Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Riepilogo

Questo articolo descrive come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione crio-EM, ovvero cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati a particella singola per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Abstract

I recenti progressi sia nella strumentazione che nel software di elaborazione delle immagini hanno reso la microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) il metodo preferito dai biologi strutturali per determinare strutture ad alta risoluzione di un'ampia varietà di macromolecole. Diverse suite software sono disponibili per utenti nuovi ed esperti per l'elaborazione delle immagini e il calcolo della struttura, che semplificano lo stesso flusso di lavoro di base: i filmati acquisiti dai rilevatori al microscopio vengono sottoposti a correzione per la stima del movimento indotto dal fascio e della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). Successivamente, le immagini delle particelle vengono selezionate ed estratte dai fotogrammi di filmato medi per la classificazione iterativa 2D e 3D, seguita da ricostruzione, perfezionamento e convalida 3D. Poiché vari pacchetti software impiegano algoritmi diversi e richiedono diversi livelli di esperienza per funzionare, le mappe 3D che generano spesso differiscono per qualità e risoluzione. Pertanto, gli utenti trasferiscono regolarmente i dati tra una varietà di programmi per risultati ottimali. Questo documento fornisce una guida per gli utenti per navigare in un flusso di lavoro attraverso i pacchetti software più diffusi: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una struttura di risoluzione quasi atomica del virus adeno-associato (AAV). Per prima cosa dettagliamo una pipeline di elaborazione delle immagini con cryoSPARC v3, poiché i suoi algoritmi efficienti e la GUI facile da usare consentono agli utenti di arrivare rapidamente a una mappa 3D. Nella fase successiva, utilizziamo PyEM e script interni per convertire e trasferire le coordinate delle particelle dalla migliore qualità di ricostruzione 3D ottenuta in cryoSPARC v3 a RELION-3 e Scipion 3 e ricalcolare le mappe 3D. Infine, delineiamo i passaggi per un ulteriore perfezionamento e convalida delle strutture risultanti integrando algoritmi di RELION-3 e Scipion 3. In questo articolo, descriviamo come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Introduzione

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) e l'analisi a singola particella (SPA) consentono la determinazione della struttura di un'ampia varietà di assemblaggi biomolecolari nel loro stato idratato, contribuendo a illuminare i ruoli di queste macromolecole nei dettagli atomici. I miglioramenti nell'ottica del microscopio, nell'hardware del computer e nel software di elaborazione delle immagini hanno permesso di determinare le strutture delle biomolecole con una risoluzione superiore a 2 ^Å1,2,3. Più di 2.300 strutture crio-EM sono state depositate nella Protein Data Bank (PDB) nel 2020, rispetto alle 192 strutture del 20144, indicando che la crio-EM è diventata il metodo di scelta per molti biologi strutturali. Qui descriviamo un flusso di lavoro che combina tre diversi programmi SPA per la determinazione della struttura ad alta risoluzione (Figura 1).

L'obiettivo di SPA è quello di ricostruire i volumi 3D di un campione bersaglio da immagini 2D rumorose registrate da un rilevatore al microscopio. I rilevatori raccolgono immagini come filmati con singoli fotogrammi dello stesso campo visivo. Al fine di preservare il campione, i fotogrammi vengono raccolti con una bassa dose di elettroni e quindi hanno uno scarso rapporto segnale-rumore (SNR). Inoltre, l'esposizione elettronica può indurre movimento all'interno delle griglie crio-EM vetrificate, con conseguente sfocatura dell'immagine. Per superare questi problemi, i fotogrammi sono allineati per correggere il movimento indotto dal fascio e mediati per produrre una micrografia con un SNR aumentato. Queste micrografie vengono quindi sottoposte a stima della funzione di trasferimento del contrasto (CTF) per tenere conto degli effetti della sfocatura e delle aberrazioni imposte dal microscopio. Dalle micrografie corrette CTF, le singole particelle vengono selezionate, estratte e ordinate in medie di classe 2D che rappresentano diversi orientamenti adottati dal campione nel ghiaccio vitreo. L'insieme omogeneo di particelle risultante viene utilizzato come input per la ricostruzione 3D ab initio per generare uno o più modelli grossolani, che vengono poi perfezionati iterativamente per produrre una o più strutture ad alta risoluzione. Dopo la ricostruzione, vengono eseguiti perfezionamenti strutturali per migliorare ulteriormente la qualità e la risoluzione della mappa crio-EM. Infine, o un modello atomico è direttamente derivato dalla mappa, o la mappa è dotata di coordinate atomiche ottenute altrove.

