficienza dell'emissione luminosa. L'attuale protocollo combina un approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità in un compito di destrezza unimanuale per sezionare il contributo di specifiche popolazioni neuronali al comportamento motorio fine.

Introduzione

Il comportamento motorio qualificato è presente durante la maggior parte dei movimenti eseguiti da noi ed è noto per essere influenzato in diversi disturbi cerebrali 1,2,3,4,5,6. L'implementazione di compiti che consentano di studiare lo sviluppo, l'apprendimento e le prestazioni di movimenti qualificati è fondamentale per comprendere le basi neurobiologiche della funzione motoria, specialmente nei modelli di lesioni cerebrali, disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico ^{2,7,8,9,10,11,12,13} . Raggiungere e recuperare oggetti viene fatto di routine nelle azioni della vita di tutti i giorni, ed è una delle prime abilità motorie acquisite durante lo sviluppo precoce e poi perfezionate negli anni ^5,6. Comprende un comportamento complesso che richiede processi senso-motori come la percezione delle caratteristiche dell'oggetto, la pianificazione del movimento, la selezione dell'azione, l'esecuzione del movimento, la coordinazione del corpo e la modulazione della velocità 7,14,15,16. Pertanto, i compiti unimanuali ad alta destrezza richiedono la partecipazione di molte strutture cerebrali di entrambi gli emisferi 16,17,18,19,20,21,22. Nei topi, il singolo compito di reach-to-grasp del pellet è caratterizzato per diverse fasi che possono essere controllate e analizzate separatamente ^7,13,23. Questa caratteristica permette di studiare il contributo di specifiche sottopopolazioni neuronali a diversi stadi di acquisizione e prestazioni comportamentali e fornisce una piattaforma per studi dettagliati dei sistemi motori 13,23,24. Il movimento avviene in un paio di secondi; pertanto, la videografia ad alta velocità dovrebbe essere utilizzata per l'analisi cinematica in fasi distinte della traiettoria motoria qualificata ^7,25. Diversi parametri possono essere estratti dai video, tra cui la postura del corpo, la traiettoria, la velocità e il tipo di errori²⁵. L'analisi cinematica può essere utilizzata per rilevare sottili cambiamenti durante la manipolazione optogenetica wireless ^7,23.

L'utilizzo di diodi miniaturizzati a emissione di luce (LED) per fornire luce tramite un sistema wireless montato sulla testa consente di avere un controllo optogenetico remoto mentre l'animale esegue il compito. Il controller optogenetico wireless accetta comandi di trigger a impulso singolo o continuo da uno stimolatore e invia segnali a infrarossi (IR) a un ricevitore collegato al LED miniaturizzato^23,26. L'attuale protocollo combina questo approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità di un compito di destrezza per sezionare il ruolo di specifiche popolazioni neuronali durante l'esecuzione del comportamento motorio fine²³. Poiché si tratta di un compito unimanuale, consente di valutare la partecipazione delle strutture in entrambi gli emisferi. Tradizionalmente, il cervello controlla il movimento del corpo in modo altamente asimmetrico; tuttavia, i compiti ad alta destrezza richiedono un'attenta coordinazione e controllo da parte di molte strutture cerebrali, compresi i nuclei ipsilaterali e il contributo differenziale delle sottopopolazioni neuronali all'interno dei nuclei ^{10,20,21,22,23}. Questo protocollo mostra che le strutture sottocorticali di entrambi gli emisferi controllano la traiettoria dell'arto^{anteriore 23}. Questo paradigma può essere adatto per studiare altre regioni del cervello e modelli di malattie cerebrali.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono l'uso degli animali sono state condotte seguendo le linee guida locali e nazionali e approvate dal corrispondente Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Istituto di fisiologia cellulare protocollo IACUC VLH151-19). Nel protocollo corrente sono stati utilizzati topi maschi transgenici Drd1-Cre²⁷, 35-40 giorni postnatali con background C57BL/6. I topi sono stati tenuti nelle seguenti condizioni: temperatura 22±1 °C; umidità 55%; orario luci 12/12 h con luci spente alle 19:00 e sono stati svezzati al giorno postnatale 21. I cuccioli svezzati erano ospitati in gruppi dello stesso sesso di 2-5. Gli animali sono stati alloggiati in alloggi statici con piani di micro-barriera. La biancheria da letto consisteva in trucioli di pioppo sterile. I pellet di roditori e l'acqua purificata da RO sono stati forniti ad libitum, tranne quando indicato.

