Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna

Riepilogo

Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso che è stato isolato dalle piscine rocciose marine. Questo articolo descrive l'isolamento dei filamenti da fonti naturali, l'estrazione del DNA, il sequenziamento del genoma, la trasformazione naturale, l'espressione di sfGFP, la crioconservazione e i metodi di motilità.

Abstract

I cianobatteri sono al centro della ricerca di base e dei progetti biotecnologici in cui l'energia solare viene utilizzata per la produzione di biomassa. Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso recentemente isolato. Questo documento descrive come i nuovi cianobatteri filamentosi possono essere isolati dalle piscine rocciose marine. Descrive anche come il DNA può essere estratto dai filamenti e come i genomi possono essere sequenziati. Sebbene la trasformazione sia stabilita per molte specie unicellulari, è meno frequentemente segnalata per i cianobatteri filamentosi. Un metodo semplificato per la trasformazione naturale di P. lacuna è descritto qui. P. lacuna è l'unico membro dell'ordine Oscillatoriales per il quale è stabilita la trasformazione naturale. Questo documento mostra anche come la trasformazione naturale viene utilizzata per esprimere la proteina fluorescente verde superfolder (sfGFP). Un promotore endogeno cpcB ha indotto un'espressione circa 5 volte più forte rispetto ai promotori cpc560, A2813 o psbA2 di Synechocystis sp. PCC6803. Inoltre, è stato stabilito un metodo per la crioconservazione di P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803 e sono descritti metodi per valutare la motilità in un mezzo liquido e su superfici di agar e plastica.

Introduzione

I cianobatteri sono organismi procariotici che utilizzano la fotosintesi come fonte di energia ^1,2. La ricerca è sempre più focalizzata sulle specie cianobatteriche. Diversi cianobatteri possono essere trasformati con il DNA³. I geni possono essere eliminati o sovraespressi in queste specie. Tuttavia, la trasformazione è limitata a poche specie 4,5,6,7,8,9,10,11, e può essere difficile stabilire la trasformazione in ceppi provenienti da collezioni di colture o

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Isolamento dall'ambiente naturale

NOTA: Alghe verdi, diatomee, cianobatteri filamentosi e altre microalghe possono essere isolati. Il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi specie di microalga da pozze rocciose che crescono in condizioni di laboratorio. I cianobatteri filamentosi che appartengono agli Oscillatoriales possono essere facilmente riconosciuti dal loro movimento e dalla forma filamentosa. La specie può essere identificata in uno stato semipuro mediante sequenziamento del genoma o sequenziamento dell'rRNA 16S.

1. Trasferire campioni di acqua di mare liquida da piscine rocciose marine (cioè cavit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Seguendo i metodi sopra menzionati, 5 diversi ceppi di P. lacuna sono stati isolati dalle piscine rocciose e sequenziati (Figura 1 e Tabella 1). Tutte le colture erano sterili dopo circa 1 anno di sottocoltura tranne P. lacuna HE10JO. Questo ceppo è ancora contaminato da Marivirga atlantica, un batterio marino. Durante le successive escursioni di Helgoland, altri cianobatteri filamentosi sono stati isolati da pozze rocciose, che sono diverse da

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Sebbene molti ceppi di cianobatteri siano disponibili dalle collezioni^{di colture 32,33,34,35,36}, c'è ancora una domanda di nuovi cianobatteri dall'ambiente naturale perché queste specie sono adattate a proprietà specifiche. P. lacuna è stato raccolto da piscine rocciose ed è adattato alle variazioni delle concentrazioni di sale e della temperatur.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave 3870 ELV	Tuttnauer	3870 ELV
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
BG-11 Freshwater Solution	Sigma Aldrich	C3061
BG-11 medium	Merck	73816-250ML
Boric acid	Merck	10043-35-3	H3BO3
Calcium chloride dihydrate	Carl Roth	10035-04-8	CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL	Greiner	658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL	Greiner	601975
Centrifuge LYNX 4000	Thermo Scientific	75006580	and rotor
Centrifuge microstar 17	VWR International	N/A	for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)	PanReac AppliChem	57-09-0	C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1	PanReac AppliChem	A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Merck	7791-13-1	CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate	Merck	7758-99-8	CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin	Carl Roth	58-85-5	C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb	New England Biolabs	N3232
DNA ladder 100 bp	New England Biolabs	N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S	Brand GmbH	26360	for pipetting 1-25 mL
Ethanol	VWR	64-17-5	C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate	Carl Roth	6381-92-6	EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome	Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2	Zeiss
French Pressure Cell Press	American Instrument Company	N/A
Gel documation System Saffe Image	Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu	ADVANCED
Glassware, different
Glycerol	Carl Roth	56-81-5	C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate	Merck	10025-77-1	FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Kanamycin sulphate	Carl Roth	25389-94-0	C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)	Sigma Aldrich	137-16-6	C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)	Carl Roth	X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight	OSRAM		cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W	Bloom Star	N/A	cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	7791-18-6	MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Serva	13446-34-9	MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750	Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +	Conrad Electronics	2138863-YD	for time-lapse recording
Ocular camera EC3	Leica		for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD	Bresser		for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm	Merck	P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL	Gilson	SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile	Greiner	607107
Plastic tube, sterile, 15 mL	Greiner	188271
Plastic tube, sterile, 50 mL	Greiner	227261
Potassium bromide	Carl Roth	7758-02-3	KBr
Potassium chloride	Carl Roth	7447-40-7	KCl
Power supply Statron 3252-1	Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005	Conrad Electronics		for LED
Proteinase K	Promega	MC500C	from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase	New England Biolabs	M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5	Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002	Illumina
Shaker Unimax 2010	Heidolph Instruments		for cultivation
Sodium acetate	Carl Roth	127-09-3	NaCH3COO
Sodium chloride	Carl Roth	7647-14-5	NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Carl Roth	10049-21-5	NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride	Carl Roth	7681-49-4	NaF
Sodium hydrogen carbonate	Carl Roth	144-55-8	NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate	Serva	10102-40-6	Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate	Merck	7631-99-4	NaNO3
Sodium sulphate	Carl Roth	7757-82-6	Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate	Carl Roth	10025-70-4	SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride	Merck	67-03-8	C12H17ClN4OS · HCl
TRIS	Carl Roth	77-86-1	C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3	Hielscher Ultrasound Technology	UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M	Heidolph Instruments		homogenizer
Urea	Carl Roth	57-13-6	CH4N2O
Vitamin B12	Sigma	68-19-9	C63H88CoN14O14P
Vitamin solution			0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment	VEOLIA water technologies	ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate	Sigma	7446-20-0	ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly	https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline	makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ		software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server	https://rast.nmpdr.org	input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater	0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium	artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+ liquid medium	f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar	3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution	0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution	0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin