Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Riepilogo

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Abstract

L'ubiquitilazione è una modifica post-traduzionale che si verifica nelle cellule eucariotiche che è fondamentale per la regolazione di diversi percorsi biologici, tra cui la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la differenziazione. È un processo reversibile che consiste in un attaccamento covalente di ubiquitina al substrato attraverso una reazione a cascata di almeno tre diversi enzimi, composti da E1 (enzima di attivazione dell'ubiquitina), E2 (enzima coniugante dell'ubiquitina) ed E3 (enzima Ubiquitina-ligasi). Il complesso E3 svolge un ruolo importante nel riconoscimento del substrato e nell'ubiquitilazione. Qui, viene descritto un protocollo per valutare l'ubiquitilazione del substrato nelle cellule di mammifero utilizzando la co-trasfezione transitoria di un plasmide che codifica il substrato selezionato, una ubiquitina ligasi E3 e un'ubiquitina marcata. Prima della lisi, le cellule trasfettate vengono trattate con l'inibitore del proteasoma MG132 (carbobenzossi-leu-leu-leucinale) per evitare la degradazione proteasomiale del substrato. Inoltre, l'estratto cellulare viene sottoposto a immunoprecipitazione su piccola scala (IP) per purificare il substrato poliubiquitilato per la successiva rilevazione mediante western blotting (WB) utilizzando anticorpi specifici per il tag ubiquitina. Quindi, viene descritto un protocollo coerente e semplice per il test di ubiquitilazione nelle cellule di mammifero per aiutare gli scienziati ad affrontare l'ubiquitilazione di substrati specifici e le ligasi di ubiquitina E3.

Introduzione

Le modificazioni post-traduzionali (PTM) sono un meccanismo importante per quanto riguarda la regolazione delle proteine, che è essenziale per l'omeostasi cellulare. L'ubiquitilazione proteica è una modifica dinamica e intricata che crea un assortimento di segnali diversi con conseguenti diversi risultati cellulari negli organismi eucariotici. L'ubiquitilazione è un processo reversibile che consiste nell'attaccamento di una proteina di ubiquitina contenente 76 amminoacidi al substrato, che si verifica in una cascata enzimatica composta da tre reazioni distinte¹. Il primo passo è caratterizzato dall'attivazione dell'ubiquitina, che dipende da un'idrolisi dell'ATP per formare un'ubiquitina legata al tioestere ad alta energia tra l'ubiquitina C-terminus e il residuo di cisteina presente nel sito attivo dell'enzima E1. Successivamente, l'ubiquitina viene trasferita all'enzima E2 formando un complesso simile al tioestere con l'ubiquitina. Successivamente, l'ubiquitina viene attaccata covalentemente al substrato dall'E2, o più spesso, dall'enzima E3, che riconosce e interagisce con il substrato ^2,3. Occasionalmente, gli enzimi E4 (fattori di allungamento della catena dell'ubiquitina) sono necessari per promuovere l'assemblaggio della catena multiubiquitina³.

L'ubiquitina ha sette residui di lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63), consentendo la formazione di catene di poliubiquitina che generano legami distinti per produrre diverse strutture tridimensionali che saranno riconosciute da diverse proteine effettrici ^4,5. Quindi, il tipo di catena di poliubiquitina introdotta nel substrato è essenziale per decidere il suo destino cellulare ^6,7,8. Inoltre, il substrato potrebbe anche essere ubiquitinato attraverso i suoi residui N-terminali chiamati N-degrons. Specifiche ubiquitina-ligasi E3 sono responsabili del riconoscimento dell'N-degron, consentendo la poliubiquitilazione del vicino residuo di lisina⁹.