1. Procedure chirurgiche

1. Preparare una cannula LED alla lunghezza desiderata secondo le coordinate dorsoventrali della struttura di interesse (idealmente 0,5 mm in più per tenere conto dello spessore del cranio, per lo striato dorsolaterale 3,5 mm) (Figura 1).
   1. Tagliare la fibra di vetro a una lunghezza superiore alla dimensione finale desiderata, macinare la punta della fibra alla lunghezza target con carta vetrata ruvida e, infine, lucidare la punta della fibra con carta vetrata fine.
      NOTA: La cannula LED è una fibra ottica di vetro di 250 μm di diametro collegata ad un ricevitore a infrarossi (vedi Tabella dei Materiali).
2. Tirare le pipette di vetro (diametro esterno di 1,14 mm, diametro interno di 0,53 mm e lunghezza di 3,5 mm) per il nanoiniettore con un estrattore orizzontale (vedere Tabella dei materiali) e conservarle per dopo. Programmare l'estrattore in un unico anello per ottenere un diametro della punta di 15-20 μm con un lungo cono di pendenza graduale (4-5 mm).
3. Preparare l'area chirurgica disinfettando accuratamente l'apparato stereotassico, il cappuccio, il microiniettore (vedi Tabella dei materiali) e le superfici circostanti con etanolo al 70%.
   NOTA: Un apparato stereotassico del mouse è essenziale per iniettare con precisione Adeno Associated Virus (AAV) e posizionare la cannula LED nella regione di interesse.
4. Indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati per la procedura, tra cui un cappotto da laboratorio pulito o un camice chirurgico monouso, guanti sterili, maschera facciale e copricapo monouso.
5. Posizionare l'attrezzatura necessaria vicino all'area chirurgica, come strumenti chirurgici sterili, punte di cotone, soluzioni, micropipette, punte di pipette, capillari, micro-riempimento con olio minerale e pennarello.
6. Riempire una pipetta per microiniezioni con olio minerale e posizionarla nel microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore funzioni correttamente espellendo un po 'di olio minerale.
   NOTA: Tutti gli strumenti utilizzati durante l'intervento devono essere autoclavati e sterili. Dovrebbe essere usata la tecnica asettica.
7. Anestetizzare gli animali con isoflurano gassoso 4-5% per indurre anestesia e 1,2% durante l'intervento chirurgico con 0,5-1 L/min di ossigeno puro. L'intervento inizia solo dopo che l'animale ha raggiunto un punto di anestesia profonda, valutato dall'assenza di ritiro della zampa dopo un leggero pizzico.
   1. Monitorare continuamente la frequenza respiratoria e la temperatura dell'animale. Mantenere la temperatura corporea con una piastra riscaldante impostata a 34 °C.
8. Applicare un unguento oftalmico. Rimuovere i peli dal cuoio capelluto con un trimero e una crema per la depilazione. Pulire il cuoio capelluto con tamponi di cotone con l'8% di povidone-iodio (vedi Tabella dei materiali) e il 70% di etanolo alternati tre volte ciascuno.
9. Posizionare il mouse nell'apparato stereotassico e fissare la testa, assicurandosi che il cranio sia livellato negli assi mediolaterale e anteriore-posteriore.
10. Fai un'incisione di 1 cm con un bisturi attraverso il cuoio capelluto a livello degli occhi lungo l'asse sagittale. Ritrarre la pelle per esporre il cranio e pulire il periostio con tamponi di cotone.
11. Pulire la superficie del cranio con soluzione salina e tamponi di cotone sterili. Risolvere eventuali emorragie in superficie utilizzando lance oculari assorbenti sterili (vedere Tabella dei materiali) o materiale assorbente sterile simile.
12. Applicare una goccia di perossido di idrogeno al 2,5% con un batuffolo di cotone e lasciarlo agire per alcuni secondi per rendere visibili le suture del cranio e avere un riferimento migliore. Dopo alcuni secondi, pulire accuratamente con un batuffolo di cotone pulito.
13. Con la pipetta di vetro (diametro finale della punta di 15 μm), individuare bregma e lambda per verificare che il cranio sia livellato nell'asse anteriore-posteriore.
    NOTA: Si consiglia di avere un microscopio stereoscopico o un microscopio USB per vedere la punta della pipetta di vetro. Nel caso in cui sia necessario, regolare l'altezza del supporto della bocca per livellare il cranio.
14. Spostare il capillare verso le coordinate anteriore-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML) selezionate (striato dorsolaterale AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Dipingete un punto di riferimento nel cuoio capelluto sopra le coordinate selezionate con un marcatore sterile.
15. Nel punto di riferimento, eseguire una craniotomia di circa 1 mm di diametro applicando una leggera pressione al cranio con un utensile rotante sterile o un trapano dentale a velocità medio-bassa con una piccola punta da trapano dentale rotonda (vedere Tabella dei materiali).
16. Caricare il capillare con 300-400 nL di virus adeno-associato credipendente (AAV) come AAV1-dflox-hChR-2-mCherry per esprimere Channelrhodopsin o un AAV per esprimere solo la proteina reporter (ad esempio, mCherry) come controllo nella regione di interesse (vedere Tabella dei materiali). Verificare che la punta non sia intasata, quindi introdurre la pipetta di vetro nel cervello alle coordinate dorso-ventrali (DV) desiderate (striato dorsolaterale DV -3,35 mm).
    1. Iniettare 200 nL utilizzando un iniettore automatico ad una velocità di 23 nL/s. Attendere 10 minuti dopo aver terminato l'iniezione, prelevare lentamente la pipetta di vetro per evitare fuoriuscite.
       NOTA: È possibile utilizzare un ago da 30 G per iniettare con l'apposito microiniettore.
17. Pulire e asciugare eventuali residui con tamponi di cotone.
18. Collegare la cannula LED in vetro sterile al braccio stereotassico e calibrare le coordinate utilizzando bregma come riferimento. Inserire la cannula molto lentamente (300 μm/min) per evitare danni ai tessuti e posizionarla a 100 μm sopra il sito di iniezione.
19. Una volta che la cannula LED è in posizione, aggiungere una goccia (100 μL) di adesivo tissutale sul bordo della craniotomia.
20. Preparare la miscela di cemento dentale (vedere Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore per fissare la fibra al cranio.
    NOTA: Brevemente, utilizzare un piatto di porcellana refrigerato per avere più tempo di lavoro prima dei set di cemento. Aggiungere 2 misurini di polvere trasparente di resina al piatto di porcellana, aggiungere 4 gocce di base rapida e 1 goccia di catalizzatore, quindi mescolare bene. Il rapporto polvere/liquido può essere regolato se è necessaria una viscosità più sottile o più spessa.
21. Usando un pennello sterile, applicare la miscela di cemento dentale attorno al connettore della cannula a poco a poco, costruendo strati fino a quando il cranio è coperto e il connettore è fissato saldamente al cranio, lasciando i perni completamente liberi. Evitare di ottenere cemento dentale sulla pelle del mouse.
22. Lasciare asciugare completamente.
23. Chiudere la pelle intorno all'impianto utilizzando adesivo tissutale (vedere Tabella dei materiali).
24. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero sopra una piastra riscaldante a 33 ° C. Monitorare la presenza di uno o più dei seguenti segni di dolore / disagio: 1) Curvo, mancanza o riduzione dell'attività motoria, 2) Mancata toelettatura riflessa in un cappotto sporco non tenuto, 3) Eccessiva leccatura o graffio, arrossamento nel sito di incisione, 4) comportamento aggressivo, 5) anoressia o disidratazione e 6) Mancanza di formazione del nido.
    NOTA: Tenere il mouse ingabbiato singolarmente durante tutte le procedure per evitare il distacco dell'impianto. In caso di distacco della cannula, eseguire l'eutanasia iniettando 150 mg/kg di pentobarbital di sodio seguito da decapitazione dopo il raggiungimento dell'anestesia profonda.
25. Iniettare per via sottocutanea (SC) meloxicam 1 mg/kg una volta al giorno per tre giorni dopo l'intervento chirurgico per fornire analgesia.
26. Attendere almeno 7 giorni per il recupero completo e 14 giorni per l'espressione di opsin prima di ulteriori procedure.
    NOTA: Eseguire un follow-up postoperatorio ogni 12 ore per tre giorni, quindi controllare gli animali ogni giorno fino al giorno dell'eutanasia alla fine dell'esperimento.

