Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un sistema di "movimento passivo della testa" progettato su misura, che riproduce le accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori generate durante il loro tapis roulant che corre a velocità moderate. Permette di sezionare fattori/elementi meccanici dagli effetti benefici dell'esercizio fisico.

Abstract

L'esercizio fisico è ampiamente riconosciuto come efficace per varie malattie e disturbi fisici, compresi quelli legati alla disfunzione cerebrale. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico sono poco conosciuti. Molti allenamenti fisici, in particolare quelli classificati come esercizi aerobici come jogging e camminata, producono forze impulsive al momento del contatto del piede con il terreno. Pertanto, è stato ipotizzato che l'impatto meccanico potrebbe essere implicato nel modo in cui l'esercizio contribuisce all'omeostasi dell'organismo. Per testare questa ipotesi sul cervello, è stato sviluppato un sistema di "movimento passivo della testa" progettato su misura (di seguito denominato PHM) in grado di generare accelerazioni verticali con grandezze e modalità controllate e definite e riprodurre la stimolazione meccanica che potrebbe essere applicata alle teste dei roditori durante la corsa del tapis roulant a velocità moderate, un tipico intervento per testare gli effetti dell'esercizio fisico negli animali. Utilizzando questo sistema, è stato dimostrato che PHM ricapitola la segnalazione del recettore della serotonina (5-idrossitriptamina, di seguito denominata 5-HT) sottotipo 2A (5-HT_2A) nei neuroni della corteccia prefrontale (PFC) dei topi. Questo lavoro fornisce protocolli dettagliati per l'applicazione del PHM e la misurazione delle conseguenti accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori.

Introduzione

L'esercizio fisico è utile per trattare o prevenire diversi disturbi fisici, tra cui malattie legate allo stile di vita come il diabete mellito e l'ipertensione essenziale¹. In relazione a questo, sono state accumulate anche prove per quanto riguarda gli effetti positivi dell'esercizio sulle funzioni cerebrali². Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dei benefici dell'esercizio fisico per il cervello rimangono principalmente non chiariti. La maggior parte delle attività fisiche e degli allenamenti generano accelerazioni meccaniche alla testa, almeno in una certa misura. Mentre vari fenomeni fisiologici sono regolati meccanicamente, l'importanza del carico meccanico è stata, nella maggior parte dei casi, documentata nel sistema muscolo-scheletrico ^3,4,5. Sebbene il cervello sia anche soggetto a forze meccaniche durante le attività fisiche, in particolare i cosiddetti esercizi di impatto, la regolazione meccanica della funzione cerebrale fisiologica è stata raramente studiata. Poiché la generazione di accelerazioni meccaniche alla testa è relativamente comune agli allenamenti fisici, è stato ipotizzato che la regolazione meccanica potrebbe essere implicata nei benefici dell'esercizio fisico per le funzioni cerebrali.

La segnalazione del recettore 5-HT_2A è essenziale nella regolazione delle emozioni e dei comportamenti tra i vari segnali biochimici che funzionano nel sistema nervoso. È coinvolto in molteplici malattie psichiatriche ^6,7,8, su cui l'esercizio fisico ha dimostrato di essere terapeuticamente efficace. Il recettore 5-HT_2A è un sottotipo del recettore 5-HT₂ che appartiene alla famiglia della serotonina ed è anche un membro della famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR), la cui segnalazione è modulata dalla sua internalizzazione, ligando-dipendente o -indipendente⁹. La contrazione della testa è un comportamento caratteristico dei roditori, la cui quantità (frequenza) rappresenta esplicitamente l'intensità della segnalazione del recettore 5-HT_2A nei loro neuroni della corteccia prefrontale (PFC)^10,11. Sfruttando la stretta specificità di questa risposta allucinogena alla 5-HT somministrata (risposta a contrazione della testa, di seguito denominata HTR; vedi filmato supplementare 1), è stata testata l'ipotesi sopra menzionata sulle implicazioni meccaniche negli effetti dell'esercizio sulle funzioni cerebrali. Pertanto, abbiamo analizzato e confrontato l'HTR di topi sottoposti a esercizio forzato (corsa su tapis roulant) o intervento meccanico che imita l'esercizio (PHM).

