Utilizzo di un'iniezione cell-tracer per studiare l'origine delle cellule che formano neointima in un modello di parete laterale sacculare di ratto

Riepilogo

Abbiamo eseguito un'iniezione di tracciante cellulare lipofila a un punto per tracciare le cellule endoteliali, seguita da un'arteriotomia e sutura degli aneurismi della parete laterale sull'aorta addominale del ratto. La formazione di Neointima sembrava dipendente dall'arteria madre negli aneurismi decellularizzati ed è stata promossa dal reclutamento da cellule della parete dell'aneurisma in pareti vitali ricche di cellule.

Abstract

Il clipping microchirurgico crea una successiva barriera del flusso sanguigno negli aneurismi intracranici, mentre il trattamento endovascolare si basa sulla formazione di neointima e trombo. La fonte delle cellule endoteliali che coprono lo strato endoluminale del neointima rimane poco chiara. Pertanto, lo scopo del presente studio era quello di studiare l'origine delle cellule che formano neointima dopo l'iniezione di tracciante cellulare nel già consolidato modello di aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki.

Gli aneurismi laterali sono stati creati suturando sacche arteriose decellularizzate o vitali end-to-side all'aorta nei ratti Lewis maschi. Prima dell'arteriotomia con sutura dell'aneurisma, è stata eseguita un'iniezione di tracciante cellulare contenente colorante CM-Dil nell'aorta bloccata per etichettare le cellule endoteliali nel vaso adiacente e tracciare la loro proliferazione durante il follow-up (FU). Trattamento seguito da avvolgimento (n = 16) o stenting (n = 15). Al FU (7 giorni o 21 giorni), tutti i ratti sono stati sottoposti ad angiografia a fluorescenza, seguita da raccolta di aneurisma e valutazione macroscopica e istologica con conta cellulare immunoistologica per specifiche regioni di interesse.

Nessuno dei 31 aneurismi si era rotto al follow-up. Quattro animali sono morti prematuramente. La perfusione macroscopicamente residua è stata osservata nel 75,0% dei ratti a spirale e nel 7,0% dei ratti stentati. La quantità di cellule tracer-positive era significativamente elevata negli aneurismi stentati decellularizzati rispetto agli aneurismi a spirale rispetto al trombo il giorno 7 (p = 0,01) e neointima al giorno 21 (p = 0,04). Non sono state riscontrate differenze significative nel trombo o nella neointima negli aneurismi vitali.

Questi risultati confermano modelli di guarigione peggiori in spirale rispetto agli aneurismi stentati. La formazione di Neointima sembra particolarmente dipendente dall'arteria madre negli aneurismi decellularizzati, mentre è supportata dal reclutamento da cellule della parete dell'aneurisma in pareti vitali ricche di cellule. In termini di traduzione, il trattamento con stent potrebbe essere più appropriato per gli aneurismi altamente degenerati, mentre l'avvolgimento da solo potrebbe essere adeguato per gli aneurismi con pareti dei vasi per lo più sane.

Introduzione

L'emorragia subaracnoidea causata dalla rottura di un aneurisma intracranico (IA) è una condizione neurochirurgica devastante associata ad alta morbilità e mortalità 1,2,3,4. Oltre al clipping microchirurgico, che fornisce un contatto diretto tra endotelio ed endotelio, i dispositivi endovascolari hanno acquisito un'importanza crescente negli ultimi decenni per il trattamento delle IA rotte e scoperte incidentalmente. La risposta di guarigione nelle IA trattate endovascolarmente dipende principalmente dalla formazione di neointima e dall'organizzazione del trombo. Entrambi sono processi sinergici, a seconda della migrazione cellulare dal vaso adiacente e dalla parete dell'aneurisma. ⁵ Ad oggi, l'origine delle cellule endoteliali nella formazione neointima degli aneurismi trattati endovascolari rimane poco chiara. C'è un dibattito in corso in letteratura sulla fonte da cui vengono reclutate le cellule che formano neointima.

Utilizzando un'iniezione cell-tracer di colorante CM-Dil (vedi tabella dei materiali) nell'aorta addominale dei ratti, abbiamo mirato ad analizzare il ruolo delle cellule endoteliali, originarie dell'arteria madre, nella formazione di neointima in due diversi punti temporali FU (giorno 7 e giorno 21) (Figura 1). Un vantaggio del modello è l'incubazione diretta del tracciante cellulare locale in vivo in un'arteria genitore prima della sutura dell'aneurisma, consentendo la FU in punti temporali successivi. Le tecniche di iniezione in vivo , come l'incubazione cell-tracer, non sono state descritte in letteratura. Un vantaggio di questa tecnica è l'iniezione diretta, a un punto, intraoperatoria, in vivo , che rende il modello robusto e riproducibile.

