Un modello di rimodellamento vascolare inverso nell'ipertensione polmonare a causa di cardiopatia sinistra da debanding aortico nei ratti

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una procedura chirurgica per rimuovere il banding ascendente-aortico in un modello di ratto di ipertensione polmonare dovuta a cardiopatia sinistra. Questa tecnica studia i meccanismi endogeni di rimodellamento inverso nella circolazione polmonare e nel cuore destro, informando così le strategie per invertire l'ipertensione polmonare e / o la disfunzione ventricolare destra.

Abstract

L'ipertensione polmonare dovuta a malattie cardiache sinistre (PH-LHD) è la forma più comune di PH, ma la sua fisiopatologia è scarsamente caratterizzata dall'ipertensione arteriosa polmonare (PAH). Di conseguenza, mancano interventi terapeutici approvati per il trattamento o la prevenzione del PH-LHD. I farmaci usati per trattare il PH nei pazienti con PAH non sono raccomandati per il trattamento del PH-LHD, poiché la ridotta resistenza vascolare polmonare (PVR) e l'aumento del flusso sanguigno polmonare in presenza di un aumento della pressione di riempimento del lato sinistro possono causare scompenso del cuore sinistro ed edema polmonare. È necessario sviluppare nuove strategie per invertire il PH nei pazienti con LHD. A differenza della PAH, PH-LHD si sviluppa a causa dell'aumento del carico meccanico causato dalla congestione del sangue nella circolazione polmonare durante l'insufficienza cardiaca sinistra. Clinicamente, lo scarico meccanico del ventricolo sinistro (LV) mediante sostituzione della valvola aortica in pazienti con stenosi aortica o mediante impianto di dispositivi di assistenza LV in pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale normalizza non solo le pressioni arteriose polmonari e ventricolari destre (RV) ma anche la PVR, fornendo così prove indirette di rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare. Utilizzando un modello di RATto stabilito di PH-LHD a causa di insufficienza cardiaca sinistra innescata da sovraccarico di pressione con successivo sviluppo di PH, viene sviluppato un modello per studiare i meccanismi molecolari e cellulari di questo fisiologico processo di rimodellamento inverso. In particolare, è stato eseguito un intervento chirurgico di debanding aortico, che ha portato al rimodellamento inverso del miocardio LV e al suo scarico. Parallelamente, è stata rilevata la completa normalizzazione della pressione sistolica RV e l'inversione significativa ma incompleta dell'ipertrofia RV. Questo modello può rappresentare un valido strumento per studiare i meccanismi di rimodellamento fisiologico inverso nella circolazione polmonare e nel RV, con l'obiettivo di sviluppare strategie terapeutiche per il trattamento del PH-LHD e di altre forme di PH.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca è la principale causa di morte nei paesi sviluppati e si prevede che aumenterà del 25% nel prossimo decennio. Ipertensione polmonare (PH) - un aumento patologico della pressione sanguigna nella circolazione polmonare - colpisce circa il 70% dei pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale; l'Organizzazione Mondiale della Sanità classifica il PH come ipertensione polmonare dovuta a cardiopatia sinistra (PH-LHD)¹. Ph-LHD è iniziato da compromissione della funzione sistolica e / o diastolica del ventricolo sinistro (LV) che si traduce in elevata pressione di riempimento e congestione passiva del sangue nella circolazione polmonare². Sebbene inizialmente reversibile, il PH-LHD diventa gradualmente fisso a causa del rimodellamento vascolare polmonare attivo in tutti i compartimenti della circolazione polmonare, cioè arterie, capillari e vene ^3,4. Sia il PH reversibile che quello fisso aumentano il postcarico del camper, inizialmente guidando l'ipertrofia miocardica adattativa, ma alla fine causando dilatazione RV, ipocinesia, fibrosi e scompenso che portano progressivamente al fallimento del camper 1,2,5,6. Come tale, il PH accelera la progressione della malattia nei pazienti con insufficienza cardiaca e aumenta la mortalità, in particolare nei pazienti sottoposti a trattamento chirurgico mediante impianto di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra (LVAD) e/o trapianto di cuore ^7,8,9. Attualmente, non esistono terapie curative che potrebbero invertire il processo di rimodellamento vascolare polmonare, quindi è necessaria una ricerca meccanicistica fondamentale in sistemi modello appropriati.

È importante sottolineare che gli studi clinici dimostrano che la PH-LHD come complicanza frequente nei pazienti con stenosi aortica può migliorare rapidamente nel primo periodo post-operatorio dopo la sostituzione della valvola aortica¹⁰. Analogamente, l'elevata resistenza vascolare polmonare (PVR) (>3 Wood Units) che era, tuttavia, reversibile sul nitroprussiato è stata normalizzata in modo sostenibile dopo il trapianto di cuore in uno studio di follow-up di 5 anni¹¹. Allo stesso modo, un'adeguata riduzione della PVR sia reversibile che fissa e un miglioramento della funzione RV nei pazienti con LHD potrebbero essere realizzati entro diversi mesi scaricando il ventricolo sinistro utilizzando dispositivi di assistenza ventricolare pulsatile e non pulsatile impiantabili 12,13,14. Attualmente, i meccanismi cellulari e molecolari che guidano il rimodellamento inverso nella circolazione polmonare e nel miocardio RV non sono chiari. Tuttavia, la loro comprensione può fornire importanti informazioni sui percorsi fisiologici che possono essere sfruttati terapeuticamente per invertire il rimodellamento vascolare e RV polmonare in PH-LHD e altre forme di PH.

Un modello preclinico adatto che replica adeguatamente le caratteristiche fisiopatologiche e molecolari del PH-LHD può essere utilizzato per studi traslazionali nell'insufficienza cardiaca congestizia indotta da sovraccarico di pressione dovuta a banding aortico chirurgico (AoB) nei ratti ^4,15,16. Rispetto a un'insufficienza cardiaca simile dovuta a sovraccarico di pressione nel modello murino di costrizione aortica trasversale (TAC)¹⁷, il banding dell'aorta ascendente sopra la radice aortica nei ratti AoB non produce ipertensione nell'arteria carotide sinistra poiché il sito di banding è prossimale del deflusso dell'arteria carotide sinistra dall'aorta. Di conseguenza, aoB non causa lesioni neuronali del lato sinistro nella corteccia come è caratteristico per TAC¹⁸ e che può influenzare l'esito dello studio. Rispetto ad altri modelli di roditori di PH-LHD indotto chirurgicamente, i modelli di ratto in generale, e AoB in particolare, si dimostrano più robusti, riproducibili e replicano il rimodellamento della caratteristica di circolazione polmonare per i pazienti con PH-LHD. Allo stesso tempo, la letalità perioperatoria è bassa¹⁹. L'aumento delle pressioni LV e la disfunzione LV nei ratti AoB inducono lo sviluppo di PH-LHD, con conseguente aumento delle pressioni RV e rimodellamento RV. Come tale, il modello di ratto AoB si è dimostrato estremamente utile in una serie di studi precedenti da parte di gruppi indipendenti, incluso noi stessi, per identificare i meccanismi patologici del rimodellamento vascolare polmonare e testare potenziali strategie di trattamento per PH-LHD ^{4,15,20,21,22,23,24,25}.

Nel presente studio, il modello di ratto AoB è stato utilizzato per stabilire una procedura chirurgica di debanding aortico per studiare i meccanismi di rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare e nel camper. In precedenza, sono stati sviluppati modelli di rimodellamento inverso miocardico come lo scioglimento aortico nei topi²⁶ e nei ratti²⁷ per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la regressione dell'ipertrofia ventricolare sinistra e testare potenziali opzioni terapeutiche per promuovere la miocardia guarigione. Inoltre, un numero limitato di studi precedenti ha esplorato gli effetti dello scioglimento aortico sul PH-LHD nei ratti e ha dimostrato che lo scioglimento aortico potrebbe invertire l'ipertrofia mediale nelle arteriole polmonari, normalizzare l'espressione della pre-pro-endotelina 1 e migliorare l'emodinamica polmonare^27,28, fornendo prove della reversibilità del PH nei ratti con insufficienza cardiaca. Qui, le procedure tecniche della chirurgia di debanding sono ottimizzate e standardizzate, ad esempio, applicando una tracheotomia al posto dell'intubazione endotracheale o utilizzando clip in titanio di un diametro interno definito per il banding aortico invece di suture in polipropilene con un ago smussato^26,27, fornendo così un migliore controllo delle procedure chirurgiche, una maggiore riproducibilità del modello e un migliore tasso di sopravvivenza.

Da un punto di vista scientifico, il significato del modello di debanding PH-LHD non risiede solo nel dimostrare la reversibilità del fenotipo cardiovascolare e polmonare nell'insufficienza cardiaca, ma soprattutto nell'identificazione di driver molecolari che innescano e / o sostengono il rimodellamento inverso nelle arterie polmonari come candidati promettenti per il futuro targeting terapeutico.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite seguendo la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (Istituto delle risorse animali da laboratorio, 8a edizione 2011) e approvate dal comitato governativo locale per la cura e l'uso degli animali dell'Ufficio statale tedesco per la salute e gli affari sociali (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlino; protocollo n. G0030/18). In primo luogo, l'insufficienza cardiaca congestizia è stata indotta chirurgicamente nei ratti Sprague-Dawley giovani ~ 100 g di peso corporeo (bw) (vedi Tabella dei materiali) posizionando una clip in titanio con un diametro interno di 0,8 mm sull'aorta ascendente (fascia aortica, AoB) come descritto in precedenza^29,30. Alla settimana 3 dopo AoB (Figura 1), è stato eseguito un intervento chirurgico di debanding (Deb) per rimuovere la clip dall'aorta. Le procedure chirurgiche e la convalida dell'inversione del PH nei ratti AoB eseguite sono schematicamente rappresentate nella Figura 1.

1. Preparazioni chirurgiche

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici necessari (Figura 2) mediante autoclave.
2. Iniettare nel ratto carprofene (5 mg/kg di peso corporeo) (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale (i.p.) per analgesia 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
3. Anestetizzare il ratto mediante iniezione i.p. di ketamina (87 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (13 mg/kg di peso corporeo).
4. Rimuovere i capelli dalla scollatura e dal torace dell'animale usando un rasoio elettrico.
5. Applicare una goccia di unguento per gli occhi per proteggere gli occhi durante l'intervento chirurgico.
6. Posizionare il ratto in posizione supina su un tavolo chirurgico sterilizzato. Fissare con cura l'addome e gli arti dell'animale con nastro adesivo.
   NOTA: Per mantenere la temperatura corporea, posizionare un tappetino riscaldante a 37 °C sotto il tavolo operatorio. Evitare il riscaldamento della regione della testa per evitare l'asciugatura degli occhi.
7. Disinfettare la pelle animale con soluzione di povidone-iodio/iodoforo. Nota cicatrici e suture dalla chirurgia AoB primaria e drappeggia il campo chirurgico.
8. Garantire un'adeguata profondità di anestesia mediante pizzicamento della punta.
   NOTA: La profondità dell'anestesia deve essere controllata regolarmente durante l'intervento chirurgico.

2. Tracheotomia e ventilazione meccanica

NOTA: Durante l'intervento chirurgico, cambiare i guanti dopo aver maneggiato attrezzature non sterili.