Al giorno d'oggi, ci sono più di 40 diversi substrati specifici SCF caratterizzati. Tra questi, i regolatori chiave di diversi percorsi biologici, tra cui la differenziazione e lo sviluppo cellulare, nonché la sopravvivenza e la morte cellulare, possono essere trovati ^10,11,12,13. Pertanto, l'identificazione di substrati specifici di ciascuna ubiquitina-ligasi E3 è essenziale per progettare una mappa completa di vari eventi biologici. Anche se l'identificazione di veri substrati è biochimicamente impegnativa, l'uso di metodi basati sulla biochimica è molto adatto per valutare la specificità della catena e la distinzione tra mono- e poliubiquitilazione¹⁴. Questo studio descrive un protocollo completo per il test di ubiquitilazione utilizzando la linea cellulare di mammiferi HEK293T sovraesprimendo il substrato UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) con il complesso E3 ubiquitina-ligasi SCF (Fbxo7). UXT-V2 è un co-fattore essenziale per la segnalazione di NF-κB e, una volta che questa proteina viene abbattuta nelle cellule, inibisce l'attivazione NF-κB indotta da TNF-α¹¹. Pertanto, per rilevare UXT-V2 poliubiquitilato, viene utilizzato l'inibitore del proteasoma MG132 poiché ha la capacità di bloccare l'attività proteolitica della subunità 26S del complesso proteasoma¹⁵. Inoltre, l'estratto cellulare viene sottoposto a un IP su piccola scala per purificare il substrato, utilizzando un anticorpo specifico immobilizzato alla resina di agarosio per la successiva rilevazione da parte di WB utilizzando anticorpi selezionati. Questo protocollo è molto utile per convalidare l'ubiquitilazione del substrato nell'ambiente cellulare e può anche essere adattato per diversi tipi di cellule di mammifero e altri complessi E3 ubiquitina-ligasi. Tuttavia, è necessario convalidare il substrato testato anche attraverso un test di ubiquitilazione in vitro, poiché entrambi i protocolli si completano a vicenda per quanto riguarda l'identificazione di substrati reali.

Protocollo

NOTA: Una panoramica del protocollo di analisi dell'ubiquitilazione nelle cellule di mammifero è rappresentata nella Figura 1.

Figura 1. Panoramica della procedura di analisi dell'ubiquitilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Coltura cellulare

1. Coltiva la linea cellulare HEK293T in un piatto di coltura trattato tc da 100 mm fino all'80% -90% di confluenza nei mezzi di crescita (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ad alto glucosio integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e penicillina (100 unità), streptomicina (100 μg) e L-glutammina (0,292 mg / mL)). Incubare la coltura a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO₂.
2. Per passare le cellule, aspirare il mezzo dal piatto di coltura usando una pipetta sierologica. Lavare le cellule una volta con 1 mL di soluzione salina sterilizzata 1x tamponata con fosfato (PBS 1x).
3. Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA (acido etilendiamminotetraacetico). Incubare il piatto a 37 °C per 5 min. Risospesso le cellule utilizzando una pipetta sierologica in 2 ml di terreno di crescita.
4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo fresco e pulito da 15 ml e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere il surnatante versandolo con cura. Risospesciare delicatamente il pellet cellulare in 3 ml di terreno di crescita pipettando su e giù per ottenere una sospensione cellulare omogenea.
5. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in una capsula di coltura da 100 mm trattata con TC contenente 9 mL di terreno di crescita.
   NOTA: Se le cellule sono in buone condizioni, ogni piatto di coltura di HEK293T, in cui la confluenza è dell'80% -90%, può generare tre piatti di coltura con confluenza dell'80% 2 giorni dopo il passaggio.

2. Trasfezione cellulare

NOTA: Non è consigliabile trasfettare la coltura cellulare se la confluenza raggiunta è inferiore all'80%.

1. Prima della trasfezione, certificare se le cellule sono esenti da contaminazione e ad una confluenza adeguata per le trasfezioni transitorie.
2. Per ogni campione di trasfezione, preparare i complessi DNA-Polietilenimina (PEI 1 μg/μL a pH 7,2) come segue:
   1. Diluire 3 μg di ciascun plasmide in 100 μL di opti-MEM I mezzo sierico ridotto senza integrazione e mescolarlo delicatamente pipettando la soluzione su e giù.
      NOTA: Qui, le cellule sono state trasfettate con 4 μg di ciascun plasmide: vettori vuoti (pcDNA3) o costrutti FLAG-Fbxo7 e UXT-V2-HA, con o senza 6xHis-myc-ubiquitina. Il contenuto totale di DNA era di 12 μg.
   2. Scongelare il PEI a RT e aggiungerlo nella soluzione seguendo una proporzione di 3 μL di PEI per 1 μg di DNA. Omogeneizzare la soluzione tubando su e giù. Quindi incubarlo per 15 minuti a RT per consentire la formazione di complessi DNA-PEI.
      NOTA: La proporzione ottimale di volume di PEI per quantità di DNA varia a seconda della linea cellulare selezionata.
3. Aggiungere il volume totale dei complessi DNA-PEI a ciascun piatto contenente la coltura cellulare e mescolarlo delicatamente facendo oscillare la piastra avanti e indietro. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO₂.
4. Sostituire il mezzo di crescita dopo 5 ore, poiché l'esposizione prolungata al PEI può essere tossica per le cellule HEK293T. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO₂ per 36 ore.

