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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo riporta un'inibizione in vivo di CENP-E attraverso la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare di GSK923295, un valido modello per la divisione meiotica maschile. Utilizzando i saggi di immunofluorescenza, citometria a flusso e microscopia elettronica a trasmissione, dimostriamo che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e instabilità del genoma negli spermatociti di topo.

Abstract

Negli eucarioti, la meiosi è essenziale per la stabilità del genoma e la diversità genetica nella riproduzione sessuale. Le analisi sperimentali degli spermatociti nei testicoli sono fondamentali per le indagini sull'assemblaggio del fuso e sulla segregazione cromosomica nella divisione meiotica maschile. Lo spermatocita di topo è un modello ideale per gli studi meccanicistici della meiosi, tuttavia mancano metodi efficaci per l'analisi degli spermatociti. In questo articolo, viene riportato un metodo pratico ed efficiente per l'inibizione in vivo della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti di topo. Viene presentata una procedura dettagliata per l'iniezione testicolare di un inibitore specifico GSK923295 attraverso la chirurgia addominale in topi di 3 settimane. Inoltre, qui descritti una serie di protocolli per la raccolta e la fissazione dei tessuti, la colorazione dell'ematossina-eosina, l'immunofluorescenza, la citometria a flusso e la microscopia elettronica a trasmissione. Qui presentiamo un modello di inibizione in vivo tramite chirurgia addominale e iniezione testicolare, che potrebbe essere una tecnica potente per studiare la meiosi maschile. Dimostriamo anche che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e arresto della metafase negli spermatociti primari durante la meiosi I. Il nostro metodo di inibizione in vivo faciliterà gli studi meccanicistici della meiosi, servirà come metodo utile per le modificazioni genetiche delle linee germinali maschili e farà luce sulle future applicazioni cliniche.

Introduzione

La meiosi è uno degli eventi evolutivi evolutivi più importanti, altamente rigidi negli organismi eucariotici, ed è essenziale per la gametogenesi, la riproduzione sessuale, l'integrità del genoma e la diversità genetica 1,2,3. Nei mammiferi, le cellule germinali subiscono due divisioni cellulari successive, meiosi I e II, dopo un singolo ciclo di replicazione del DNA. A differenza dei cromatidi fratelli nella mitosi, i cromosomi omologhi duplicati si accoppiano e si segregano in due cellule figlie durante la meiosi I 4,5. Nella meiosi II, i cromatidi fratelli si separano e si segregano per formare gameti aploidi senza replicazione del DNA6. Errori in una delle due divisioni meiotiche, inclusi difetti di assemblaggio del fuso e missegregazione cromosomica, possono causare la perdita di gameti, sterilità o sindromi aneuploidie 7,8,9.

Studi cumulativi hanno dimostrato che i motori della famiglia delle chinesine svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell'allineamento e della segregazione cromosomica, nell'assemblaggio del fuso, nella citochinesi e nella progressione del ciclo cellulare sia nelle cellule mitotiche che meiotiche10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (proteina Centromero E) è un motore cinetocoro plus-end-directed richiesto per la congressualità cromosomica, il trasporto e l'allineamento cromosomico e la regolazione del checkpoint di assemblaggio del fuso nella mitosi 13,14,15,16,17,18. Durante la meiosi, l'inibizione di CENP-E da parte dell'inibitore specifico porta GSK923295 all'arresto del ciclo cellulare, al disallineamento cromosomico, alla disorganizzazione del fuso e all'instabilità del genoma nelle cellule spermatogeniche19. I modelli di localizzazione e la dinamica di CENP-E nei centromeri degli spermatociti in divisione indicano che CENP-E interagisce con le proteine cinetocore per l'assemblaggio sequenziale dei centromeri durante la meiosi I20,21. Negli ovociti, la CENP-E è necessaria per l'allineamento cromosomico e il completamento della meiosi I13,22,23. L'iniezione di anticorpi o morfolino di CENP-E provoca cromosomi disallineati, orientamento anomalo dei cinetochi e arresto della meiosi I sia negli ovociti di topo che di Drosophila 23. Rispetto ai ruoli essenziali di CENP-E nella mitosi, le funzioni e i meccanismi di CENP-E nella meiosi rimangono in gran parte sconosciuti. I meccanismi dettagliati di CENP-E nel congresso cromosomico e la stabilità del genoma nelle cellule meiotiche maschili devono ancora essere chiariti.

La spermatogenesi è un processo fisiologico complesso e di lunga durata, che coinvolge la proliferazione sequenziale degli spermatogoni, la meiosi e la spermiogenesi. Pertanto, l'intero processo è straordinariamente difficile da riprodurre in vitro nei mammiferi e in altre specie24,25. È impossibile indurre la differenziazione degli spermatociti dopo lo stadio di pachitene in vitro. Gli studi sulle divisioni meiotiche maschili sono stati generalmente limitati ad analisi sperimentali della profase meiotica precoce25,26. Nonostante molti sforzi tecnologici, tra cui la coltura a breve termine degli spermatociti27,28 e i metodi di coltura degli organi25, ci sono pochi metodi efficaci per studiare la divisione meiotica maschile. Inoltre, la delezione genetica di geni essenziali di solito provoca l'arresto dello sviluppo e la letalità embrionale. Ad esempio, gli embrioni di topo privi di CENP-E non riescono a impiantarsi e non possono svilupparsi oltre l'impianto29, che è un ostacolo negli studi meccanicistici di CENP-E nella meiosi. Nel complesso, stabilire un sistema pratico e fattibile per studiare la divisione meiotica maschile può promuovere notevolmente il campo di ricerca della meiosi.

L'inibitore permeabile alle piccole cellule è un potente strumento per studiare i motori della chinesina nella divisione cellulare e nei processi di sviluppo. L'inibitore allosterico, GSK923295, si lega specificamente al dominio motorio CENP-E, blocca il rilascio di ADP (adenosina difosfato) e infine stabilizza le interazioni tra CENP-E e microtubuli30. In questo studio, un modello murino di inibizione in vivo viene presentato attraverso la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare di GSK923295. L'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico nella metafase I degli spermatociti primari. Inoltre, l'inibizione del CENP-E porta all'arresto meiotico degli spermatociti e all'interruzione della spermatogenesi. Una serie di protocolli sono descritti per l'analisi degli spermatociti e possono essere applicati per osservare microtubuli meiotici fuso, cromosomi omologhi e organelli subcellulari negli spermatociti. Il nostro metodo di inibizione in vivo è un metodo efficace per lo studio della divisione meiotica e della spermatogenesi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la Fujian Medical University (numero di protocollo SYXK 2016-0007). Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida pertinenti della cura e dell'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (numero di pubblicazioni NIH 8023, riviste nel 1978).

1. Costruzione di modelli murini di inibizione CENP-E mediati da GSK923295

  1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici a 121 °C per 30 minuti. Irradiare il banco di lavoro chirurgico ultra-pulito con ultraviolet-C (UVC) per 2 ore. Pesare i topi maschi ICR (Institute of Cancer Research) di 3 settimane utilizzati per gli esperimenti e calcolare le dosi di anestetico necessarie.
  2. Anestetizzare i topi somministrando una combinazione di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale. Controllare la profondità dell'anestesia dei topi attraverso una combinazione di riflesso corneale del topo, riflesso nocicettivo, respirazione e tono muscolare. Confermare che i topi sono profondamente anestetizzati.
    NOTA: Posizionare l'animale su una piastra elettrica per fornire supporto termico durante l'intervento.
  3. Legare gli arti del topo e fissarli sul vassoio di cera. Metti una goccia di unguento veterinario sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Radere i peli addominali del topo dall'addome inferiore allo scroto usando un rasoio animale sperimentale. Fissare l'area chirurgica con un drappeggio sterile.
  4. Disinfettare l'addome ventrale con uno scrub Betadine seguito da etanolo al 75% tre volte. Aprire la cavità addominale usando un bisturi sterile e fare un'apertura di <5 mm.
  5. Bloccare la pelle con morsetti chirurgici sterili e tirare il cuscinetto di grasso epididimo con pinze da dissezione sterili per localizzare i testicoli usando una pinzetta sterile. Fissare il testicolo con una pinza sterile sotto uno stereoscopio e iniettare lentamente 10 μL di GSK923295 nei tubuli seminiferi ad una concentrazione finale di 10 μM usando 10 μL di reodina30. Per la costruzione del gruppo di controllo, iniettare 10 μL di soluzione all'1% di DMSO (dimetil solfossido)/PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
    NOTA: Conservare la soluzione GSK923295 ad una concentrazione di 10 mM a -80 °C. Sciogliere 0,1 μL di 10 mM GSK923295 in 100 μL di soluzione PBS per preparare i 10 μM di soluzione GSK923295.
  6. Spingere delicatamente il testicolo nella cavità addominale con una pinza chirurgica sterile. Suturare il peritoneo e la pelle separatamente con due o quattro punti utilizzando la linea di sutura con un diametro di 0,1 mm.
  7. Etichettare un posto di 3 x 3 mm sul dorso dell'animale con un pennarello permanente dopo l'intervento chirurgico addominale, rimettere il topo nella gabbia di alimentazione e garantire un ambiente pulito e privo di agenti patogeni con cibo e acqua sufficienti.
  8. Mantenere l'ambiente in uno stato sterile attraverso l'aria filtrata, il cibo sterilizzato e l'acqua. Prenditi cura dell'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale. Per l'analgesia post-operatoria, somministrare una dose di buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per 3 giorni. Assicurarsi che il topo non venga restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito.
    NOTA: I topi ricevono cure postoperatorie e somministrano in modo appropriato alla ferita anestesia locale utilizzando lo 0,5% di lidocaina per ridurre il dolore postoperatorio quando necessario.

2. Colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) e istopatologia

  1. Quattro giorni dopo l'intervento chirurgico addominale, eutanasia i topi con CO 2 ad una portata di 2 L / min in una camera CO2. Confermare la morte per lussazione cervicale come metodo di conferma dell'eutanasia. Utilizzare le forbici chirurgiche per aprire lo scroto e rimuovere i testicoli con una pinza. Raccogliere i testicoli di topo 4 giorni dopo GSK923295 iniezione e fissarli in 30 ml di soluzione di formaldeide al 10% a temperatura ambiente per 12 ore.
  2. Per la disidratazione del gradiente, incubare sequenzialmente il campione in 40 ml di etanolo al 70% per 1 ora, in 40 ml di etanolo all'85% per 1 ora, in 40 ml di etanolo al 95% per 1 ora e in 40 ml di etanolo al 100% per 1 ora.
  3. Incubare il campione in 40 mL di xilene per 40 minuti, quindi in 40 mL di paraffina per 1 ora a 65 °C. Posizionare i tessuti nella parte inferiore della scatola di incorporamento. Aggiungere la paraffina fusa nella scatola di incorporamento. Raffreddare i tessuti per una completa solidificazione a 4 °C per 6 ore.
  4. Fissare i campioni sul supporto dell'ultramicrotomo, mantenere l'angolo tra i campioni e la superficie del coltello a 5-10° e regolare lo spessore della fetta a 5 μm. Preparare le sezioni spesse 5 μm utilizzando un ultramicrotomo, distribuire i vetrini a bagnomaria a 40 °C e asciugare le sezioni in un essiccatore per vetrini per 12 ore a 37 °C.
  5. Incubare i vetrini in 200 ml di xilene per 40 minuti, in 200 ml di etanolo al 100% per 6 minuti, in 200 ml di etanolo al 95% per 2 minuti, in 200 ml di etanolo al 90% per 2 minuti, in 200 ml di etanolo all'80% per 2 minuti e in 200 ml di etanolo al 70% per 2 minuti, rispettivamente.
  6. Risciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti e colorarli con la soluzione di ematossilina di Mayer per 6 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Soluzione di ematossilina di Mayer: 0,011 mol / L di ematossilina, etanolo anidro al 6,7%, solfato di potassio di alluminio 0,646 mol / L e iodato di sodio 0,003 mol / L.
  7. Risciacquare i vetrini in acqua corrente per 5 minuti e incubare con acqua distillata per 2 minuti.
  8. Incubare i vetrini in etanolo cloridrato all'1% per 3 s, quindi sciacquarli in acqua corrente per 2 minuti.
  9. Colorare il campione con eosina all'1% per 15 s, quindi incubarli con etanolo al 95% per 5 s, con etanolo al 100% per 2 minuti e in xilene per 40 minuti.
  10. Sigillare i vetrini utilizzando 15 μL di gomma neutra e la slitta di copertura 24 x 50 mm.

3. Immunofluorescenza e microscopia confocale

  1. Raccogliere le sezioni di paraffina spesse 5 μm dei testicoli di topo per l'immunofluorescenza. Incubare i vetrini in xilene per 40 minuti, in etanolo al 100% per 6 minuti, in etanolo al 95% per 2 minuti, in etanolo al 90% per 2 minuti, in etanolo all'80% per 2 minuti e in etanolo al 70% per 2 minuti. Risciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti e sciacquare i vetrini con 0,01 M PBS per 5 minuti.
  2. Posizionare i vetrini nella soluzione di prelievo dell'antigene (tampone citrato 0,01 M) e far bollire ad alta pressione utilizzando una pentola a pressione per 4 minuti per il recupero dell'antigene. Raffreddare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente. Risciacquare con acqua distillata per 5 minuti due volte e con PBS per 5 minuti.
    NOTA: 0,01 M tampone citrato (pH 6,0): 2,1 mmol/L di acido citrico, 11,6 mmol/L di citrato trisodico diidrato.
  3. Permeabilizzare le cellule incubando i vetrini in 500 μL di TritonX-100/PBS allo 0,25% per 10 minuti. Risciacquare i vetrini con PBS per 5 minuti tre volte.
  4. Per il blocco dell'antigene, incubare i campioni con 300 μL di albumina sierica bovina al 3% (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 in PBS) per 1 ora. Incubare i campioni con gli anticorpi primari in 3% BSA/PBST per 16 ore a 4 °C. Metti i vetrini in una scatola umidificata per evitare che i tessuti si secchino. Riscaldare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente per 30 minuti.
  5. Eliminare l'anticorpo primario, quindi risciacquare i vetrini in PBST per 5 minuti tre volte. Anticorpi secondari diluiti in BSA/PBST al 3%. Incubare i campioni con anticorpi secondari per 1-2 ore a 37 °C. Risciacquare i campioni in PBST per 5 minuti cinque volte.
  6. Colorare i nuclei con 50 μL di 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti a temperatura ambiente. Montare il coprislip con il supporto di montaggio anti-sbiadimento e sigillare il coprislip con lo smalto.
  7. Osservare e registrare i segnali fluorescenti nei vetrini utilizzando un microscopio fluorescente dotato di un obiettivo NA 40x/ 0,75.

4. Citometria a flusso

  1. Raccogliere i testicoli di topo in piastre di Petri da 6 cm e tagliare i testicoli in 1 mm3 pezzi usando forbici chirurgiche.
  2. Digerire i testicoli utilizzando 1 mL di collagenasi all'1% in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per 10 minuti a 37 °C, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti per precipitare le cellule spermatogene.
  3. Eliminare il surnatante e quindi aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (acido etilene diamminotetraacetico) allo 0,25% per 20 minuti a 37 °C, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti.
  4. Scartare il surnatante e quindi incubare le cellule precipitate con 1 ml di etanolo freddo al 70% per più di 8 ore a 4 °C.
  5. Centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti, quindi raccogliere i sedimenti cellulari. Colorare le cellule spermatogeniche con 500 μL di soluzione colorante di ioduro di propidio (PI) (50 μg/mL PI, 100 μg/mL RNasi A e 0,2% Triton X-100 in PBS) a 37 °C per 30 min.
    NOTA: agitare delicatamente la provetta da centrifuga ogni 5 minuti per evitare aggregazioni cellulari.
  6. Filtrare i campioni utilizzando uno schermo a maglie 300 per eliminare i detriti cellulari; raccogliere le cellule in un tubo di flusso e conservarle a 4 °C.
  7. Rilevare segnali di fluorescenza e diffusione della luce alla lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm utilizzando un citometro a flusso. Analizza il contenuto di DNA e la diffusione della luce utilizzando il software Modfit MFLT32.

5. Microscopia elettronica a trasmissione

  1. Tagliare i testicoli in 1 mm 3 pezzi usando il bisturi affilato e incubare rapidamente i campioni con una soluzione di glutaraldeide-paraformaldeide al3 % all'1,5% in 0,1 M PBS (pH 7,2) per 4 ore a 4 °C per evitare i cambiamenti di ultrastruttura. Risciacquare i campioni con 0,1 M PBS per 5 minuti tre volte.
    NOTA: Il bisturi e le forbici devono essere affilati e cercare di evitare spremiture e tiri artificiali. La lavorazione dei campioni deve essere effettuata nel fluido di fissazione.
  2. Fissare i campioni in una soluzione di acido osmico all'1% - ferrocianuro di potassio all'1,5% a 4 °C per 1,5 ore. Asciugare l'acqua con carta da filtro e sciacquare i campioni con 0,1 M PBS per 5 minuti tre volte.
  3. Disidratare i campioni in 40 ml di etanolo al 50% per 10 minuti a 4 °C. Incubare i campioni in 40 mL di colorante acetato di uranio saturo di etanolo al 70% a 4 °C per 12 ore, in 40 mL di etanolo al 90% per 10 min a 4 °C, in 40 mL di etanolo-acetone al 90% per 10 min a temperatura ambiente e in 40 mL di acetone anidro per 10 min tre volte a temperatura ambiente.
  4. Incubare i campioni in una miscela di agenti incorporanti acetone-resina epossidica 618 anidro (v / v = 1: 1) per 1,5 h, quindi incorporare i campioni in resina epossidica 618 agenti incorporanti a 35 ° C per 3 ore.
  5. Per la polimerizzazione della resina, incubare i campioni in resina epossidica 618 agenti incorporanti a 35 °C per 12 h, a 45 °C per 12 h e quindi a 60 °C per 24 h.
  6. Installare i campioni e il coltello di vetro, quindi regolare le distanze tra i campioni e il coltello. Preparare le sezioni ultrasottili spesse 90 nm utilizzando un microtomo ultrasottile. Tagliare i campioni a velocità costante, quindi posizionare i vetrini su una rete di nichel. Posizionare i vetrini in una capsula di Petri a temperatura ambiente.
  7. Colorare i vetrini con acetato di uranile al 2% per 10 minuti, quindi colorare i campioni con citrato di piombo al 2% per 10 minuti. Risciacquare i vetrini con acqua distillata. Asciugare i vetrini per 24 ore a temperatura ambiente.
  8. Osservare le diapositive e registrare immagini di elettroni a 70-100 kV utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.

Risultati

Abbiamo costruito con successo un modello di inibizione CENP-E in vivo di testicoli murini attraverso chirurgia addominale e iniezione testicolare di GSK92329519. I passaggi tecnici chiave di questo metodo sono stati illustrati nella Figura 1. Dopo l'iniezione testicolare di GSK923295 per 4 giorni, i testicoli sono stati raccolti per ulteriori analisi. Nel gruppo di controllo, l'onda spermatogena nei tubuli seminiferi era regolare e organizzata (

Discussione

In questo studio, abbiamo stabilito un modello di inibizione CENP-E in vivo dei testicoli di topo utilizzando la chirurgia addominale e la microiniezione di GSK923295. La chirurgia addominale e il metodo di iniezione testicolare utilizzati in questo studio presentano i seguenti vantaggi. Innanzitutto, non è limitato all'età dei topi. Gli sperimentatori possono eseguire l'iniezione testicolare in una fase precoce, ad esempio su topi di 3 settimane o più giovani. In secondo luogo, GSK923295 ha un effetto inibit...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Citoscheletro presso la Fujian Medical University per le utili discussioni. Ringraziamo Jun-Jin Lin del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per l'assistenza tecnica nella citometria a flusso. Ringraziamo Ming-Xia Wu e Lin-Ying Zhou dell'Electron Microscopy Lab del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per l'assistenza tecnica nella microscopia elettronica. Ringraziamo Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke e Jun Song del Centro di insegnamento sperimentale di scienze mediche di base presso la Fujian Medical University per il loro supporto. Questo studio è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, Cina (numero di sovvenzione 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (numero di sovvenzione 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (numero di sovvenzione 2017XQ1001), Fujian Medical University progetto di finanziamento di alto livello per la ricerca scientifica (numero di sovvenzione XRCZX2017025) e Progetto di ricerca di formazione online e insegnamento di studenti laureati in medicina cinese (numero di sovvenzione B-YXC20200202-06).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SyringeSeveral commercial brands availableSterile.
1.5 mL Centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
50 mL Centrifuge TubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009164
tubulin rabbit polyclonal antibodyBeyotimeAF0001For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibodyAbcamab267372For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibodySangon BiotechD110022For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibodyAbcamab175191For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibodyBeyotimeA0423Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Bovine Serum AlbuminSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
CentrifugeEppendorf5424BK745380
Chloral hydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Citric acidShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
CollagenaseSangon BiotechA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Dye vatSeveral commercial brands available91347802
Eosin Y, alcohol solubleSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009318
Formaldehyde - aqueous solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoxylin, anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71020784
ICR mouseShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotomeLeica
Leica EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseFor analysis of flow cytometry results.
Nail polishSeveral commercial brands available
Neutral gumSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10004160
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Picric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μl rheodyne
Sliced paraffinSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69019461
Sodium iodateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80117214
Surgical instrumentsSeveral commercial brands availableFor abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscopeFEITecnai G2
Trisodium citrate dihydrateShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30188928Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30189328Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10023418

Riferimenti

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