2. Formazione reach-to-grasp

1. Il giorno 7 post-operatorio, iniziare il protocollo di deprivazione alimentare²⁸. Pesare i topi per tre giorni consecutivi per determinare il loro peso corporeo medio ad libitum. Quindi, programmare le restrizioni alimentari in modo che gli animali ricevano abbastanza nutrienti per mantenere circa il 90% e non meno dell'85% del peso corporeo.
   NOTA: Questo si ottiene fornendo 2,5-3 g di cibo al giorno. Monitora quotidianamente il peso degli animali e segna il benessere generale osservando il comportamento e l'aspetto degli animali, ad esempio l'aspetto del mantello e degli occhi. Utilizzare il sistema di punteggio delle condizioni corporee del riferimento²⁹.
2. Durante i periodi di pre-allenamento, formazione e test, fornire a ciascun topo 20 pellet (20 mg di pellet al gusto di cioccolato senza polvere) al giorno (vedi Tabella dei materiali) (mangiati durante l'attività o dopo) oltre ai pellet alimentari standard.
3. Tre giorni prima dell'assuefazione, spargere 0,4 g / animale / giorno 20 mg di pellet al gusto di cioccolato senza polvere nelle loro gabbie domestiche, in modo che i topi facciano conoscenza con i pellet che servono come ricompensa durante il compito di raggiungere la presa.
4. Abituare i topi mettendoli 10 minuti nella camera di prova un giorno prima del pre-allenamento con pellet sparsi sul pavimento della camera (Figura 1A).
5. Lasciare il cibo ogni giorno dopo l'allenamento e il test. Mantieni un programma simile ogni giorno.
6. Il primo giorno di pre-addestramento, posiziona i topi nella camera di presa e osserva dalla parte anteriore. Posizionare i pellet davanti alla camera vicino all'apertura in modo che inizino a consumare i pellet. In questa fase, i topi sono autorizzati ad afferrare i pellet in qualsiasi forma.
7. Il secondo giorno di pre-allenamento, posizionare i pellet sempre più lontano dall'apertura fino a portarli alla rientranza (1 cm dall'apertura) in modo che i topi possano modellare il loro movimento di presa (Figura 1C).
8. Addestra i topi a correre verso la parte posteriore della gabbia e tornare all'apertura della gabbia per ricevere il prossimo pellet di cibo come strategia per individualizzare le prove.
   NOTA: questo può essere ottenuto aspettando che il mouse si trovi nella parte posteriore della gabbia prima di posizionare un pellet nella rientranza per ogni prova.
9. Posiziona i pellet per essere afferrati dalla zampa destra o sinistra.
   NOTA: I topi iniziano a usare preferenzialmente una zampa da afferrare, che verrà utilizzata nei giorni successivi di allenamento e test.
10. Addestrare gli animali per 6 giorni in sessioni giornaliere della durata di 20 prove o fino a un massimo di 10 minuti. Dal giorno 2 di allenamento, metti il ricevitore simulato (dimensioni 12 x 18 x 7 mm, 1 g, vedi Tabella dei materiali), in modo che i topi si abituino al peso durante l'esecuzione del compito (Figura 1B). Ogni giorno segna il numero di prove hit e missed.
11. Registra il comportamento con una normale fotocamera e cattura 30-60 fotogrammi / s dalla parte anteriore della camera. Inoltre, è possibile posizionare uno specchio sotto la camera di addestramento con un angolo di 45 ° per monitorare la postura degli animali (Figura 1D, E).
12. Per l'analisi cinematica post-hoc (Figura 2), montare una telecamera ad alta velocità (vedi Tabella dei materiali) con un angolo di 45° per registrare dal lato della gabbia. Se è necessaria un'analisi 3D, posizionare una seconda telecamera ad alta velocità per registrare con un angolo di 35 ° dalla parte anteriore della camera; entrambe le telecamere devono essere posizionate sul lato destro o sinistro della gabbia a seconda della sidedness degli animali e devono catturare allo stesso frame rate ed essere sincronizzate⁷ (Figura 3D, E).
13. Impostare le telecamere ad alta velocità su 100 fotogrammi/s con una risoluzione di 376 x 252 pixel o più, se possibile. Posizionare le pareti di polistirolo bianco dietro i lati e il retro della camera per ridurre lo sfondo e aumentare il contrasto (Figura 1E).
14. Il giorno del test, sostituire l'unità fittizia con un ricevitore a infrarossi per la stimolazione optogenetica wireless (Figura 1B, C).
15. Quando i topi iniziano a raggiungere, ruotare manualmente la cannula LED con il telecomando per avere una stimolazione continua per il tempo in cui viene eseguito il comportamento e per non più di 2 s. È preferibile programmare un paradigma di stimolazione automatica. Il dispositivo di stimolazione attiva un LED di 470 nm (luce blu) con intensità sulla punta di 1,0 mW/mm².
16. Raccogli i video per un ulteriore esame, incluso il punteggio e l'analisi cinematica.