Protocollo

Il supporto veterinario è stato eseguito secondo le linee guida istituzionali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico locale, Svizzera (BE 60/19). Le linee guida ARRIVE e i principi 3R sono stati rigorosamente seguiti ^6,7. Trentuno ratti Lewis maschi, di 12 settimane di età e del peso di 492 ± 8 g, sono stati inclusi. Ospitare tutti i ratti a una temperatura ambiente di 23 °C e un ciclo luce/buio di 12 ore. Fornire l'accesso gratuito ad acqua e pellet. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test non parametrico Wilcoxon-Mann-Whitney U. I valori di probabilità (p) di ≤ 0,05 e/o ≤ 0,01 sono stati considerati significativi.

1. Preparazione generale di fase preoperatoria e aspetti anestesiologici

1. Randomizzare i ratti in gruppi di trattamento a bobina o stent (Figura 2) tramite un sistema di randomizzazione basato sul web. Ora, esegui un esame clinico preoperatorio di tutti gli animali previsti per l'intervento chirurgico accanto a una sala operatoria silenziosa e asettica mantenendo una temperatura ambiente di 23 ± 3 ° C. Analizzare il comportamento degli animali e ispezionare le mucose e il turgore come parte dell'esame clinico preoperatorio.
2. Registra il peso di ogni animale.
3. Prima dell'intervento chirurgico, incubare le sacche arteriose da ratti donatori in 0,1% di sodio dodecil solfato per 10 ore a 37 °C per ottenere aneurismi decellularizzati⁸. Raccogli queste buste dagli animali donatori pochi giorni prima dell'intervento.
   1. Preparare l'intera lunghezza dell'aorta addominale con microscissori e pinze e applicare 6-0 legature non assorbibili ad un intervallo di 3-4 mm.
   2. Generare direttamente aneurismi vitali per via intraoperatoria da una sacca del vaso arterioso precedentemente legata dalla parte toracica di un animale donatore⁹. Eseguire la toracotomia con forbici e pinze chirurgiche nel punto temporale FU indicato e legare la sacca del vaso alla lunghezza desiderata.
4. Impiantare direttamente la sacca nel ricevente e raccogliere l'aneurisma dall'animale donatore per ulteriori analisi macroscopiche ed elaborazione istologica.
5. Per l'induzione dell'anestesia, mettere tutti i ratti in una scatola pulita fornita di ossigeno (O₂) fino alla perdita di coscienza dopo 5-10 minuti. Anestetizzare i ratti con un'iniezione sottocutanea (SC) di una miscela di fentanil 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg e midazolam 2 mg/kg.
   NOTA: Questo garantisce un piano chirurgico di almeno 45 min.
6. Controllare la profondità dell'anestesia dall'assenza del riflesso di prelievo del pedale.
7. Posizionare i ratti in posizione supina e radere la parte toraco-addominale con un rasoio elettrico.
8. Fissare le 4 zampe dei ratti con del nastro adesivo su una tavola, coperta da una piastra riscaldante collegata a una sonda rettale autoregolante. Inserire la sonda rettale nell'ano del ratto per mantenere la temperatura desiderata di 37 °C con l'aiuto della piastra riscaldante.
9. Ora, installare un sensore sulla zampa posteriore destra collegato a un sistema computerizzato per il controllo intraoperatorio dei segni vitali.
10. Coprire il naso e la bocca del ratto con una maschera per il viso. Se si richiede un'anestesia prolungata, iniziare l'isoflurano (1,0-2,0% titolato per effetto in 100% O₂).
11. Disinfettare il campo chirurgico con povidone-iodio o disinfettanti alternati e drappeggiare il campo chirurgico in modo sterile.
12. Per la cura perianestetica, applicare un lubrificante oftalmico sterile sugli occhi e coprirli con una maschera di alluminio opaco per evitare l'essiccazione e il danneggiamento della lampada chirurgica.
13. Durante l'intervento chirurgico, fornire ossigeno continuamente attraverso la maschera facciale, monitorare la temperatura corporea e fornire calore utilizzando una piastra riscaldante, mantenendo la normotermia.
14. Monitorare continuamente altri segni vitali (distensione del polso e del respiro, frequenza cardiaca e respiratoria e saturazione di ossigeno).

2. Fase operativa - iniezione di cell-tracer

NOTA: L'approccio chirurgico dettagliato nell'aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki modello⁹ e le tecniche per l'impianto di bobine e stent sono descritti altrove ^8,10,11.

