Generazione di uno xenotrapianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche mediante iniezione guidata da ultrasuoni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per generare un modello di carcinoma pancreatico ortotopico minimamente invasivo mediante iniezione ecoguidata di cellule tumorali pancreatiche umane e il successivo monitoraggio della crescita tumorale in vivo mediante imaging ecografico.

Abstract

Il cancro del pancreas (PCa) rappresenta uno dei tipi di cancro più mortali in tutto il mondo. Le ragioni della malignità del PCa si basano principalmente sul suo comportamento maligno intrinseco e sull'elevata resistenza ai trattamenti terapeutici. Infatti, nonostante molti sforzi, sia la chemioterapia standard che le terapie target innovative hanno sostanzialmente fallito quando sono passate dalla valutazione preclinica all'ambiente clinico. In questo scenario, lo sviluppo di modelli murini preclinici che imitino meglio le caratteristiche in vivo del PCa è urgentemente necessario per testare farmaci di nuova concezione. Il presente protocollo descrive un metodo per generare un modello murino di PCa, rappresentato da uno xenotrapianto ortotopico ottenuto mediante iniezione ecoguidata di cellule tumorali pancreatiche umane. Utilizzando un protocollo così affidabile e minimamente invasivo, forniamo anche prove di attecchimento in vivo e sviluppo di masse tumorali, che possono essere monitorate mediante imaging ad ultrasuoni (US). Un aspetto degno di nota del modello PCa qui descritto è il lento sviluppo delle masse tumorali nel tempo, che consente di identificare con precisione il punto di partenza per i trattamenti farmacologici e un migliore monitoraggio degli effetti degli interventi terapeutici. Inoltre, la tecnica qui descritta è un esempio di implementazione dei principi delle 3R poiché riduce al minimo il dolore e la sofferenza e migliora direttamente il benessere degli animali nella ricerca.

Introduzione

PCa, e la sua forma più comune, l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), è una delle cause più comuni di morte correlata al cancro con un tasso di sopravvivenza a 1 anno inferiore al 20% e un tasso di sopravvivenza a 5 anni dell'8%, indipendentemente dallo stadio ^1,2. La malattia è quasi sempre fatale e si prevede che la sua incidenza crescerà continuamente nei prossimi anni, a differenza di altri tipi di cancro, la cui incidenza è in calo³. Fattori come la diagnosi tardiva del cancro, la tendenza alla rapida progressione e la mancanza di terapie specifiche portano a una prognosi sfavorevole di^{PCa 4}. Sono stati ottenuti grandi progressi nella ricerca sul cancro, grazie allo sviluppo di modelli murini preclinici più accurati. I modelli hanno fornito approfondimenti appropriati per la comprensione del meccanismo molecolare alla base del cancro e per lo sviluppo di nuovi trattamenti⁵. Questi progressi si applicano male al PCa, che, nonostante i grandi sforzi recenti, rimane resistente alle attuali terapie chemioterapiche¹. Per questi motivi, lo sviluppo di nuovi approcci per migliorare le prospettive dei pazienti è obbligatorio.

Nel corso degli anni, sono stati sviluppati molti modelli di topi PCa, tra cui xenotrapianti, che sono i modelli più utilizzati al giorno d'oggi⁵. I modelli di xenotrapianto sono classificati come eterotopici sottocutanei e ortotopici, a seconda della posizione delle cellule tumorali impiantate. Gli xenotrapianti eterotopici sottocutanei sono più facili ed economici da realizzare, ma mancano di alcune caratteristiche del PCa (cioè il peculiare microambiente tumorale, caratterizzato dall'accumulo di tessuto fibrotico, ipossia, acidità e angiogenesi)^6,7. Questo spiega perché gli xenotrapianti sottocutanei spesso non riescono a fornire dati solidi per i trattamenti terapeutici che portano a fallimenti quando vengono tradotti nel contesto clinico⁸. D'altra parte, gli xenotrapianti ortotopici assomigliano più da vicino al microambiente tumorale, portando a una migliore imitazione dello sviluppo naturale della malattia. Inoltre, gli xenotrapianti ortotopici sono più adatti per studiare il processo metastatico e le caratteristiche invasive di PCa, che quasi non si verificano nei modelli sottocutanei⁹. Nel complesso, i modelli murini di xenotrapianto ortotopico sono oggi preferiti per eseguire test farmacologici preclinici ^9,10. Gli xenotrapianti ortotopici di solito si basano su procedure chirurgiche per impiantare cellule o pezzi di tessuto tumorale molto piccoli nel pancreas. In effetti, diversi articoli basati su modelli chirurgici di PCa sono stati pubblicati negli ultimi decenni¹¹. Tuttavia, la qualità e l'esito della procedura chirurgica per l'istituzione di un modello tumorale ortotopico dipendono fortemente dalla capacità tecnica dell'operatore. Un altro punto chiave per un efficace xenotrapianto ortotopico di PCa per un approccio clinico traslazionale è la possibilità di stabilire una malattia localizzata con una cinetica di crescita prevedibile.

Per affrontare questi problemi, qui descriviamo una procedura innovativa per produrre uno xenotrapianto ortotopico di PCa, sfruttando l'iniezione guidata da ultrasuoni (USA) di cellule PCa umane nella coda del pancreas in topi immunodeficienti. Questa procedura genera un modello di mouse PCa affidabile. La crescita tumorale è seguita in vivo dall'imaging statunitense.

Protocollo

Il presente protocollo ha ricevuto l'approvazione del Ministero della Salute italiano con il numero di autorizzazione 843/2020-PR. Al fine di garantire condizioni asettiche, gli animali sono stati mantenuti all'interno della sala di barriera del vivaio di ricerca (Ce.S.A.L.) dell'Università di Firenze. Tutte le procedure sono state eseguite nello stesso spazio in cui i topi erano ospitati presso la struttura LIGeMA dell'Università di Firenze (Italia).

1. Preparazione delle cellule

1. Colture di cellule PCa dalla linea cellulare PCa in una capsula di Petri da 100 mm contenente il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 2% di L-glutammina e il 10% di siero bovino fetale (FBS).
2. Incubare le cellule in normoxia a 37 °C con 5% di CO₂.
3. Staccare le cellule con tripsina. Contare e risospendere 1 x 10⁶ cellule in 20 μL di PBS, 1 ora prima dell'inoculazione.

2. Preparazione del mouse per l'iniezione guidata da ultrasuoni (US-GI)

NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti in condizioni sterili. L'intera procedura di iniezione guidata dagli Stati Uniti, dall'inizio dell'anestesia fino a quando il topo non viene rimosso dalla piattaforma animale, richiede circa 10-12 minuti più 5 minuti per il recupero completo del topo.

1. Poco prima dell'intervento, somministrare carprofen (FANS) per via sottocutanea (s.c.) alla dose finale di 5 mg/kg o tramadolo alla dose finale di 5 mg/kg utilizzando una siringa per tubercolina con ago da 27 G.
   NOTA: Per il presente protocollo, sono stati utilizzati 20 topi femmina Athymic Nude-Foxn^1nu . I topi avevano 8 settimane e pesavano 20-22 g.
2. Accendere l'imager e selezionare Mouse (Small) Addominale dal menu dell'applicazione dal pannello del trasduttore. Assicurarsi che venga visualizzata la finestra di imaging B-Mode (Brightness Mode) e che il sistema sia pronto per acquisire i dati B-Mode.
   NOTA: B-Mode è la modalità di imaging predefinita del sistema. Il sistema visualizza gli echi in una vista bidimensionale (2D) assegnando un livello di luminosità in base all'ampiezza del segnale dell'eco. B-Mode è la modalità più efficace per localizzare strutture anatomiche.
   1. Vai al browser di studio.
   2. Selezionare Nuovo studio e digitare il nome e le informazioni dello studio, ad esempio la data dello studio, ecc.
   3. Inserisci tutte le informazioni necessarie nel nome della serie, ad esempio ceppo animale, ID, data di nascita, ecc.
   4. Tocca Fine; il programma è pronto per l'imaging B-mode.
3. Anestetizzare il topo nella camera di induzione dell'anestesia utilizzando isoflurano al 4% con un flusso di gas di 2 L/min di O₂.
   NOTA: Circa 4 minuti sono sufficienti per una corretta anestesia (respirazione di circa 50-60 respiri al minuto).
4. Una volta che il mouse è anestetizzato, cambiare la connessione della macchina anestetica per dirigere l'isoflurano verso il tavolo di manipolazione del mouse.
5. Posizionare il topo anestetizzato sul fianco destro sul tavolo di manipolazione (riscaldato a 37 °C) con il muso in un cono nasale per assicurarsi che il topo sia anestetizzato utilizzando isoflurano al 2% con un flusso di gas di 0,8 L/min di O₂ (Figura 1A).
6. Applicare una goccia di lacrime artificiali sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
7. Fissare saldamente la mano destra, il piede destro e la coda sui cuscinetti degli elettrodi sulla piattaforma animale con una garza adesiva.
   NOTA: La frequenza respiratoria e l'elettrocardiogramma (ECG) del topo vengono registrati attraverso i cuscinetti degli elettrodi.