Sono disponibili diversi pacchetti software per eseguire le attività sopra descritte, tra cui ^Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, ^EMAN8, ^IMAGIC9, ^RELION10, ^Scipion11, ^SPIDER12, Xmipp13 e altri. Mentre questi programmi seguono fasi di elaborazione simili, impiegano algoritmi diversi, ad esempio, per selezionare particelle, generare modelli iniziali e perfezionare le ricostruzioni. Inoltre, questi programmi richiedono un livello variabile di conoscenza e intervento dell'utente per funzionare, in quanto alcuni dipendono dalla messa a punto dei parametri che possono fungere da ostacolo per i nuovi utenti. Queste discrepanze spesso si traducono in mappe con qualità e risoluzione incoerenti tra le ^{piattaforme14}, spingendo molti ricercatori a utilizzare più pacchetti software per perfezionare e convalidare i risultati. In questo articolo, evidenziamo l'uso di cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di AAV, un vettore ampiamente utilizzato per la terapia ^genica15. I suddetti pacchetti software sono gratuiti per gli utenti accademici; cryoSPARC v3 e Scipion 3 richiedono licenze.

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Protocollo

1. Creazione di un nuovo progetto cryoSPARC v3 e importazione dei dati

NOTA: I dati sono stati acquisiti presso l'Oregon Health and Science University (OHSU) di Portland utilizzando un microscopio elettronico Titan Krios da 300 kV dotato di un rivelatore di elettroni diretti Falcon 3. Le immagini sono state raccolte in modalità di conteggio con una dose totale di 28,38 e⁻/^Å2 frazionata su 129 fotogrammi e un intervallo di sfocatura da -0,5 μm a -2,5 μm, con una dimensione dei pixel di 1,045 Å utilizzando ePU. Il campione di AAV-DJ è stato fornito dallo staff di OHSU.

1. Aprire cryoSPARC v3 in un browser Web e fare clic sull'intestazione Progetti . Seleziona + Aggiungi per creare un nuovo progetto. Intitolare il progetto di conseguenza e fornire un percorso a una directory esistente in cui verranno salvati i processi e i dati.
2. Creare un'area di lavoro per il progetto aprendo il progetto, facendo clic su + Aggiungi e selezionando Nuova area di lavoro. Assegna un titolo all'area di lavoro e fai clic su Crea.
3. Passare alla nuova area di lavoro e aprire Job Builder nel pannello di destra. Questa scheda visualizza tutte le funzioni disponibili in cryoSPARC v3. Fare clic su Importa filmati e fornire il percorso dei filmati, ottenere il percorso del file di riferimento e impostare i parametri di acquisizione come segue: Raw Pixel Size 1.045 Å, Accelerating Voltage 300 kV, Spherical Aberration 2.7 mm, Total Exposure Dose 28.38 e^-/Å^2.
4. Fare clic su Coda, selezionare una corsia per eseguire il processo e un'area di lavoro e fare clic su Crea.
   NOTA: I parametri di acquisizione dipendono dal campione e dal microscopio.

2. CryoSPARC v3 - allineamento del film e stima CTF

1. Aprire Patch Motion Correction (Multi). Questo processo richiede i filmati importati nel passaggio 1.3 come input. Aprire la scheda processo Importa filmati nell'area di lavoro e trascinare l'output Imported_movies nel segnaposto filmati nel nuovo processo. Accodare il processo.
   NOTA: per ulteriori informazioni sui metodi cryoSPARC descritti in questo articolo, vedere il tutorial ^cryoSPARC16.
2. Per eseguire la stima CTF, aprire Patch CTF Estimation (Multi). Immettere le micrografie generate nel passaggio 2.1 e accodare il processo.
3. Per ispezionare le micrografie mediate e corrette da CTF e selezionare un sottoinsieme per un'ulteriore elaborazione, aprire Curate Exposures e inserire le esposizioni ottenute nel passaggio 2.2. Accodare il processo.
4. Dopo che il processo è entrato in modalità di attesa , fare clic sulla scheda Interazione nella scheda del processo, regolare le soglie dei parametri e accettare o rifiutare singole micrografie per un'ulteriore elaborazione. Accettare micrografie con CTF stimati e sperimentali ben abbinati (Figura 2) e scartare quelli con alto astigmatismo, scarsa vestibilità CTF e ghiaccio spesso.
5. Durante l'elaborazione dei dati correnti, impostare la soglia superiore di astigmatismo su 400 Å, la risoluzione CTF fit a 5 Å e lo spessore relativo del ghiaccio su 2. Fare clic su Fine per selezionare le micrografie per l'elaborazione a valle.