1. Con le forbici fini (Figura 2A), fare un'incisione cervicale della linea mediana lunga 7-10 mm (Figura 3A).
2. Con l'aiuto di un paio di pinze smussate (Figura 2B'), sezionare il tessuto molle cervicale per esporre i muscoli infraioidi. Dividi i muscoli nella linea mediana per visualizzare la trachea. Tagliare e rimuovere la sutura dalla chirurgia primaria AoB.
3. Praticare un'incisione della trachea di circa 2 mm tra due anelli cartilaginei usando forbici a molla Noyes angolate (Figura 2C,3B). Inserire la cannula tracheale di diametro esterno 2 mm (Figura 2D) nella trachea e fissarla con una sutura di seta 4-0 (Figura 2E,3C).
4. Collegare la cannula tracheale a un ventilatore meccanico (vedi Tabella dei materiali) mantenendo al minimo lo spazio morto (Figura 3D-E). Mantenere la ventilazione polmonare perioperatoria ad una frequenza respiratoria di 90 respiri/min ad un volume di marea (Vt) di 8,5 ml/kg di peso corporeo.

3. Scioglimento dell'aorta

1. Fai un'incisione cutanea lunga ~ 20 mm tra la seconda e la terza costola usando forbici fini (Figura 3F).
2. Con l'aiuto di forbici chirurgiche più piccole (Figura 2F), allargare attentamente i muscoli e tagliarli strato per strato (Figura 3G). Fai un'incisione laterale di 10 mm lungo lo spazio intercostale tra la seconda e la terza costola.
   NOTA: La linea medio-vennale deve essere avvicinata con attenzione per evitare sanguinamenti.
3. Utilizzare uno spandindi costole (Figura 2G) per espandere lo spazio intercostale tra la seconda e la terza costola per creare una finestra chirurgica (Figura 3H).
4. Con l'aiuto di una pinza smussata (Figura 2B,B'), separare accuratamente il timo dal cuore e dalle arterie del condotto per visualizzare l'aorta con la clip (Figura 4A).
5. Tenere la clip con l'aiuto della pinza e rimuovere con attenzione il tessuto connettivo attorno alla clip per esporla.
   NOTA: Evitare di tenere o sollevare l'aorta con la pinza, in quanto potrebbe ferire l'aorta con conseguente sanguinamento e un esito letale.
6. Con l'aiuto di un portaago (Figura 2H), aprire la clip (Figura 4B) e rimuoverla dalla cavità toracica.
7. Prima di chiudere il torace, aprire l'atelettasia polmonare, garantire un adeguato reclutamento polmonare senza sovradistensione, continuare la ventilazione meccanica con un Vt di 9,5 ml / kg di peso corporeo per altri 10 minuti e tornare a un Vt di 8,5 ml / kg di peso corporeo per reclutare i polmoni e risolvere un possibile pneumotorace.
8. Chiudi i muscoli profondi con una semplice sutura interrotta usando la seta 4-0. Quindi collegare i muscoli superiori e la pelle con una semplice sutura continua (Figura 5A,B).

4. Estubazione tracheale

1. Scollegare la cannula tracheale dalla macchina di ventilazione. Osservare attentamente il ratto fino a quando la respirazione spontanea non viene ristabilita. Se l'animale non riesce a respirare spontaneamente al momento della disconnessione, ricollegare il ventilatore e continuare a ventilare per altri 5 minuti. Quindi ripetere la procedura.
2. Dopo aver ristabilito la respirazione spontanea, rimuovere la cannula dalla trachea e pulire il liquido intorno alla trachea con punti di spugna (Figura 2I) (vedi Tabella dei materiali).
3. Chiudere la trachea con una semplice sutura utilizzando 6-0 prolene (Figura 2E' e Figura 5C). Quindi chiudere i muscoli infraioidi in una semplice sutura interrotta usando seta 4-0 (Figura 5D) e collegare la pelle in una semplice sutura continua (Figura 5E). Pulire e disinfettare i muscoli e la pelle durante il processo con soluzione di povidone-iodio/iodoforo.

