Ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale

Riepilogo

In questo articolo, presentiamo un protocollo per rilevare oligodendrociti caricati con microtubuli in un modello di tubulopatia attraverso un approccio di microscopia di seconda generazione armonica semplice e innovativo.

Abstract

La visualizzazione soddisfacente dei componenti citoscheletrici nel cervello è impegnativa. La distribuzione ubiquitaria delle reti di microtubuli, microfilamenti e filamenti intermedi in tutti i tessuti neurali, insieme alla variabilità negli esiti delle strategie di fusione delle proteine fluorescenti e alla loro limitata applicabilità agli studi dinamici di anticorpi e farmaci come veicoli cromofori, rendono gli approcci ottici classici non efficaci come per altre proteine. Quando la tubulina deve essere studiata, la generazione label-free di seconde armoniche è un'opzione molto adatta a causa dell'organizzazione non centrosimmetrica della molecola. Questa tecnica, quando coniugata alla microscopia, può descrivere qualitativamente la distribuzione volumetrica di fasci paralleli di microtubuli in campioni biologici, con l'ulteriore vantaggio di lavorare con tessuti freschi non fissati e non permeabilizzati. Questo lavoro descrive come visualizzare la tubulina con una configurazione commerciale di microscopia di seconda generazione armonica per evidenziare i microtubuli nelle strutture arricchite di tubulina degli oligodendrociti, come nell'ipomielinizzazione con atrofia dei gangli della base e della tubulopatia del cervelletto (H-ABC), un disturbo mielinico recentemente descritto.

Introduzione

L'imaging ottico delle strutture citoscheletriche nei tessuti e nei preparati di organi non è un compito facile. I filamenti citoscheletrici sono onnipresenti, quindi se viene eseguita una colorazione generica, ad esempio, contro alfa-tubulina o beta-actina o potenzialmente cheratina in un campione epiteliale, il segnale sarà probabilmente distribuito in modo piuttosto omogeneo su tutto il campione. Per limitare la colorazione a un sottoinsieme più significativo di componenti cellulari, è possibile utilizzare topi transgenici con espressione mirata¹ o pianificare l'uso di anticorpi isoforma-specifici. Mentre pochissimi di questi ultimi sono sul mercato (e pochissimi esistono affatto ^2,3,4), potrebbe essere disponibile un modello animale transgenico. Tuttavia, deve essere acquisito dal laboratorio e adeguatamente alloggiato, con tutte le spese coinvolte nel processo. Alcuni anticorpi o sostanze chimiche, ad esempio i farmaci coniugati con fluorofori come la falloidina o il paclitaxel, possono essere parzialmente o totalmente incompatibili con l'uso in cellule o tessuti viventi, limitando così la loro applicabilità ai soli studi su campioni fissi.

Nel caso della tubulina, un ulteriore aspetto deve essere preso in considerazione, ovvero la sensibilità del polimero alla fissazione. La fissazione chimica convenzionale con la formaldeide è nota per non essere adeguata a preservare in modo ottimale l'integrità dei microtubuli⁵. Inoltre, un recente rapporto conferma che la reticolazione della formaldeide induce sottili cambiamenti nell'ultrastruttura del microtubulo, simile a quanto accade con il legame di alcuni farmaci o molecole fisiologiche come GTP⁶.

La visualizzazione diretta di microtubuli in campioni non colorati e non fissati è, quindi, spesso auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, una soluzione tecnica è la microscopia di seconda generazione armonica (SHG)⁷, che si basa sulla capacità di fasci di microtubuli paralleli di agire come monofori e di emettere luce raddoppiata in frequenza quando adeguatamente illuminati con un intenso laser a infrarossi pulsato. Sebbene un secondo segnale armonico più forte e più stabile possa essere generato dal collagene e dalla miosina, che sono gli unici altri due materiali biologici noti per essere in grado di raddoppiare la frequenza, il segnale della tubulina è stato finora utilizzato principalmente per studiare i riarrangiamenti del fuso mitotico 8,9,10 e la morfologia dei microtubuli assonali^11,12,13.

In questo lavoro, introduciamo un nuovo uso della microscopia SHG come strumento diagnostico per distinguere i tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) affetti da tubulopatia beta 4 A (TUBB4A) dalle loro controparti sane¹⁴. Alcune delle mutazioni che si verificano in questa isoforma prevalentemente neurale della tubulina, come quelle che causano l'ipomielinizzazione e l'atrofia dei gangli della base e del cervelletto (H-ABC), inducono un riempimento eccessivo di microtubuli negli oligodendrociti^15,16; Le alterazioni citoscheletriche, a loro volta, sono associate ad effetti a valle come la dismielinizzazione, con profonda compromissione delle vie motorie e sensoriali^16,17,18,19. Il modello murino taiep utilizzato in questo lavoro mostra un contenuto anormale di microtubuli negli oligodendrociti e ricapitola la maggior parte dei sintomi senso-motori dei pazienti con H-ABC¹⁷. Il protocollo spiega come visualizzare strutture come il corpo calloso e il cervelletto, che di solito sono altamente mielinizzati e che sono gravemente colpiti nei pazienti umani e nel ratto taiep ¹⁹, per evidenziare le differenze nei segnali SH tra tessuti sani e mutanti.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le leggi e i codici approvati nel settimo titolo del Regolamento della Legge Sanitaria Generale sulla Ricerca Sanitaria del Governo Messicano (NOM-062-ZOO-1999) e in conformità con le raccomandazioni del National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals e sono state approvate dal comitato istituzionale di bioetica nella ricerca dell'Universidad de Guanajuato e della Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

1. Impostazioni del microscopio

1. Accendere il sistema di microscopia.
2. Accendere il laser pulsato per garantire che sia pronto per il lase a un livello di potenza ottimale e costante dopo l'estrazione e la preparazione del campione.
3. Sintonizzare il laser su 810 nm. Per studiare i microtubuli tissular, viene utilizzato il 10% -20% della potenza laser disponibile, che, nel sistema descritto, corrisponde a 13-26 mW misurati sul piano focale posteriore dell'obiettivo.
4. Assicurarsi che il microscopio sia allineato a Köhler (file supplementare 1), con l'obiettivo che verrà utilizzato per l'imaging SHG.
   NOTA: Questo è importante poiché, nella configurazione commerciale utilizzata in questo lavoro, il rilevamento viene eseguito in modalità di trasmissione e attraverso il condensatore.
5. Rimuovere i filtri indesiderati dal percorso di rilevamento ottico (Figura 1A).
6. Assicurarsi che il diaframma del condensatore sia completamente aperto per garantire che nessuna luce venga interrotta inutilmente a questo livello.
7. Preparare un obiettivo ad immersione in olio con apertura numerica (NA) 25x/0,8 con una piccola goccia di olio ad immersione nell'obiettivo.
   NOTA: Questo obiettivo è stato utilizzato per abbinare al meglio il condensatore NA, che era 0,55 (idealmente, NA_cond≥ NA_obj).

2. Controlli preliminari al microscopio

NOTA: eseguire i controlli preliminari del microscopio una volta, a meno che l'impostazione non venga modificata.

1. Immagine di amido di mais secco inserito tra vetrini con parametri SHG per generare immagini SHG che rivelano la direzione della polarizzazione laser. Seguire i passaggi riportati nel file supplementare 2, ad eccezione della potenza laser, che è inferiore al 5% per l'amido di mais.
2. Prendi un'immagine di grani di amido di mais sparsi e segna l'orientamento dei lobuli SHG nel piano x-y. Questo orientamento corrisponde all'orientamento del laser (Figura 2A).
3. Come controllo, prendere un'altra immagine dello stesso campione, inserendo nel percorso ottico una piastra a mezza onda (posizione mostrata in Figura 1A) per alterare la direzione di oscillazione del laser. L'immagine risultante mostra lobuli di segnale SHG ruotati (Figura 2B, C).
4. Se si utilizza un diverso tipo di filtro passa banda per l'SHG, assicurarsi che abbia proprietà di trasmissione ottimali confrontando le immagini (Figura 2D, E) e le intensità del segnale pixel per pixel lungo una scansione lineare (Figura 2F).

3. Estrazione dei tessuti

NOTA: Utilizzare sempre strumenti puliti per eseguire le procedure chirurgiche.

1. Utilizzare ratti taiep di 6-12 mesi e controlli Sprague-Dawley (WT) di età corrispondente.
2. Anestetizzare gli animali con un'iniezione endovenosa di una miscela di ketamina-xilazina (0,125 mg/Kg e 5 mg/Kg) diluita in una soluzione sterile di NaCl allo 0,9%.
   1. Controlla i riflessi del dolore e procedi solo se sono assenti.
3. Sacrifica l'animale tramite decapitazione.
4. Una volta isolata la testa, aprire attentamente le ossa della volta cranica lungo la linea mediana, partendo dal punto più caudale in alto verso il naso, dalle cavità orbitali verso la linea mediana, e poi dal punto più caudale fino a sotto il cervello e il cervelletto.
   NOTA: I tagliatori ossei e i Rongeurs consentono una corretta rimozione delle ossa della testa senza danneggiare le strutture cerebrali.
5. Rilascia il cervello e il cervelletto dall'osso. I due emisferi potrebbero essere separati. Se gli emisferi sono divisi, utilizzare una metà per l'imaging SHG e fissare l'altra metà in paraformaldeide al 3,7% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 20 minuti all'interno di una cappa chimica per il successivo sezionamento e colorazione.

4. Sezionamento della vibratoma

1. Preparare un vassoio tampone vibratome riempito con la soluzione salina bilanciata (HBSS) calda (37 °C) di Hank.
2. Fissare il cervello alla piastra del campione usando colla cianoacrilica tramite un pezzo di nastro adesivo. La porzione / regione più caudale entra in contatto con la colla in modo che le sezioni coronali utilizzabili dalla porzione opposta, rostrale, possano essere tagliate.
   1. Lasciare ~10 s per polimerizzare la colla per ottenere un attacco efficace del campione.
      NOTA: I migliori risultati si ottengono quando il cervello è orientato in modo che la lama tagli "dall'alto verso il basso" piuttosto che "da un lato all'altro" (Figura 1B).
3. Trasferire la piastra del campione sul suo supporto magnetico all'interno del vassoio tampone.
4. Inizia a tagliare sezioni da 300-500 μm fino a quando le fette prodotte comprendono l'intera superficie del cervello.
5. A questo punto, ridurre lo spessore della sezione a 160 μm.
6. Una volta tagliata una sezione completa di 160 μm a livello del corpo calloso, recuperarla con una pipetta Pasteur in vetro modificato con un grande orifizio fiammato (Figura 1C).
7. Trasferirlo in una capsula di Petri pulita con un nuovo HBSS caldo o direttamente sul supporto di vetro per microscopia (coprivetrino o piatto con fondo di vetro).
   NOTA: Per le condizioni sperimentali descritte, l'aggiunta di un coprivetrino sopra il campione è dannosa per l'imaging.

5. Trasferimento al microscopio

1. Se il microscopio si trova in una stanza diversa, preparare una scatola isolata con confezioni di gel riscaldate per trasferire le sezioni di tessuto mantenendo la temperatura. La scatola serve anche a mantenere le sezioni calde fino a quando non vengono visualizzate.
2. Mettere il campione al microscopio e assicurarsi che sia posizionato correttamente sotto l'obiettivo mediante osservazione diretta attraverso gli oculari con luce trasmessa.
   NOTA: L'obiettivo è quello di allineare le strutture di emissione previste con la direzione di oscillazione del laser per massimizzare il segnale SHG emesso (e, quindi, rilevato).
3. Rimuovere l'HBSS in eccesso in modo che un sottile film liquido copra l'intero campione. Controllare visivamente il film liquido ogni pochi minuti per evitare un'eccessiva evaporazione e asciugatura del campione.
   NOTA: Nelle condizioni descritte, una sezione viene utilizzata per non più di 20 minuti. L'essiccazione del campione provoca drastici effetti artefici (figura supplementare 1A). Piuttosto che aggiungere più HBSS, si consiglia di immergere periodicamente la sezione in un mezzo caldo e fresco se sono necessari tempi di imaging più lunghi. L'uso di camere di perfusione e colla o agarosio a basso punto di fusione per immobilizzare il tessuto è raccomandato anche quando devono essere fatti esperimenti più lunghi.
4. Preparare la fase del microscopio per l'imaging non scansionato, che potrebbe includere la chiusura di tutte le porte della camera di incubazione buia o la copertura della camera di incubazione con un tessuto rivestito in poliuretano di nylon nero.

6. Imaging

1. Selezionare la modalità di imaging "non scansionata" lungo il percorso di trasmissione. In questo modo, la cattura del debole segnale SH della tubulina sarà ottimizzata.
2. Selezionare l'obiettivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Imposta una potenza laser compresa tra 13 mW e 26 mW, con un tempo di permanenza dei pixel di 12,6 μs. Scatta immagini non più grandi di 512 pixel x 512 pixel, con velocità 5 e media di 2, per un tempo medio di acquisizione di circa 15 s.
   NOTA: L'utilizzo di potenze laser più elevate e/o tempi di permanenza più lunghi può danneggiare il campione (Figura supplementare 1B).
4. Scatta prima le immagini utilizzando un filtro passa-corto da 485 nm (SP485) e, in una seconda fase, aggiungi un filtro passa banda nitido da 405 nm (BP405; Figura 3). Seguire i passaggi riportati nel file supplementare 2.
   NOTA: Le immagini pseudo-in campo chiaro possono essere prese attraverso lo stesso rivelatore utilizzando la luce laser residua di una linea visibile (i laser a 405 nm o 488 nm funzionano meglio).

7. Lavorazione del cervelletto

1. Per prima cosa, tagliare il cervelletto con un bisturi in due emisferi, quindi incollarli al supporto del vibratomo dalla parte centrale (la parte piatta ottenuta dopo il taglio).
2. Sezione e immagine del cervelletto nello stesso modo descritto per il cervello (sezioni da 160 μm, stesse impostazioni di vibratomo, stessa lama, stesse impostazioni del microscopio, ecc.).
   NOTA: A causa dell'anatomia del cervelletto, il suo orientamento al momento del sezionamento non è critico; Nella maggior parte delle fette generate lontano dalla superficie, ci saranno folia sezionati bene nella sostanza bianca.

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Risultati

Le immagini ottenute con questa metodologia hanno un livello di fondo intrinsecamente basso a causa del numero molto limitato di armonofori presenti nei tessuti biologici, che è uno dei vantaggi significativi del metodo.

Quando vengono visualizzate le fibre del corpo calloso, strutture corte simili a fibre ed elementi arrotondati possono essere trovati costantemente nel cervello taiep (Figura 3B), mentre il corpo calloso del cervello di controllo mostra un segnale molto più eterogen...

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Discussione

La microscopia SHG fa parte di un gruppo di tecniche di ottica non lineare, che includono la microscopia a eccitazione a due fotoni, la microscopia a generazione di terza armonica e la microscopia a diffusione Raman anti-Stokes coerente, che hanno contribuito ad ampliare la gamma di applicazioni della microscopia ottica convenzionale alle scienze della vita²⁰.

In particolare, la maggiore forza e debolezza della microscopia SHG si riferiscono alla stessa condizione: il g...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200