3. Lisi cellulare e immunoprecipitazione

1. Dopo il periodo di incubazione e 6 ore prima della lisi cellulare, trattare le cellule trasfettate con 10 μM dell'inibitore del proteasoma MG-132. Ancora una volta, incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di CO₂.
2. Aspirare il materiale da ogni piatto di coltura usando una pipetta sierologica e lavarlo una volta con 1 ml di 1x PBS. Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina e incubando il piatto a 37 °C per 5 min. Risospendare le cellule in 1 mL di mezzi di crescita.
3. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml fresco e pulito e centrifugarla a 500 x g per 5 minuti a RT.
4. Rimuovere il surnatante versandolo con cura. Risospenare delicatamente il pellet cellulare in 200 μL di tampone di lisi NP-40 ghiacciato (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl e 1% NP-40), integrato con il cocktail inibitori della proteasi e della fosfatasi (10 mM NaF e 1 mM Na₃VO₄) e trasferire la soluzione in un microtubo pulito da 1,5 mL.
5. Incubare il lisato cellulare per 30 minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, centrifugare i lisati cellulari a 16.900 x g per 20 minuti a 4 °C.
6. Nel frattempo, equilibrare le perle di agarosio-anti-HA con un tampone di lisi NP-40 ghiacciato. Utilizzare 15 μL di perline di agarosio-anti-HA per ogni campione. Lavare le perline con 200 μL di tampone di lisi NP-40 pulsandolo in un tubo microcentrifuga a 3.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Con una pipetta, aspirare e scartare il surnatante con molta attenzione; ripetere questo processo tre volte. Successivamente, mantenere le perline equilibrate sul ghiaccio fino all'uso.
7. Dopo aver centrifugato i lisati cellulari, recuperare il surnatante. Quantificare il contenuto proteico nel lisato totale utilizzando il metodo Bradford¹⁶.
8. Assicurarsi che ogni campione sottoposto a immunoprecipitazione presenti una quantità uguale di proteine. Incubare il volume necessario di lisato cellulare con le perle equilibrate di agarosio-anti-HA per 4 ore, ruotando delicatamente in un incubatore rotante a 4 °C, che consente all'UXT-V2-HA di legarsi alle perle di agarosio-anti-HA.
9. Raccogliere le perle di agarosio-anti-HA pulsandole in un tubo microcentrifuga a 3.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Aspirare con cura ed scartare il surnatante. Lavare le perline tre volte con tampone di lisi cellulare NP-40 ghiacciato e due volte con tampone FLAG/HA ghiacciato (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl e 0,1% NP-40).
10. Dopo il lavaggio finale, rimuovere accuratamente tutto il surnatante utilizzando una pipetta ed eluire la proteina poliubiquitilata con peptide HA (300 μg/mL) diluito su tampone FLAG/HA. Incubare le perle di agarosio-anti-HA con peptide HA per 1 ora a 4 °C in una piattaforma shaker a dondolo.
11. Abbassare le perline a 3.000 x g per 2 minuti a 4 °C e pipettare con cura il surnatante contenente le proteine poliubiquitinate. Se necessario, conservare l'eluato in un microtubo fresco e pulito a -20 °C.
12. Risolvere gli eluati e i lisati cellulari in 10% SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide)¹⁷ e immunoblotting.
13. In questo studio, è stato eseguito un WB a trasferimento umido. Per questo tipo di trasferimento, posizionare il gel in un sandwich di trasferimento composto da carta da filtro-gel-membrana-carta da filtro, ammortizzarlo con pastiglie e premerlo insieme da una griglia di supporto. Posizionare questo sistema verticalmente in un serbatoio pieno di buffer di trasferimento e tra elettrodi a filo di acciaio inossidabile / platino. Il trasferimento avviene per 90 min a 150 V in tampone di trasferimento umido (glicina 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% metanolo).
    NOTA: Poiché gli estratti cellulari sono stati quantificati (fase 3.7), eseguire una SDS-PAGE con una quantità uguale di proteine per ciascun campione. Inoltre, per risolvere l'eluato, eseguire volumi uguali di ciascun campione.
14. Sondare la membrana immunoblot utilizzando anticorpi selezionati ¹¹. Assicurarsi che venga rilevato un segnale di striscio nell'eluato dal substrato poliubiquitilato estratto nel processo IP utilizzando anticorpi anti-myc nei campioni contenenti la legasi E3 wild-type, il substrato e myc-ub. Nel lisato cellulare (input), assicurarsi che venga rilevato il segnale proveniente dal substrato scelto, la proteina Fbxo7, le proteine ubiquitilate e una proteina di pulizia (ad esempio, GAPDH e β-actina) per garantire la stessa quantità di proteine in ogni corsia.
    NOTA: La diluizione per ciascun anticorpo utilizzato è stata preparata secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

UXT (trascrizione ubiquitariamente espressa) è una proteina simile alla prefoldina che forma complessi di ripiegamento proteico ubiquitariamente espressi nei tessuti di topo e umani come cuore, cervello, muscolo scheletrico, placenta, pancreas, rene e fegato¹⁸. Due isoforme di giunzione di UXT, che sono denominate UXT-V1 e UXT-V2, sono state descritte mentre svolgono funzioni distinte e posizioni subcellulari. UXT-V1 è prevalentemente localizzato nel citoplasma e all'interno dei mitocondri, ed ?...

Discussione

L'ubiquitilazione è una modificazione post-traduzionale essenziale che regola i livelli di diverse proteine e svolge un ruolo cruciale in molte vie di segnalazione e processi biologici, garantendo un ambiente intracellulare sano. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è uno dei principali focus della recente ricerca farmaceutica, fornendo la possibilità di stabilizzare i soppressori tumorali o indurre la degradazione dei prodotti oncogeni²². Ad esempio, la proliferazione aberrante delle neoplas...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Axygen	PMI110-06A
100 mm TC-treated culture dish	Corning	430167
15 mL tube	Corning	430766
96-well plate	Cralplast	655111
Agarose-anti-HA beads	Sigma-Aldrich	E6779
Anti Mouse antibody	Seracare	5220-0341	Goat anti-Mouse IgG
Anti Rabbit antibody	Seracare	5220-0337	Goat anti-Rabbit IgG
Anti-Actin antibody	Sigma-Aldrich	A3853	Dilution used: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibody	Sigma-Aldrich	SAB1407251	Dilution used: 1:1000
Anti-HA antibody	Sigma-Aldrich	H3663	Dilution used: 1:1000
Anti-Myc antibody	Cell Signalling	2272	Dilution used: 1:1000
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500ML
BSA	Sigma-Aldrich	A9647-100G	Bovine Serum Albumin
Cell incubator	Nuaire	NU-4850
Centrifuge	Eppendorf	5804R	500 x g for 5 min
ChemiDoc	BioRad
Digital pH meter	Kasvi	K39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Corning	10-017-CRV	High glucose
Fetal bovine serum	Gibco	F4135	Filtrate prior use
HA peptide	Sigma-Aldrich	I2149
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
Hepes	Gibco	15630080
KCl	VWR Life Science	0365-500G
Kline rotator	Global Trade Technology	GT-2OIBD
MG-132	Boston Biochem	I-130
Microcentrifuge	Eppendorf	5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600016
NP40 (IGEPAL CA-630)	Sigma-Aldrich	I8896-100ML
Optical microscope	OPTIKA microscopes	SN510768
Opti-MEM	Gibco	31985-070
pcDNA3	Invitrogen	V79020	For mammalian expression
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI
Pen Strep Glutamine 100x	Gibco	10378-016
Phosphate buffered saline 10x	AccuGENE	51226	To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	9002-98-6
Ponceau S	VWR Life Science	0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST	Sigma-Aldrich	S8820
Rocking Shaker	Kasvi	19010005
SDS-PAGE system	BioRad	165-8004
Solution Homogenizer	Phoenix Luferco	AP-22
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066-500G
Trypsine (TrypLe Express)	Gibco	12605-028
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology	SC-2048