Preparazione biologica e tecnica meccanica per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo per lo studio della viscoelasticità della matrice extracellulare e della sua dipendenza dalla composizione proteica o da fattori ambientali. Il sistema di matrice bersaglio è la zonula del topo. Le prestazioni del metodo sono dimostrate confrontando il comportamento viscoelastico delle fibre zonulari wild-type con quelle prive di glicoproteina-1 associata alle microfibrille.

Abstract

L'elasticità è essenziale per la funzione di tessuti come vasi sanguigni, muscoli e polmoni. Questa proprietà deriva principalmente dalla matrice extracellulare (ECM), la rete proteica che lega insieme cellule e tessuti. Come le proprietà elastiche di una rete ECM si relazionano alla sua composizione, e se le proprietà di rilassamento dell'ECM svolgono un ruolo fisiologico, sono domande che devono ancora essere completamente affrontate. Parte della sfida risiede nella complessa architettura della maggior parte dei sistemi ECM e nella difficoltà di isolare i componenti ECM senza comprometterne la struttura. Un'eccezione è la zonule, un sistema ECM che si trova nell'occhio dei vertebrati. La zonula comprende fibre da centinaia a migliaia di micrometri di lunghezza che coprono lo spazio privo di cellule tra la lente e la parete oculare. In questo rapporto, descriviamo una tecnica meccanica che sfrutta la struttura altamente organizzata della zonula per quantificare le sue proprietà viscoelastiche e per determinare il contributo dei singoli componenti proteici. Il metodo prevede la dissezione di un occhio fisso per esporre la lente e la zonula e impiega una tecnica di pull-up che allunga le fibre zonulari allo stesso modo mentre la loro tensione viene monitorata. La tecnica è relativamente economica ma abbastanza sensibile da rilevare alterazioni nelle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari in topi privi di proteine zonulari specifiche o con l'invecchiamento. Sebbene il metodo qui presentato sia progettato principalmente per studiare lo sviluppo e la malattia oculare, potrebbe anche servire come modello sperimentale per esplorare domande più ampie riguardanti le proprietà viscoelastiche degli ECM elastici e il ruolo di fattori esterni come la concentrazione ionica, la temperatura e le interazioni con le molecole di segnalazione.

Introduzione

L'occhio di un vertebrato contiene una lente ottica vivente che aiuta a mettere a fuoco le immagini sulla ^retina1. La lente è sospesa sull'asse ottico da un sistema di fibre delicate e orientate radialmente, come illustrato nella Figura 1A. Ad un'estremità, le fibre si attaccano all'equatore della lente e, all'altra, alla superficie del corpo ciliare. Le loro lunghezze coprono distanze che vanno da 150 μm nei topi a 1 mm negli esseri umani. Collettivamente, queste fibre sono conosciute come la zonula di ^Zinn2, la zonula ciliare o semplicemente la zonula. Traumi oculari, malattie e alcune malattie genetiche possono influenzare l'integrità delle fibre zonulari3, con conseguente eventuale fallimento e conseguente perdita della vista. Nei topi, le fibre hanno un nucleo composto principalmente dalla proteina fibrillina-2, circondata da un mantello ricco di fibrillina-14. Sebbene le fibre zonulari siano uniche per l'occhio, hanno molte somiglianze con le fibre ECM a base di elastina che si trovano altrove nel corpo. Questi ultimi sono coperti da un mantello fibrillin-15 e hanno dimensioni simili alle fibre zonulari6. Altre proteine, come le proteine leganti β che trasformano il latente e la glicoproteina-1 associata alle microfibrille (MAGP-1), si trovano in associazione con entrambi i tipi di fibre7,8,9,10,11. Il modulo elastico delle fibre zonulari è nell'intervallo di 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, paragonabile a quello delle fibre a base di elastina (0,3-1,2 MPa)¹⁷. Queste somiglianze architettoniche e meccaniche ci portano a credere che qualsiasi intuizione sui ruoli delle proteine associate agli zonuli possa aiutare a chiarire i loro ruoli in altre fibre elastiche ECM.

Lo scopo principale dello sviluppo del metodo qui descritto è quello di ottenere informazioni sul ruolo di specifiche proteine zonulari nella progressione della malattia ereditaria degli occhi. L'approccio generale è quello di confrontare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi wild-type con quelle dei topi portatori di mutazioni mirate nei geni che codificano per le proteine zonulari. Mentre diversi metodi sono stati utilizzati in precedenza per misurare le proprietà elasto-meccaniche delle fibre zonulari, tutti sono stati progettati per gli occhi di animali molto più grandi12,13,14,15,16. In quanto tali modelli non sono geneticamente trattabili; abbiamo cercato di sviluppare un metodo sperimentale che fosse più adatto agli occhi piccoli e delicati dei topi.

Il metodo che abbiamo sviluppato per valutare la viscoelasticità delle fibre zonulari di topo è una tecnica a cui ci riferiamo come pull-up ^assay4,18, che è riassunto visivamente nella Figura 1. Di seguito viene fornita una descrizione dettagliata del metodo pull-up e l'analisi dei risultati. Iniziamo descrivendo la costruzione dell'apparato, comprese le parti tridimensionali (stampate in 3D) utilizzate nel progetto. Successivamente, descriviamo in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere e preparare gli occhi per l'esperimento. Infine, forniamo istruzioni dettagliate su come ottenere dati per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari. Nella sezione Risultati rappresentativi, condividiamo dati precedentemente non pubblicati ottenuti con il nostro metodo sulle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari di topi privi di ^MAGP-119 e un set di controllo ottenuto da animali selvatici di pari età. Infine, concludiamo con osservazioni generali sui vantaggi e i limiti del metodo e suggerimenti per potenziali esperimenti che possano chiarire come i fattori ambientali e biochimici influenzano le proprietà viscoelastiche delle fibre ECM.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per gli studi sugli animali della Washington University e hanno aderito alla Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Fabbricazione di parti specializzate e costruzione di apparecchi

1. Fabbricazione di parti specializzate
   1. Fabbricazione di sonde. Tenere un capillare di vetro ad angolo, come mostrato nel pannello di sinistra della Figura 2A. Posizionare una fiamma da un accendisigari a circa 2 cm da un'estremità e tenerla lì fino a quando l'estremità si piega di 90°, come mostrato nel pannello di destra della Figura 2A.
   2. Esempio di fabbricazione della piattaforma. Utilizzando un software di disegno 3D, progettare una piattaforma di 30 x 30 x 5 mm e contenente rientranze emisferiche di diametro 2,0, 2,5 e 3,0 mm, come mostrato nella Figura 2B.
   3. Fabbricazione portasonde. Utilizzando il software di disegno 3D, progettare un supporto che contenga la sonda capillare e collegarla a un micromanipolatore (vedere la Figura 2C).
      NOTA: un file 3D di esempio per la fabbricazione della piattaforma e la fabbricazione del supporto della sonda in formato STL è disponibile su richiesta presso l'autore corrispondente.
   4. Assemblaggio lente negativa. Posizionare una lente cilindrica negativa (-75 mm di lunghezza focale e circa 50 mm di altezza e lunghezza) come mostrato in Figura 1C e Figura 1D per correggere la distorsione causata dall'aggiunta di fluido alla capsula di Petri (l'aggiunta di fluido distorce la vista dell'occhio sezionato quando viene ripreso di lato).
   5. Incollare l'obiettivo negativo a una delle basi a 2 fessure (vedere la Figura 2D per il posizionamento dell'obiettivo sulla base).
   6. Assemblate le parti rimanenti come illustrato nella Figura 2D.
   7. Regolare l'altezza del palo in modo che l'obiettivo passi a malapena sopra la bilancia e stringere la vite nel supporto del palo.
2. Costruzione di apparecchi
   1. Installare su un computer il programma di registrazione fornito con la bilancia, il software della telecamera del microscopio e l'applicazione del controller micrometrico motorizzato.
   2. Collegare il micrometro motorizzato al controller del servomotore e quest'ultimo al computer. Avviare l'applicazione del controller del motore e modificare le impostazioni del motore.
      NOTA: Le impostazioni motorie, elencate di seguito, sono state scelte a seguito di esperimenti preliminari che hanno rivelato che le sollecitazioni si rilassano su una scala temporale di 10-20 s. Sulla base di questa determinazione, abbiamo selezionato una velocità e un'accelerazione che hanno permesso al motore di completare uno spostamento di 50 μm in un tempo inferiore al tempo di rilassamento, ma non troppo breve per evitare di scuotere il campione. Qui abbiamo scelto un tempo di spostamento di circa 5-10 s.
   3. Impostare la velocità massima a 0,01 mm/s e l'accelerazione a 0,005 mm/^s2.
   4. Installare la telecamera nel microscopio di ispezione e testare il software di imaging della telecamera.
   5. Posizionare la bilancia sullo spazio del banco dedicato all'apparecchio.
   6. Incolla una piattaforma stampata in 3D (dal passaggio 1.1.2) a una piastra di Petri e aggiungi una perla di vetro da 2-3 mm a uno dei pozzetti. Posizionare la piastra di Petri sulla bilancia in modo che la perla si trovi vicino al centro della padella.
   7. Sostituire il micrometro manuale dal micromanipolatore con quello motorizzato.
   8. Avvitare le due viti 4-40 nel portasonda. Collegare il supporto della sonda al manipolatore come illustrato nella Figura 1C.
   9. Preparare una sonda come illustrato nella Figura 2A, posizionarla all'interno del supporto della sonda con la parte piegata rivolta verso il basso e stringere le viti.
   10. Posizionare il micromanipolatore sul tavolo in modo tale che la punta della sonda sia sopra il tallone sulla piattaforma. Applicare il micromanipolatore al tavolo per evitare movimenti accidentali durante l'esperimento.
   11. Posizionare il microscopio laterale sul tavolo in modo che il tallone sia al centro del suo campo visivo e a fuoco.

2. Preparazione del campione e acquisizione dati

1. Fissazione e dissezione degli occhi
   1. Mantenere topi wild-type e animali Magp1-null su uno sfondo identico C57 / BL6J. Eutanasia topi di 1 mese o 1 anno per inalazione di _CO2 .
   2. Rimuovere gli occhi con una pinza fine e fissare i globi enucleati a 4 °C durante la notte in soluzione salina tamponata con paraformaldeide/fosfato al 4% (PBS, pH 7,4). Mantenere una pressione positiva di 15-20 mmHg nell'occhio durante il processo di fissazione, come ^descritto6.
      NOTA: Gli esperimenti sono condotti su topi maschi, per controllare possibili differenze legate al sesso nella dimensione del globo oculare. La pressione positiva assicura che il globo rimanga gonfiato, preservando lo spazio tra la lente e la parete dell'occhio attraversata dalle fibre zonulari.
   3. Lavare gli occhi per 10 minuti in PBS. Usando le forbici chirurgiche oftalmiche e lavorando sotto uno stereomicroscopio, fai un'incisione a tutto spessore nella parete dell'occhio vicino alla testa del nervo ottico.
   4. Estendere il taglio in avanti fino all'equatore e quindi intorno alla circonferenza equatoriale dell'occhio. Fare attenzione a risparmiare i delicati processi ciliari e le fibre zonulari associate.
   5. Rimuovere il retro del globo, esponendo la superficie posteriore della lente.
   6. Utilizzare la pinza per rimuovere un occhio sezionato dalla soluzione tampone e posizionarlo su una salvietta asciutta con la cornea rivolta verso il basso. Trascinare delicatamente la cornea sulla superficie della salvietta per asciugarla.
   7. Aggiungere 3 μL di colla istantanea ai pozzetti della piattaforma che ospiteranno l'occhio nella capsula di Petri.
   8. Posizionare il piatto sulla piastra del palco dello stereomicroscopio in modo che il pozzo con la colla sia in vista.
   9. Trasferire l'occhio dalla salvietta al bordo del pozzetto che contiene la colla. Quindi, trascina con attenzione l'occhio nel pozzo e regola rapidamente il suo orientamento in modo che la parte posteriore dell'obiettivo sia più in alto.
   10. Asciugare il lato esposto della lente tamponandola delicatamente con l'angolo di una salvietta asciutta.
   11. Applicare un tampone di colla istantanea sul fondo di una piastra di Petri da 50 mm e cementare la piattaforma ad esso.
2. Misurazione della risposta viscoelastica zonulare
   1. Accendere la bilancia, avviare il programma di registrazione della bilancia e il software della fotocamera. Assicurarsi che il programma di registrazione possa acquisire dati per 30 minuti, poiché alcune prove possono durare così a lungo.
   2. Accendere il controller del servomotore e avviare l'applicazione del controller sul computer. Assicurarsi che il controller sia impostato per muoversi con incrementi di 50 μm utilizzando parametri di movimento simili a quelli descritti nella NOTA nel passaggio 1.2.2.
   3. Create una piegatura di 90° in un'asta capillare come descritto al punto 1.1.1.
   4. Far scivolare il capillare piegato nel portasonda capillare e stringere le viti di fissaggio.
      NOTA: per ridurre al minimo la disidratazione del campione, si consiglia di completare i passaggi da 1 a 4 prima o durante la dissezione oculare.
   5. Aggiungere una piccola perla (~ 1 mm) di colla a polimerizzazione UV sulla punta del capillare.
   6. Utilizzando le regolazioni manuali sul manipolatore, spostare la punta della sonda capillare in modo che sia direttamente sopra il centro dell'obiettivo. Verificare se la parte inferiore della colla UV appare centrata sopra la parte superiore dell'obiettivo se vista dalla parte anteriore (mediante ispezione visiva) e laterale (attraverso la fotocamera del microscopio).
   7. Mentre si guarda attraverso la fotocamera, abbassare la punta della sonda fino a quando la colla UV non entra in contatto con l'obiettivo e copre da un terzo a metà della sua superficie superiore.
   8. Utilizzare una sorgente luminosa UV (380-400 nm) a bassa intensità (~ 1 mW), direzionale e quasi visibile per polimerizzare la colla.
      NOTA: queste specifiche sono sufficienti per polimerizzare la colla in pochi secondi riducendo al minimo il potenziale di indurre la reticolazione proteica. Le sorgenti di luce UV fornite con penne per colla UV commerciali soddisfano queste specifiche.
   9. Aggiungere la soluzione pbs al piatto fino a quando l'occhio è coperto da liquido ad una profondità di almeno 2 mm.
   10. Posizionare la lente cilindrica davanti al microscopio di ispezione e il più vicino possibile alla capsula di Petri senza toccarla.
   11. Avviare contemporaneamente il programma di registrazione e un programma timer. Scatta una foto dell'occhio / sonda usando la fotocamera.
   12. Dopo 60 s, iniziare un altro spostamento di 50 μm, e successivamente ogni 60 s fino a quando l'esperimento è completo, cioè fino a quando tutte le fibre sono state rotte. Si noti che il segnale non tornerà ai livelli basali a causa dell'evaporazione del buffer durante l'esperimento. Correggere la deriva che ne deriva nelle letture durante l'analisi dei dati, come esemplificato nel passaggio 2.2.14.
   13. Al termine di un'esecuzione, salvare i dati di registrazione della scala ed esportarli in un formato compatibile con il foglio di calcolo, ad esempio un formato .csv. Salvare le immagini dell'obiettivo raccolte durante la corsa.
   14. Importare i dati in un foglio di calcolo. Utilizzare la prima e l'ultima lettura della scala per interpolare la deriva nella lettura di fondo nel tempo dovuta all'evaporazione (vedere la Figura 3). Sottrarre la lettura interpolata dalla lettura in ogni punto temporale.
       NOTA: se si utilizza un foglio di calcolo, l'interpolazione può essere eseguita automaticamente inserendo la formula = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 nella cella a destra della prima lettura della scala, quindi spostando il cursore nell'angolo destro inferiore della cella e trascinandolo verso il basso fino all'ultimo valore di dati. La formula presuppone che i dati siano organizzati in una colonna con il primo punto dati visualizzato nella cella B2. Se lo si desidera, i dati elaborati nella fase 2.2.14 possono essere analizzati con il modello viscoelastico quasi elastico sviluppato da uno dei coautori, il Dr. Matthew ^Riley4.

Risultati

La tecnica di pull-up qui descritta fornisce un approccio semplice per determinare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi. In breve, l'occhio del topo viene prima preservato mediante iniezione di un fissativo alla pressione intraoculare fisiologica. Questo approccio mantiene l'inflazione naturale dell'occhio e mantiene le fibre correttamente pretensionate (la fissazione è stata ritenuta accettabile dopo che esperimenti preliminari hanno dimostrato che non alterava significativamente l'elasticità o l...

Discussione

La zonula è un insolito sistema ECM in cui le fibre sono disposte simmetricamente e possono essere manipolate in modo identico spostando la lente dell'occhio lungo l'asse ottico. Lo spazio può anche essere facilmente accessibile senza interruzioni cellulari, consentendo alle fibre di essere studiate in un ambiente vicino al loro stato nativo. La tecnica pull-up sfrutta questa presentazione ECM per manipolare le fibre delicate dei topi, un sistema geneticamente trattabile, e quantificare con precisione le loro propriet?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon