Una tecnica di bracciale modificata per il modello di trapianto di cuore eterotopico cervicale del topo

Riepilogo

Nel presente protocollo, un modello di trapianto di cuore di topo viene utilizzato per studiare il meccanismo di rigetto dell'allotrapianto cardiaco. In questo modello di trapianto di cuore eterotopico, l'efficienza operativa è migliorata e la sopravvivenza degli innesti cardiaci è assicurata da un'anastomosi cervicale end-to-end dell'impianto cardiaco utilizzando una tecnica di bracciale modificata.

Abstract

Il rigetto dell'allotrapianto cardiaco limita la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti dopo il trapianto di cuore. Un modello di trapianto di cuore di topo è ideale per studiare il meccanismo di rigetto cardiaco dell'allotrapianto negli studi preclinici a causa della loro elevata omologia con i geni umani. Questa comprensione aiuterebbe a sviluppare approcci unici per migliorare la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti trattati con allotrapianti cardiaci. In un modello murino, l'impianto di cuore da donatore addominale viene comunemente eseguito con un'anastomosi end-to-end all'aorta del ricevente e alla vena cava inferiore utilizzando punti. In questo modello, il cuore del donatore viene impiantato mediante anastomosi end-to-end all'arteria carotide e alla vena giugulare del ricevente mediante la tecnica del bracciale modificato. L'intervento chirurgico di trapianto viene eseguito senza cuciture e quindi può aumentare la sopravvivenza del ricevente poiché non vi è alcuna interferenza con l'afflusso di sangue e il reflusso venoso della parte inferiore del corpo. Questo modello murino aiuterebbe a studiare i meccanismi alla base del rigetto immunologico e patologico (acuto/cronico) degli allotrapianti cardiaci.

Introduzione

Il trapianto di cuore è diventato il trattamento standard per l'insufficienza cardiaca terminale. Più di 5.500 trapianti di cuore all'anno vengono eseguiti nelle organizzazioni registrate sotto la Società internazionale per il trapianto di cuore e polmone. Tra i pazienti sottoposti a trapianto di cuore allogenico, il tasso di rigetto a 1 anno è ancora del >10%, mentre il tasso di rigetto a 3 anni è aumentato al 36%^1,2. Tuttavia, mancano trattamenti profilattici efficaci per i pazienti con rigetto cardiaco dell'allotrapianto. Pertanto, sono necessari studi su modelli animali che chiariscano i meccanismi fisiologici alla base del rigetto immunologico e patologico degli allotrapianti cardiaci. Tali studi contribuirebbero allo studio di nuovi bersagli necessari per sviluppare farmaci efficaci, che contribuirebbero a prevenire il rigetto cardiaco dell'allotrapianto e a migliorare i tassi di sopravvivenza in quelle popolazioni di pazienti.

Alcuni potenziali meccanismi immunologici e fisiopatologici di rigetto cardiaco allogenico sono stati recentemente proposti in studi su modelli murini di trapianto di cuore eterotopico ^3,4,5. Di conseguenza, il trapianto di cuore eterotopico di topo è diventato un modello preclinico ideale per studiare i meccanismi di rigetto immunitario e danno patologico che si verificano negli allotrapianti cardiaci dopo trapianto di cuore a causa della loro elevata omologia con i geni umani. Il concetto prevalente è quello di eseguire il trapianto eterotopico in un modello murino mediante anastomosi addominale end-to-end nell'aorta ricevente e nella vena cava inferiore utilizzando punti, simili alla normale anatomia umana. Tuttavia, questa procedura può interferire con l'afflusso di sangue del ricevente e il reflusso venoso della parte inferiore del corpo⁶. Pertanto, qui viene proposta una procedura di trapianto di cuore eterotopico modificata in un modello murino.

Il cuore del donatore viene impiantato con l'arteria carotide e la vena giugulare del ricevente mediante un'anastomosi cervicale end-to-end utilizzando una tecnica di bracciale modificata. Questa procedura modificata ha facilitato la fattibilità operativa e ha assicurato la sopravvivenza dell'innesto cardiaco senza interferire con l'afflusso di sangue e il reflusso venoso della parte inferiore del corpo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, ottava edizione, National Research Council (US) 2011. Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del Chongqing University Cancer Hospital, Chongqing, Cina. Topi maschi BALB/c e C57BL/6 del peso di 20-30 g, ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali), sono stati utilizzati per lo studio del trapianto di cuore allogenico. I topi C57BL/6 sono stati utilizzati come donatori e riceventi singeneici, mentre i topi BALB/c sono serviti come riceventi allogenici. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 1.
NOTA: Tutte le forniture utilizzate durante l'intervento chirurgico, compresi gli strumenti e le soluzioni chirurgiche, sono sterili. La procedura chirurgica aderisce al principio della tecnica di operazione asettica.

1. Procedura del destinatario

1. Indurre l'anestesia generale mediante inalazione di isoflurano al 5% attraverso una camera di induzione di 15 x 10 x 10 cm collegata con una cappa (vedere Tabella dei materiali).
2. Fissare il mouse ricevente sul tavolo operatorio con una piastra riscaldante. Mantenere l'anestesia con inalazione continua di isoflurano al 2% attraverso una maschera facciale sul naso e sulla bocca.
   NOTA: La frequenza respiratoria e il ritmo rallentati, la scomparsa del riflesso corneale e l'assenza del riflesso del pedale nelle dita dei piedi indicano l'efficacia dell'anestesia.
3. Dopo aver rasato i capelli, disinfettare la zona chirurgica con tre cicli alternati di scrub povidone-iodio seguiti da alcool. Quindi, incidere la pelle 1,5-2 cm parallelamente alla linea mediana cervicale dall'angolo mandibolare destro all'estremità della coda.
4. Sezionare ~ 1 cm della vena giugulare esterna destra usando un elettrocoagulatore e microforze. Tagliare la vena all'estremità prossimale con un morsetto microvascolare atraumatico e ligarla all'estremità distale.
5. Far passare l'estremità distale della vena attraverso un bracciale in poliuretano spinato da 22 G (vedi Tabella dei materiali) con un'estremità smussata e scanalature superficiali. Fissare la vena con il manico del bracciale usando un morsetto microvascolare.
6. Rimuovere l'8-0 sutura di legatura all'estremità distale, girare il lume sopra il bracciale agganciato dalla sbavatura superficiale al rovescio e fissare con una sutura chirurgica 10-0 nelle scanalature della superficie.
7. Resecare la ghiandola sublinguale destra per formare una fossa per l'impianto dell'innesto cardiaco e riservare il lobo destro della ghiandola sottomascellare e lo sternocleidomastoide destro.
8. Sezionare l'arteria carotide comune destra per ~ 1 cm usando una pinza micro-pinza e tagliare l'arteria con un morsetto microvascolare atraumatico all'estremità prossimale. All'estremità distale, ligate e tagliano l'arteria.
9. Far passare l'estremità distale dell'arteria attraverso un bracciale spinato in poliuretano da 26 G (vedi Tabella dei materiali) con un'estremità smussata e scanalature sulla superficie. Fissare l'arteria con il manico del bracciale utilizzando un morsetto microvascolare.
10. Rimuovere la sutura di legatura all'estremità distale, capovolgere il lume sopra il bracciale e fissare con una sbavatura superficiale e solchi con una sutura chirurgica 10-0.
11. Dopo aver preparato i vasi del ricevente, far cadere 100 UI / ml di soluzione salina di eparina sui vasi per prevenire la trombosi. Coprire l'incisione cervicale con una garza salina bagnata sterile per il successivo impianto.

2. Procedura del donatore

1. Utilizzare la stessa procedura anestetica (fase 1.1) per il topo donatore.
2. Rasare i peli addominali con un rasoio elettrico e disinfettare l'area chirurgica con tre cicli alternati di scrub povidone-iodio seguiti da alcool.
3. Incidi l'addome (2-3 cm) con una forbice lungo la linea mediana dalla sinfisi pubica al subxifoide ed espandi l'area incisa con un divaricatore.
4. Sezionare 1 cm dell'aorta addominale e della vena cava inferiore utilizzando un elettrocoagulatore e una pinza micro-forze, ed eseguire l'eparinizzazione iniettando 1 mL di soluzione fisiologica integrata con 250 UI/mL di eparina attraverso la vena cava inferiore. Dopo questo, asportare l'aorta addominale e la vena cava inferiore.
5. Eliminare il torace lungo la linea ascellare anteriore su entrambi i lati usando una forbice chirurgica per separare la parete toracica. Ligate la vena cava superiore con un 8-0 sutura chirurgica.
6. Inserire un ago del cuoio capelluto nella vena cava inferiore sopraepatica. Quindi, iniettare soluzione fisiologica ghiacciata integrata con 100 UI / ml di eparina attraverso l'ago del cuoio capelluto dalla vena cava inferiore sopraepatica per perfondere il cuore del donatore fino a quando il colore del sangue svanisce.
7. Ri-perfondere il cuore del donatore con 2-3 ml di soluzione ghiacciata di istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK) (vedere Tabella dei materiali) utilizzando un ago del cuoio capelluto dall'arco aortico per proteggere il miocardio del donatore. Il tempo medio di ischemia calda è di 5 min.
8. Ligare la vena cava superiore e inferiore e la vena polmonare con una sutura chirurgica 5-0. Sezionare e tagliare l'aorta del donatore e l'arteria polmonare prima della loro ramificazione. Successivamente, dividere la vena cava superiore e inferiore e la vena polmonare per rimuovere il cuore del donatore.

3. Impianto

1. Impiantare il cuore del donatore nella tasca cervicale del topo ricevente in posizione invertita.
2. Tirare il bracciale con una vena giugulare ricevente estroflessa nel lume dell'arteria polmonare del donatore per eseguire l'anastomosi end-to-end dell'arteria polmonare del donatore alla vena giugulare esterna ricevente. Azionare il bracciale utilizzando le scanalature sulla superficie attraverso una sutura chirurgica 10-0 per fissare l'anastomosi.
3. Utilizzare una procedura simile per l'anastomosi end-to-end dell'aorta del donatore all'arteria carotide ricevente.
4. Rilasciare il morsetto microvascolare atraumatico della vena giugulare seguito dall'arteria carotide per ri-perfondere il cuore del donatore. Il tempo medio di ischemia fredda è di 15 minuti.
5. Fissare l'innesto cardiaco e suturarlo correttamente per evitare la torsione dell'innesto.
6. Chiudere l'incisione cervicale con suture continue utilizzando una sutura monofilamento in poliammide 5-0 (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Rimuovere la sutura dopo che la ferita è completamente guarita.
7. Conservare il topo ricevente all'interno di una gabbia calda, asciutta e pulita fino a quando non si riprende dall'anestesia.
   NOTA: Ci vogliono 5-10 minuti per recuperare.
8. Iniettare buprenorfina (0,05 mg/kg) per via sottocutanea nel topo ricevente ogni 6 ore per 48 ore per l'analgesia postoperatoria.
   NOTA: Il dosaggio di analgesia è stato ottimizzato per questo studio. Tuttavia, il regime di analgesia può essere esteso / modificato se c'è qualche segno di dolore in conformità con le linee guida istituzionali sull'uso degli animali.

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Risultati

In questo modello di trapianto di cuore eterotopico cervicale di topo, il tasso di sopravvivenza dei topi riceventi era di circa il 95,2% (20 topi su 21 sono sopravvissuti). La causa primaria di morte era il sanguinamento postoperatorio. Il battito cardiaco accelerato con un ritmo regolare serve come indicatore della sopravvivenza del cuore del donatore impiantato.

I topi C57BL/6 e BALB/c erano di tipo MHC (H-2b) e MHC (H-2d) in questo modello, rispettivamente ^7,8<...

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Discussione

Il modello di trapianto di cuore di topo contribuisce allo studio dei meccanismi di rigetto dopo il trapianto di cuore, contribuendo allo sviluppo di approcci unici per migliorare la sopravvivenza a lungo termine dei riceventi di allotrapianti cardiaci. Tuttavia, il trapianto di cuore nei topi è un compito complesso e impegnativo, che richiede un alto livello di tecniche di microchirurgia, specialmente nell'anastomosi vascolare^11,12,13

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274