3. CryoSPARC v3 - picking di particelle manuale e basato su modelli

1. Aprire Selezione manuale, immettere le esposizioni accettate dai passaggi 2.4-2.5 e Accodare il processo. Fare clic sulla scheda Interattiva , impostare la dimensione della casella (px) su 300 e fare clic su alcune centinaia di particelle su più micrografie ed evitare di selezionare particelle sovrapposte. Qui sono state selezionate 340 particelle in 29 micrografie. Al termine, fai clic su Fine picking! Estrarre particelle.
   NOTA: questo protocollo utilizza il prelievo manuale delle particelle per generare modelli per la selezione automatica. Tuttavia, sono disponibili anche altri ^metodi17.
2. Per generare modelli per il prelievo automatico di particelle, fare clic su Classificazione 2D e inserire i prelievi di particelle generati nel passaggio 3.1. Modificare il numero di classi 2D in 10 e accodare il processo.
3. Apri Seleziona classi 2D. Inserisci le particelle e le medie di classe ottenute nel passaggio 3.2 e fai clic sulla scheda Interattiva . Seleziona le classi 2D rappresentative con un buon SNR e fai clic su Fine.
   NOTA: le medie di classe riflettono diverse viste delle particelle. Selezionare le medie di classe che riflettano ogni visualizzazione. L'obiettivo è quello di produrre modelli ben definiti che rappresentino diverse viste del campione per il picking automatizzato.
4. Aprire Selezione modelli e immettere le classi 2D selezionate nel passaggio 3.3 e le micrografie dei passaggi 2.4-2.5. Impostate diametro particelle (Å) su 220 Å e accodare il processo.
5. Per ispezionare i plettri automatici, aprire Seleziona prelievi particelle, immettere le particelle e le micrografie generate nel passaggio 3.4 e Accodare il processo.
6. Nella scheda di lavoro Seleziona prelievi particelle , fare clic sulla scheda Interattiva e impostare la dimensione della casella (px) su 300. Fare clic su una singola micrografia, regolare il filtro passa-basso fino a quando le particelle non sono chiaramente visibili e impostare la soglia di correlazione incrociata normalizzata (NCC) su 0,41 e la soglia di potenza tra 54000 e 227300 .
7. Ispezionare diverse micrografie e, se necessario, regolare le soglie in modo tale che la maggior parte delle particelle venga selezionata senza includere falsi positivi. Al termine, fai clic su Fine prelievo! Estrarre particelle.
   NOTA: le particelle vere hanno in genere un NCC e un punteggio di potenza elevati, che indicano che sono simili al modello e hanno un SNR elevato, rispettivamente.
8. Aprire Estratto da micrografie e inserire le micrografie e le particelle dal passaggio 3.7. Impostare la dimensione della casella estratta (px) su 300 e accodare il processo.

4. CryoSPARC v3 - Classificazione 2D

1. Fare clic su Classificazione 2D e inserire le particelle estratte dal passaggio 3.8. Impostare il numero di classi 2D su 50 e accodare il processo.
2. Per selezionare le migliori classi 2D per un'ulteriore elaborazione, apri Seleziona classi 2D. Immettere le particelle e le medie di classe ottenute nel passaggio 4.1. Fare clic sulla scheda Interattiva e scegliere le classi 2D in base alla risoluzione e al numero di particelle nella classe (Figura 3). Non selezionare classi contenenti elementi. Dopo aver selezionato, fare clic su Fine.
   NOTA: Di solito, sono necessari più cicli di classificazione 2D per rimuovere le particelle, che non convergono in classi distinte e ben definite. Eseguire tutti i cicli di classificazione 2D necessari per rimuovere tali particelle dal set di dati (Figura 3).