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro nazionale di riabilitazione per persone con disabilità. I ratti maschi di Sprague-Dawley di 8-9 settimane sono stati utilizzati per misurare le accelerazioni alla testa durante la corsa sul tapis roulant e il PHM. Topi maschi C57BL/6 di 9-10 settimane sono stati utilizzati per test comportamentali e analisi istologiche del PFC. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Misurazione delle grandezze delle accelerazioni lungo gli assi x, y e z durante la corsa sul tapis roulant

1. Anestetizzare il ratto con inalazione di isoflurano all'1,5%.
   NOTA: I ratti sono stati utilizzati dopo almeno 1 settimana di acclimatazione all'ambiente di laboratorio. Assicurarsi che il ratto non risponda a un pizzico della punta posteriore.
2. Fissare l'accelerometro (vedi Tabella dei materiali) sulla parte superiore della testa del topo usando del nastro chirurgico.
3. Dopo il completo recupero dall'anestesia, posizionare il ratto nella macchina per tapis roulant (vedere la tabella dei materiali) e regolare il tapis roulant a una velocità moderata (20 m/min)¹² (Figura 1A).
   NOTA: Ci sono voluti almeno 20 minuti per confermare il pieno recupero del ratto dall'anestesia dopo la cessazione dell'inalazione di isoflurano e iniziare l'esperimento sul tapis roulant. Assicurati che il ratto sia sensibile a un pizzico del dito posteriore, essendo in grado di camminare o correre senza apparente barcollare.
4. Misurare l'entità delle accelerazioni verticali durante la corsa sul tapis roulant utilizzando il software applicativo seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Estrarre 10 onde seriali e calcolare singolarmente le accelerazioni medie lungo gli assi 3-dimensionali (assi x, y e z, Figura 1B). Le magnitudini di picco sono state quantificate definendo le onde sincronizzate a gradini (frequenza ~ 2 Hz) come accelerazioni indotte dalla corsa sul tapis roulant (Figura 1C). I ratti sono stati utilizzati per questo studio poiché le loro dimensioni corporee più grandi erano adatte per misurare in modo affidabile l'accelerazione verticale alla testa, cosa che non era possibile nei topi. Tuttavia, i topi sono stati utilizzati per ulteriori studi a causa della facilità e dell'affidabilità per quanto riguarda l'analisi quantitativa della risposta testa-contrazione.

2. Regolazione del sistema PHM e applicazione del PHM ai topi

1. Preimpostare l'ampiezza dell'oscillazione della piattaforma e la velocità di rotazione della camma a forma di elica nel sistema PHM (Figura 1D) in modo che l'entità e la frequenza dell'accelerazione verticale corrispondano ai valori ottenuti al punto 1.4.
   NOTA: Il sistema PHM comprende una struttura metallica e una piattaforma in legno. La velocità del motore può essere modificata e controllata regolando la manopola collegata al driver integrato (vedere Tabella dei materiali). La scala del quadrante di 600 corrisponde a 2 Hz, Figura 1E. La camma a forma di elica ha quattro pale con altezze di passo di 5 mm (Figura 1F).
2. Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano all'1,2%.
   NOTA: I topi sono stati utilizzati dopo almeno 1 settimana di acclimatazione agli ambienti di laboratorio. Assicurarsi che il mouse non risponda a un pizzicamento della punta dell'arto posteriore.
3. Posizionare il mouse in posizione prona con la testa e il resto del corpo situati rispettivamente sulle piattaforme oscillabili e statiche.
   NOTA: Tenere il topo anestetizzato (isoflurano all'1,2%).
4. Accendere il motore per far oscillare la piattaforma verticalmente e applicare PHM al mouse.
   NOTA: la velocità del motore è stata regolata per oscillare la piattaforma a 2 Hz (vedere il punto 2.1). Anestetizzare e posizionare il mouse di controllo sulla piattaforma PHM allo stesso modo, ma lasciare il motore spento.

3. Esecuzione del mouse sul tapis roulant

1. Posizionare il mouse sul tapis roulant e regolare il tapis roulant a una velocità moderata (10 m/min)¹³.

4. Quantificazione della risposta testa-contrazione del topo (HTR)

1. Impostare la videocamera (frame rate: 24 fps) per registrare l'intero spazio nella custodia in plastica trasparente.
   NOTA: La gabbia di plastica è stata utilizzata per mantenere il mouse nel campo della registrazione video.
2. Somministrare per via intraperitoneale 5-idrossitriptofano (5-HTP) (100 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali), il precursore della 5-HT, ad un topo.
3. Posizionare il mouse nella gabbia trasparente e iniziare a registrare per 30 minuti.
4. Rivedi il video registrato (velocità 1/2x o 1/3x), contando manualmente le contrazioni della testa.
   NOTA: Gli analisti non sono stati ciechi alla procedura sperimentale. Il caratteristico movimento rapido "simile a un tic" del topo (vedi Filmato supplementare 1) è stato conteggiato come contrazioni della testa, che raramente si verificano in un normale ambiente riproduttivo.