3. Iniezione di cellule PANC1 nel pancreas con metodo US-GI

1. Disinfettare la pelle del topo con etanolo al 70% e mantenere la pelle del fianco sinistro tesa usando una garza adesiva.
   NOTA: Mantenere la pelle tesa è importante per ridurre la resistenza all'inserimento dell'ago e per prevenire le deformazioni dell'ago.
2. Applicare il gel per ultrasuoni sull'addome e sul fianco sinistro del mouse utilizzando una siringa da 20 ml (senza l'ago).
3. Utilizzando la manopola di controllo dell'altezza del trasduttore statunitense, abbassare il trasduttore per toccare il fianco sinistro del mouse e posizionarlo trasversalmente al corpo dell'animale.
4. Spostare il trasduttore per visualizzare il pancreas sul display del trasduttore utilizzando l'imaging B-Mode (Figura 1B).
5. Preparare una siringa Hamilton da 50 μL, contenente 1 x 10⁶ cellule PANC1 sospese in 20 μL di PBS, con un ago da 30 mm da 28 G e posizionare la siringa sul supporto appropriato (Figura 1C).
   NOTA: Prima dell'uso, disinfettare l'ago della siringa con etanolo al 70% per un periodo di 5-10 minuti.
6. Utilizzando il micromanipolatore del supporto, abbassare la siringa sulla pelle del topo, con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto e sullo stesso piano del trasduttore a ultrasuoni, formando un angolo di 45° con il trasduttore (Figura 1D).
   NOTA: da questo passaggio in poi, procedere monitorando l'immagine statunitense sul display.
7. Utilizzando il micromanipolatore, perforare la pelle e inserire l'ago della siringa nel pancreas e osservare l'immagine degli Stati Uniti sul display, per seguire la sua traiettoria (Figura 1E).
   NOTA: Prima dell'iniezione, prendere la coda del pancreas come riferimento che si trova dietro la milza e vicino al rene sinistro.
8. Una volta inserito l'ago nel pancreas, iniettare un bolo da 20 μL contenente le cellule direttamente nel pancreas applicando una pressione costante sullo stantuffo della siringa (Figura 1F).
   NOTA: La corretta procedura di iniezione viene controllata dalla presenza di una piccola bolla nel pancreas e dal flusso di liquido ipoecogeno, che è appena visibile dalla punta dell'ago.
9. Lasciare l'ago in posizione per 5-10 secondi dopo l'iniezione dell'intero bolo, quindi ritrarlo lentamente.
10. Rimuovere il trasduttore USA, pulire il gel dal fianco e posizionare il mouse da solo in una nuova gabbia. Osservare l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale.

4.3D Imaging statunitense per il monitoraggio dei tumori pancreatici nei topi

NOTA: La valutazione dello sviluppo del tumore è stata eseguita a partire da 8 giorni dopo l'iniezione cellulare, utilizzando lo stesso strumento utilizzato per l'iniezione guidata dagli Stati Uniti (elencato nella Tabella dei materiali). Quindi, alcune procedure, come l'accensione del sistema (fase 2.2.), l'anestesia (fasi 2.3. - 2.6.) e il posizionamento del mouse sulla piattaforma animale (fase 2.7.), corrispondono pienamente a quanto descritto sopra nel protocollo.

1. Prima di avviare la creazione di immagini negli Stati Uniti, configurare la workstation come illustrato nella Figura 2A.
2. Fissare il trasduttore sul sistema motore 3D (Figura 2A).
3. Accendere l'imager e selezionare Nuovo studio nel browser degli studi.
4. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia (isoflurano al 4%).
5. Posizionare il topo anestetizzato sul fianco destro sul tavolo di manipolazione riscaldato a 37 °C con il muso nel tubo anestetico e ridurre l'isoflurano al 2% (Figura 2B).
   NOTA: è importante che il topo sia posto nella stessa posizione dell'iniezione guidata dagli Stati Uniti, per mantenere gli stessi riferimenti anatomici.
6. Applicare una goccia di unguento veterinario sugli occhi del topo.
7. Applicare uno strato di gel per ultrasuoni sull'addome del topo e sul fianco sinistro.
8. Posizionare il trasduttore a 55 MHz nell'orientamento trasversale per toccare la pelle del fianco sinistro in modo che il pancreas sia approssimativamente centrato (Figura 2C).
9. Utilizzare il motore 3D per acquisire immagini dell'intero pancreas con orientamento trasversale, raccogliendo idealmente 90-100 fotogrammi per acquisizione (il numero di fotogrammi può variare a seconda della scelta personale).
   1. Selezionare la posizione del motore 3D sul touchpad dell'imager.
   2. Indicare la distanza di scansione spostando il cursore per acquisire immagini dell'intero pancreas da entrambe le estremità.
   3. Selezionare Scan Frames (Scansione fotogrammi ) e avviare l'acquisizione 3D.
10. Una volta terminata l'imaging 3D, rimuovere il trasduttore, pulire il gel dalla pelle e posizionare il mouse da solo in una nuova gabbia per il recupero. Osservare l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale.

Risultati

Seguendo il protocollo sopra descritto, i topi sono stati prima anestetizzati in una camera di isoflurano e posti sulla piattaforma animale (Figura 1A). Il pancreas è stato visualizzato con ecografia (Figura 1B). Una siringa Hamilton da 50 μL è stata caricata con 1 x 10⁶ cellule PANC1 sospese in 20 μL di PBS e posizionate sul supporto dell'ago (Figura 1C). L'angolo ottimale tra la siringa e il trasduttore statunitense...

Discussione

Sebbene l'uso dell'imaging statunitense sia diffuso nella clinica, lo sviluppo del tumore in molti modelli murini preclinici è solitamente descritto utilizzando l'imaging bioluminescente¹¹. Quest'ultimo è un modo indiretto per valutare l'attecchimento e l'espansione del tumore e inoltre non fornisce una cinetica di crescita tumorale affidabile. Nel presente studio, abbiamo applicato l'imaging statunitense per eseguire l'iniezione cellulare e per monitorare lo sviluppo del tumore. Il protocollo c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157