5. Assistenza post-operatoria

1. Dopo aver completato la procedura chirurgica, spostare con cura l'animale in una gabbia di recupero con ossigeno supplementare e una lampada a infrarossi per mantenere gli animali caldi e sufficientemente ossigenati durante la fase di recupero. Posizionare la maschera di ossigeno vicino al muso del ratto. Tenere un solo animale per gabbia di recupero in qualsiasi momento.
2. Dopo che l'animale si è svegliato, spostalo con cura in una gabbia normale fornita di acqua e cibo. Per le successive 12 ore, controllare lo stato di salute dell'animale operato a intervalli di 2 ore.
3. Dopo aver completato la procedura chirurgica, applicare l'analgesia quotidianamente mediante iniezione i.p. di carprofene (5 mg/kg p.c.) per una settimana.
4. Per evitare l'infezione batterica, somministrare amoxicillina (500 mg / L) nell'acqua potabile per una settimana dopo l'intervento.

Risultati

In primo luogo, il successo dello scioglimento dell'aorta è stato confermato dall'ecocardiografia transtoracica eseguita prima e dopo la procedura di debanding negli animali AoB (Figura 6). A tal fine, l'arco aortico è stato valutato in modalità B parasternnale ad asse lungo (PLAX). È stata visualizzata la posizione della clip sull'aorta ascendente negli animali AoB e la sua assenza dopo l'intervento chirurgico di Deb (Figura 6A,B). Successi...

Discussione

Qui, viene riportata una tecnica chirurgica dettagliata per il debanding aortico in un modello AoB di ratto che può essere utilizzata per studiare la reversibilità del PH-LHD e i meccanismi cellulari e molecolari che guidano il rimodellamento inverso nella vascolarizzazione polmonare e nel RV. Tre settimane di costrizione aortica nei ratti giovani si traducono in PH-LHD evidente come aumento delle pressioni LV, ipertrofia LV e concomitante aumento delle pressioni RV e ipertrofia RV. Lo scioglimento aortico alla settima...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amoxicillin	Ratiopharm	PC: 04150075615985	Antibiotic
Anti-BNP antibody	Abcam	ab239510	Western Blotting
Aquasonic 100 Ultrasound gel	Parker Laboratories	BT-025-0037L	Echocardiography consumables
Bepanthen	Bayer	6029009.00.00	Eye ointment
Carprosol (Carprofen)	CP-Pharma	401808.00.00	Analgesic
Clip holder	Weck stainless USA	523140S	Surgical instruments
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-12	Surgical scissors
Fine scissors Tungsten carbide	Fine Science Tools	14568-09	Surgical scissors
High-resolution imaging system	FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands	VeVo 3100	Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode
Isoflurane	CP-Pharma	400806.00.00	Anesthetic
Ketamine	CP-Pharma	401650.00.00	Anesthetic
Mathieu needle holder	Fine Science Tools	12010-14	Surgical instruments
Mechanical ventilator (Rodent ventilator)	UGO Basile S.R.L.	7025	Volume controlled respirator
Metal clip	Hemoclip	523735	Surgical consumables
Microscope	Leica	M651	Manual surgical microscope for microsurgical procedures
Millar Mikro-Tip pressure catheters	ADInstruments	SPR-671	Hemodynamics assessment
Moria Iris forceps	Fine Science Tools	11373-12	Surgical forceps
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15013-12	Surgical scissors
Povidone iodine/iodophor solution	B/Braun	16332M01	Disinfection
PowerLab	ADInstruments	4_35	Hemodynamics assessment
Prolene Suture, 4-0	Ethicon	EH7830	Surgical consumables
Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″)	Austos	AE-BV010R	Surgical instruments
Serrated Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10	Surgical forceps
Silk Suture, 4-0	Ethicon	K871	Surgical consumables
Skin disinfiction solution (colored)	B/Braun	19412M07	Disinfection
Spectra 360 Elektrode gel	Parker Laboratories	TB-250-0241H	Echocardiography consumables
Sponge points tissue	Sugi	REF 30601	Surgical consumables
Sprague-Dawley rat	Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France		Study animals
Tracheal cannula			Outer diameter 2 mm
Xylazin	CP-Pharma	401510.00.00	Anesthetic