5. Analisi immunoistochimica della PFC di topo

1. Una volta completati i test HTR, anestetizzare il topo somministrando la miscela di midazolam (4,0 mg / kg), butorfanolo (4,0 mg / kg) e medetomidina (0,3 mg / kg), perfondere con paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS e quindi asportare il cervello seguendo i rapporti precedentemente pubblicati^14,15.
2. Post-fissare il cervello in 4% PFA in PBS per ulteriori 24 ore a 4 °C, e conservare in 30% di saccarosio / PBS fino a quando non affondano. Congelare il composto a temperatura di taglio ottimale fissa (composto OCT, vedere Tabella dei materiali).
3. Recuperare le criosezioni del cervello del topo dalla scatola di scorrimento (vedere Tabella dei materiali). Lasciare i vetrini su salviette pulite a temperatura ambiente fino a quando i campioni non si disidratano completamente.
   NOTA: Sezioni sagittali spesse venti micrometri (laterali +0,5-1,5 mm) sono state preparate da campioni congelati incorporati in un composto OCT utilizzando un criostato (vedi Tabella dei materiali).
4. Utilizzare una penna bloccante liquido (vedere Tabella dei materiali) per disegnare un cerchio attorno al tessuto criosezionato sul vetrino per limitare l'area di diffusione della soluzione (0,1% Tween-20 in soluzione salina tamponata Tris (TBS-T).
5. Posizionare salviette inumidite sul fondo di un vassoio che contiene le diapositive per creare un ambiente umido.
6. Dopo permeabilizzazione con TBS-T, bloccare con siero d'asino al 4% (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora.
7. Risciacquare i vetrini una volta per 5 minuti di immersione in TBS-T.
8. Applicare 100 μL di anticorpo primario opportunamente diluito e miscela DAPI (vedere Tabella dei materiali) su ciascun vetrino, coprire il vassoio per evitare di asciugare il campione e incubare per una notte a temperatura ambiente.
9. Risciacquare con TBS-T tre volte (5 minuti di incubazione ciascuna).
10. Applicare 100 μL di anticorpo secondario fluorescente abbinato alla specie opportunamente diluito (coniugato con Alexa Fluor 488, 568 o 645) (vedere Tabella dei materiali) su ciascun vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
11. Risciacquare con TBS-T tre volte (5 minuti di incubazione ciascuna).
12. Montare le guide con il supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali). Coprire le diapositive con dei vetrini.
13. Visualizza il campione al microscopio a fluorescenza.

Risultati

L'entità di picco delle accelerazioni verticali alla testa dei ratti durante il loro tapis roulant che correva a velocità moderata (20 m / min) era di circa 1,0 × g (Figura 1C). Il sistema PHM (Figura 1D) è stato impostato per generare picchi di accelerazione verticale di 1,0 × g alle teste dei roditori.

L'applicazione di PHM (2 Hz, 30 min/die per 7 giorni) ai topi ha attenuato significativamente il loro HTR ris...

Discussione

Utilizzando il sistema di applicazione PHM sviluppato, abbiamo dimostrato che la segnalazione 5-HT nei loro neuroni PFC è regolata meccanicamente. A causa della complessità degli effetti dell'esercizio, è stato difficile analizzare con precisione le conseguenze dell'esercizio nel contesto della promozione della salute. L'attenzione si concentra sugli aspetti meccanici per impedire il coinvolgimento o il contributo di eventi metabolici che possono verificarsi con o successivamente alle attività di esercizio, come il c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)	Sigma-Aldrich	H9772	Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driver	Oriental motor	BMUD30-A2	Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 mice	Oriental yeast company	C57BL/6J	Mice used in this study
Cryostat	Leica	CM33050S	Microtome to cut frozen samples
DC Motor	Oriental motor	BLM230-GFV2	Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML	Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-9000	Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Isoflurane	Pfizer	v002139	Inhalation anesthetic
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid Blocker	Daido Sangyo	PAP-S	Marker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)	EMD Millipore (Merck)	MAB377	Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	Accelerometer to measure accelerations
OCT compound	Sakura Finetek	45833	Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934	Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide box	AS ONE	03-448-1	Opaque box to store slides
Spike2	Cambridge electronic design limited (CED)	N/A	Application software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley rats	Japan SLC	Slc:SD	Rats used in this study
Treadmill machine	Muromachi	MK-680	System used in experiments of forced running of rats and mice