5. CryoSPARC v3 - ricostruzione ab-initio e affinamento omogeneo

1. Per generare un volume 3D iniziale, aprire Ab-initio Reconstruction e inserire le particelle ottenute nel passaggio 4.2 o dalla classificazione 2D finale. Regola la simmetria a icosaedrico. Accodare il processo.
   NOTA: la simmetria dipende dal campione e deve essere modificata di conseguenza. Se sconosciuto, utilizzare la simmetria C1.
2. Apri raffinamento omogeneo. Immettere il volume dal passaggio 5.1 e le particelle dalla 4.2 o dalla classificazione 2D finale. Modificare la simmetria e accodare il processo. Al termine del processo, ispezionare la curva FSC (Fourier Shell Correlation) e scaricare il volume da esaminare in UCSF ^Chimera18.

6. Esportare le coordinate delle particelle da cryoSPARC v3 e importarle in RELION-3 usando PyEM

NOTA: le coordinate delle particelle contengono informazioni sulla posizione delle singole particelle in ogni micrografia. Il trasferimento di coordinate invece di pile di particelle a RELION-3 consente di eseguire passaggi di perfezionamento che altrimenti non sarebbero disponibili. Ad esempio, la lucidatura delle particelle richiede l'accesso ai fotogrammi iniziali del filmato. Quindi, prima di esportare le coordinate delle particelle da cryoSPARC v3 a RELION-3, importare filmati ed eseguire la correzione del movimento e la stima CTF in RELION-3. Vedere il tutorial ^RELION-319 per i dettagli.

1. Passare alla directory del progetto RELION-3 e avviare RELION-3.
2. Aprire Importa dal browser di tipo job e specificare il percorso dei filmati e dei parametri di acquisizione come nel passaggio 1.3.
3. Per eseguire la correzione del movimento, utilizzare UCSF ^MotionCor220 tramite la GUI RELION-3, aprire Motion Correction e impostare i parametri predefiniti come nel manuale UCSF MotionCor2221. Immettere il percorso dei filmati importati nel passaggio 6.2. Nella scheda Movimento, specificate il percorso dell'eseguibile motioncor2.
   NOTA: MotionCor2 può essere eseguito in parallelo utilizzando più GPU.
4. Eseguire la stima CTF utilizzando CTFFIND-4.122 tramite la GUI RELION-3. Apri CTF Estimation e inserisci il file micrographs.star generato nel passaggio 6.3. Nella scheda CTFFIND-4.1, specificare il percorso dell'eseguibile CTFFIND-4.1 e impostare i parametri come nell'esercitazione RELION-3.119.
5. Per importare pile di particelle da cryoSPARC v3 a RELION-3, devono prima essere esportate da cryoSPARC v3. In cryoSPARC v3, aprire la scheda del processo di classe Select 2D dal passaggio 4.2 o dalla classificazione 2D finale. Nella scheda Dettagli , fare clic su Esporta processo. Esporta processo restituisce il file particles_exported.cs.
6. Prima di importare le coordinate delle particelle da cryoSPARC v3 a RELION-3, il file particles_exported.cs del passaggio 6.5 deve essere convertito in formato .star. Utilizzando ^PyEM23, convertire il file particles_exported.cs in formato .star eseguendo il seguente comando: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
7. In RELION-3, fare clic sulla scheda Prelievo manuale e sulla scheda I/O , immettere le micrografie dal perfezionamento CTF descritte nel passaggio 6.4. Nella scheda Display , immettere i seguenti parametri: Diametro particelle (A): 220, Filtro passa-basso (A): -1 , Scala per immagine CTF: 0.5. Eseguire il processo. Una directory denominata ManualPick viene generata nella cartella Inizio di RELION-3.
   NOTA: questo passaggio viene eseguito per creare una struttura di cartelle di prelievo manuale in RELION-3. Durante l'esecuzione del prelievo manuale, viene creato un singolo file .star contenente le coordinate delle particelle selezionate per ogni micrografia media utilizzata per il prelievo nella GUI RELION-3.
8. Passare alla cartella contenente il file particles_exported.star dal passaggio 6.6 ed eseguire uno script scritto in casa producendo un singolo file manualpick.star per ogni micrografia media utilizzata per il prelievo di particelle cryo-SPARC v3, che ha contribuito alla classificazione 2D finale esportata nel passaggio 6.5. I file di coordinate risultanti vengono salvati nella cartella ManualPick/Movies.
9. Tornate a RELION-3 e riaprite il processo di prelievo manuale . Clicca su Continua. Questo mostrerà le particelle precedentemente raccolte in cryoSPARC v3 nella GUI RELION-3. Ispezionare alcune micrografie per verificare se il trasferimento delle coordinate delle particelle è stato effettuato e se le particelle sono selezionate correttamente.

7. RELION-3 - Estrazione delle particelle e classificazione 2D

1. Fare clic su Estrazione particelle. Nella scheda I/O , immettere le micrografie corrette CTF dal passaggio 6.4 e le coordinate dal passaggio 6.9. Fare clic sulla scheda Estrai e modificare la dimensione della casella delle particelle (pix) in 300. Eseguire il processo.
2. Eseguire la classificazione 2D per pulire ulteriormente il set di particelle generato in cryoSPARC v3 per ottenere una ricostruzione ad alta risoluzione. Fare clic su Classificazione 2D e nella scheda I/O inserire il file particles.star generato nel passaggio 7.1. Nella scheda Ottimizzazione impostare il numero di classi su 50 e il diametro maschera (A) su 280. Eseguire il processo.
   NOTA: la maschera deve comprendere l'intera particella.
3. Per scegliere le migliori classi 2D, fare clic sul metodo subset selection , immettere il file _model.star dal passaggio 7.2 ed eseguire il processo. Selezionare le classi come descritto nel passaggio 4.2.
4. Ripetere i passaggi 7.2 e 7.3 per rimuovere le particelle non convergenti.

8. RELION-3 - Perfezionamento 3D, creazione di maschere e post-elaborazione

1. Utilizzare la mappa generata in cryoSPARC v3 (passaggio 5.2) come modello iniziale per il perfezionamento 3D in RELION-3. Selezionare il metodo Importa e impostare i seguenti parametri nella scheda I/O : Importa filmati/micrografie raw: No, File di input non elaborati: Filmati/*.mrc.
2. Fornire il file MTF e immettere i parametri di acquisizione del filmato come descritto nel passaggio 1.3. Nella scheda Altri selezionare la mappa cryoSPARC v3 come file di input, modificare tipo di nodo in riferimento 3D (.mrc) ed eseguire il processo.
3. Selezionare Perfezionamento automatico 3D e nella scheda I/O impostare Immagini di input come file particles.star dal passaggio 7.3 o dall'ultimo processo di selezione. Fornire la ricostruzione cryoSPARC v3 come mappa di riferimento. Fare clic sulla scheda Riferimento e modificare il filtro passa-basso iniziale (Å) in 50 e Simmetria in icosaedrico. Nella scheda Ottimizzazione modificare il diametro maschera (Å) su 280 ed eseguire il processo.
4. Al termine della corsa, apri run_class001.mrc in UCSF Chimera.
5. In UCSF Chimera, fai clic su Strumenti e in Dati volume seleziona Visualizzatore volume. Si aprirà una nuova finestra per regolare le impostazioni del volume. Impostare Step to 1 e regolare il dispositivo di scorrimento fino a raggiungere il valore di livello in cui la mappa non presenta alcun rumore. Registrare questo valore, in quanto verrà utilizzato per la creazione della maschera nel passaggio successivo.
6. La mappa prodotta dall'auto-raffinamento non riflette il vero FSC, poiché il rumore del solvente circostante riduce la risoluzione. Prima della post-elaborazione, creare una maschera per distinguere il campione dalla regione del solvente.
   1. Fare clic su Creazione maschera e inserire run_class001.mrc dal passaggio 8.3.
   2. Fare clic sulla scheda Maschera e regolare i parametri come segue: Mappa filtro passa-basso (Å): 10, Dimensione pixel (Å): 1.045, Soglia di binarizzazione iniziale: il valore di livello ottenuto nel passaggio 8.5, Estendi mappa binaria così tanti pixel: 3 e Aggiungi un bordo morbido di questi molti pixel: 3. Esegui il lavoro.
7. Esaminare la maschera in UCSF Chimera. Se la maschera è troppo stretta, aumentate Estendi mappa binaria di così tanti pixel e/o Aggiungete un bordo morbido di questo numero di pixel. È importante creare una maschera con bordi morbidi, poiché una maschera affilata può portare a un overfitting.
8. Fare clic su Post-Processing e nella scheda I/O , inserire le mezze mappe create nel passaggio 8.3 e mascherare dalla versione 8.6. Impostare la dimensione pixel calibrata su 1,045 Å. Nella scheda Nitidezza , inserisci quanto segue: Stima automaticamente il fattore B?: Sì, risoluzione più bassa per l'adattamento auto-B (A): 10, usa il tuo fattore B?: No. Nella scheda Filtro impostare Ignora ponderazione Fsc? su No. Eseguire il processo.

9. RELION-3 - Formazione per la lucidatura e la lucidatura delle particelle

1. Prima di correggere il movimento indotto dal fascio per particella, utilizzare la modalità di allenamento per identificare le tracce di movimento ottimali per il set di dati. Aprire Bayesian Polishing e nella scheda I/O inserire le micrografie corrette dal movimento dal passaggio 6.3, le particelle dal passaggio 8.3 e il file .star postprocesso dal passaggio 8.8. Fare clic sulla scheda Allenamento e impostare i seguenti parametri: Parametri ottimali del treno: Sì, Frazione di pixel di Fourier per il test: 0,5, Usa questo numero di particelle: 5000. Eseguire il processo.
   NOTA: questo script produrrà opt_params_all_groups.txt file nella cartella polacca RELION-3 contenente i parametri di lucidatura ottimizzati necessari per l'esecuzione del passaggio seguente.
2. Una volta terminato il lavoro di formazione, fai clic su Bayesian Polishing. Fare clic sulla scheda Allenamento e impostare Parametri ottimali del treno? su No. Selezionare la scheda Polacco e in File parametri ottimizzato specificare il percorso del file opt_params_all_groups.txt dal passaggio 9.1. Fare clic su Esegui.
3. Ripeti il perfezionamento 3D (passaggio 8.3) e la post-elaborazione (passaggio 8.8) con un set di particelle lucidate.

10. RELION-3 - CTF e perfezionamenti per particella

1. Per stimare le aberrazioni di ordine superiore, apri CTF Refinement e, nella scheda I/O in Particelle, seleziona il percorso del file .star contenente le particelle lucidate dal recente lavoro Refine 3D (run_data.star).
   1. In File stella postprocesso impostare il percorso dell'output dell'ultimo processo di post-elaborazione (passaggio 9.3).
   2. Selezionare la scheda Adatta e impostare i seguenti parametri: Stima (ingrandimento anisotropico): No, Esegui adattamento parametro CTF? No, stima beamtilt: sì, stimare anche trefoil? Sì, stimare le aberrazioni del 4^° ordine? Sì. Eseguire il processo.
2. Ripetere il passaggio 10.1 utilizzando come input le particelle (da Refine3D) generate nel lavoro precedente (particles_ctf_refine.star). Nella scheda Adatta modificare Stima (ingrandimento anisotropico) su Sì ed Esegui il processo.
3. Ripetere il passaggio 10.2 utilizzando come input le particelle (da Refine3D) prodotte nel lavoro precedente (particles_ctf_refine.star). Nella scheda Adatta impostare i seguenti parametri: Stima (ingrandimento anisotropico): No, Esegui adattamento parametri CTF?: Sì, Adatta sfocatura?: Per particella, Adatta astigmatismo? Per micrografia, Fit B-factor?: No, Fit Phase-Shift: No, Estimate Beamtilt?: No, Estimate ^4th Order Aberrations?: No. Eseguilo .
   NOTA: dato che la particella ha un contrasto sufficiente, la scheda Adatta astigmatismo? può essere impostata su Per particella. Per questo set di dati, il perfezionamento dell'astigmatismo per particella non ha migliorato la qualità e la risoluzione della mappa.
4. Ripetete il perfezionamento 3D con le particelle del passaggio 10.3 e nella scheda I/O, impostate Usa FSC appiattiti con solvente? su yes. Al termine dell'esecuzione, eseguire un processo di post-elaborazione (passaggio 8.8) ed esaminare la mappa in UCSF Chimera (passaggio 5.2).

11. Trasferimento delle coordinate delle particelle RELION-3 e della mappa 3D a Scipion 3

1. Per perfezionare e convalidare ulteriormente la mappa RELION-3, importare prima il volume e le particelle dall'ultimo processo di post-elaborazione (passaggio 10.4) a Scipion 3. Avvia Scipion 3 e crea un nuovo progetto.
2. Nel pannello Protocolli a sinistra, seleziona il menu a discesa Importazioni e fai clic su Importa particelle. Modificare i seguenti parametri: Importa da: RELION-3, File stella: postprocess.star e specificare i parametri di acquisizione come nel passaggio 1.3. Fare clic su Esegui.
3. Fare clic sul menu a discesa Importazioni e selezionare Importa volumi. In Importa da indicare il percorso della mappa RELION-3. Modificare la dimensione dei pixel (frequenza di campionamento) Å/px in 1.045 ed esegui.

12. Scipion 3 - Perfezionamento ad alta risoluzione

1. Innanzitutto, eseguire un allineamento globale. Selezionate il menu a discesa Perfeziona nel pannello Protocolli e fate clic su Xmipp3 - highres24. Immettere le particelle e i volumi importati dai passaggi 11.2 e 11.3 rispettivamente come immagini a grandezza naturale e volumi iniziali e impostare il gruppo di simmetria su icosaedrico. Nella scheda Allineamento immagine in Assegnazione angolare, scegliere Globale e impostare risoluzione massima di destinazione su 3 Å, quindi Eseguire il processo.
2. Al termine del lavoro, fare clic su Analizza risultati. Nella nuova finestra, fare clic sull'icona UCSF Chimera per esaminare il volume raffinato. Inoltre, fare clic su Display Resolution Plots (FSC) per vedere come è cambiato l'FSC dopo il perfezionamento, nonché su Plot Histogram con angular changes per vedere se le assegnazioni dell'angolo di Eulero sono cambiate.
   NOTA: a seconda della risoluzione della struttura RELION-3 di input, questo passaggio può essere ripetuto più volte con valori diversi impostati per la risoluzione massima target nella scheda Assegnazione angolare . Per ulteriori informazioni, vedere il tutorial di ^Scipion25.
3. Ripetere il passaggio 12.1 con un allineamento locale. Copiare il processo precedente e modificare Seleziona esecuzione precedente in Xmipp3 - highres Global. Nella scheda Assegnazione angolare , modificare Allineamento immagine su Locale. Impostare la risoluzione massima target su 2,1 Å.
4. Esaminare la mappa raffinata in UCSF Chimera e analizzare il cambiamento in FSC e assegnazioni angolari (passaggio 12.2). Ripetere il perfezionamento locale fino a quando la risoluzione non migliora e le assegnazioni angolari sono convergenti, regolando la risoluzione massima di destinazione in base alle esigenze.
5. La mappa di output di Scipion 3 può essere ulteriormente modificata e affilata in ^Phenix26.

13. Scipion 3 - Convalida della mappa

1. Esaminare la risoluzione locale della mappa finale generata in Xmipp3 - highres. Aprire Xmipp - MonoRes27 locale e inserire il volume finale dal lavoro precedente e la maschera generata nel passaggio 8.6. Impostare l'intervallo di risoluzione da 1 a 6 Å con un intervallo di 0,1 Å ed eseguire il processo.
2. Al termine dell'esecuzione, fare clic su Analizza risultati ed esaminare l'istogramma di risoluzione e le sezioni di volume colorate in base alla risoluzione.
3. Per vedere se le particelle sono ben allineate, apri Multireference Alignability28 e inserisci le particelle e il volume dal passaggio 12.3. Fare clic su Analizza risultati per visualizzare il grafico di convalida. Idealmente, tutti i punti dovrebbero essere raggruppati intorno (1.0,1.0).
4. Apri Xmipp3 - Convalida Overfitting. Immettere le particelle e i volumi dal passaggio 12.3. Al termine dell'esecuzione, analizzare i risultati e ispezionare la trama di overfitting. L'incrocio delle curve del rumore gaussiano allineato e delle particelle allineate indica l'overfitting.

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Risultati

Abbiamo presentato una pipeline SPA completa per ottenere una struttura ad alta risoluzione utilizzando tre diverse piattaforme di elaborazione: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. La Figura 1 e la Figura 4 riepilogano il flusso di lavoro di elaborazione generale e nella Tabella 1 vengono descritti in dettaglio i protocolli di perfezionamento. Questi protocolli sono stati utilizzati durante i perfezionamenti di una struttura 2.3 Å di AAV, raggi...

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Discussione

In questo articolo, presentiamo un robusto flusso di lavoro SPA per l'elaborazione dei dati crio-EM su varie piattaforme software per ottenere ricostruzioni 3D ad alta risoluzione (Figura 1). Questo flusso di lavoro è applicabile a un'ampia varietà di macromolecole biologiche. I passaggi successivi del protocollo sono descritti nella Figura 4, tra cui la pre-elaborazione dei filmati, il prelievo e la classificazione delle particelle e diversi metodi per il per...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/