3. Conferma istologica post-hoc

1. Al termine di un esperimento, confermare l'espressione virale e il posizionamento della cannula LED. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg. Una volta che il topo presenta segni di anestesia profonda (fase 1.7), perfondere con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) seguita da PFA al 4%.
2. Rimuovere accuratamente la cannula impiantata afferrando saldamente il connettore con una pinza e tirando delicatamente verso l'alto.
3. Estrarre e post-fissare il cervello per 24 ore in 4% PFA²³.
4. Eseguire lavaggi di 3-10 minuti con PBS.
5. Tagliare il cervello in sezioni da 50 μm usando un microtomo (vedi Tabella dei materiali).
6. Montare le sezioni in guide con supporti di montaggio rigidi con DAPI per macchiare nuclei e coprire diapositive.
7. Dopo l'essiccazione, osservare le sezioni al microscopio confocale e verificare la posizione della cannula impiantata e l'espressione di Ch2R fusa con qualsiasi proteina fluorescente.

Risultati

Il compito reach-to-grasp è un paradigma ampiamente utilizzato per studiare la modellazione, l'apprendimento, le prestazioni e la cinematica del movimento delle abilità fini sotto diverse manipolazioni sperimentali. I topi imparano a eseguire l'attività in un paio di giorni e raggiungono una precisione superiore al 55% raggiungendo un plateau dopo 5 giorni di allenamento (Figura 2A, B). Analogamente a quanto riportato in precedenza, una percentuale di animali non svolge i...

Discussione

L'uso della manipolazione optogenetica delle popolazioni neuronali in paradigmi comportamentali ben definiti sta facendo progredire le nostre conoscenze sui meccanismi alla base del controllo motorio ^7,23. I metodi wireless sono particolarmente adatti per compiti che richiedono test su più animali o la libera circolazione^34,35. Tuttavia, poiché le tecniche e i dispositivi sono perfezionati, dovrebbe ess...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia machine	RWD	R583S	Isoflurane vaporizer
Anesket	PiSA		Ketamine
Breadboard	Thorlabs	MB3090/M	Solid aluminum optical breadboard
Camera lense	Canon		50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system	BrainVision	MiCAM02	Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution	PiSA		Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber	In house
Drill bit #105	Dremel	2 615 010 5AE	Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets	Bio-Serv	F05301
Ethyl Alcohol	J.T.  Baker	9000-02	Ethanol
Eyespears	Ultracell	40400-8	Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	Isoflurane
Glass capillaries	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide	Farmacom		Antiseptic
High-speed camera	BrainVision	MiCAM02-CMOS	Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter	Teleopto
Insulin syringe
LED cannula	Teleopto	TelC-c-l-d	LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL	Eppendorf	Z740436
Micro-pipette puller	Sutter	P-87	Horizontal puller
Microscope LSM780	Zeiss		Confocal microscope
Microtome
Mock receiver	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	Micro injector
Oxygen tank	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde	Sigma	P-6148
Phosphate saline buffer	Sigma	P-4417	Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL	ThermoFisher	AM12635	0.5-10 uL  volume
Pisabental	PiSA		Sodium pentobarbital
Plexiglass	commercial		Acrylic sheet
Povidone iodine	Farmacom		Antiseptic
Procin	PiSA		Xylacine
Puralube	Perrigo pharma	1228112	Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool	Kmoon	Mini grinder	Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus	Stoelting	51730D	Digital apparatus
Super-Bond C&B	Sun Medical		Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller	Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line	Gensat	036916-UCD	Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		Microtome
Vectashield mounting media with DAPI	Vector laboratories	H-1200	Mounting media
Wireless receiver	Teleopto	TELER-1-P