1. Conservare il tracciante cellulare lipofilo fluorescente a ≤ -20 °C per tutto il tempo, al riparo dalla luce.
2. Eseguire l'intervento chirurgico preparando l'aorta del ratto e la vena cavale, seguita dalla separazione di entrambi, nonché dal bloccaggio temporaneo prossimale e distale dell'aorta.
   NOTA: Questa tecnica è stata descritta in precedenza⁹.
   1. Blocca le parti prossimali e distali dell'aorta con due clip titan temporanee.
3. Metti una microswab con imbottitura viola ciascuna sotto le parti prossimale e distale dell'aorta per una migliore visualizzazione dell'arteria.
4. Ora, proteggi l'addome con una garza bagnata.
5. Il giorno dell'operazione, sciogliere 2 μL del tracciante cellulare mediante pipettaggio in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
6. Trasferire la miscela in una siringa da 1 mL dotata di una cannula sterile da 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
   NOTA: prestare attenzione a evitare l'esposizione alla luce durante l'esecuzione dei passaggi 2.5 e 2.6.
7. Spegnere la luce in sala operatoria. Mentre si guarda al microscopio, eseguire l'iniezione di un punto nella parte ventrale centrale dell'aorta utilizzando micro pinze e iniettare con attenzione 1 mL di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.
8. Iniettare accuratamente il cell-tracer (Video 1) e spegnere immediatamente anche il microscopio operatorio. Ancora una volta, proteggere l'addome con una garza bagnata.
9. Lasciare incubare il colorante per almeno 15 minuti. Dopo il periodo di incubazione, accendere il microscopio e le luci della sala operatoria.
10. Eseguire l'arteriotomia longitudinale e la sutura dell'aneurisma, come descritto altrove¹¹.
    1. Utilizzare microforze e microscissori per eseguire l'arteriotomia in modo che la sua lunghezza sia la media del diametro dell'aneurisma raccolto (fase 1.3). Per garantire la lunghezza corretta, posizionare l'aneurisma accanto all'aorta prima di eseguire l'arteriotomia. Suturare l'aneurisma con 8-10 punti singoli utilizzando una sutura 10-0 non assorbibile e rimuovere con cura i morsetti temporanei - a partire distalmente - sotto irrigazione continua con soluzione salina eparinizzata. Chiudi la ferita in modo stratificato. Da notare, utilizzare una densità di imballaggio della bobina di 1 cm.
       NOTA: La tecnica di impianto di bobina o stent è stata descritta altrove ^8,10.

3. Monitoraggio della fase postoperatoria e cura analgetica

1. Alla fine dell'intervento chirurgico, invertire l'anestesia con una miscela di iniezione SC di buprenorfina 0,05 mg / kg, atipamezolo 0,75 mg / kg e flumazenil 0,2 mg / kg. Lasciare che ogni animale operato si riprenda in una gabbia pulita fino a quando non è completamente sveglio e riscaldato, se necessario, con una lampada riscaldante.
2. Per 3 giorni, somministrare 1 mg/kg di meloxicam (un'iniezione o un'applicazione orale al giorno) e buprenorfina (0,05 mg/kg quattro volte al giorno) SC. Durante la notte, fornire buprenorfina continuamente nell'acqua potabile con lo stesso dosaggio: 6 mL di buprenorfina 0,3 mg/mL, 360 ml di acqua potabile, 10 ml di glucosio al 5%.
3. Nell'immediata fase postoperatoria, ospitare ogni animale in una singola gabbia per la protezione. Raggruppare gli animali dopo 24 ore.
4. Se un ratto mostra un comportamento angosciato o aggressivo dopo l'iniezione di SC, somministrare buprenorfina nell'acqua potabile durante il giorno.
5. Fornire mangime morbido sul pavimento della gabbia per supportare l'alimentazione e il recupero postoperatorio.
6. Osserva e prenditi cura di tutti gli animali secondo il foglio di valutazione del benessere e del dolore.
7. Somministrare l'analgesia sc di salvataggio (meloxicam 1 mg/kg e 0,05 mg/kg di buprenorfina) quando necessario.

Risultati

Un totale di 31 animali sono stati inclusi nel contesto di laboratorio: 27 ratti sono stati inclusi nell'analisi statistica finale; 4 ratti sono morti prematuramente (tasso di mortalità del 12,9%). Per via intraoperatoria, la distensione del respiro è risultata significativamente ridotta (p = 0,03) nei ratti trattati con stent ( 12,9 μm ± 0,7) rispetto ai ratti trattati con bobina (13,5 μm ± 0,6). L'angiografia a fluorescenza è stata eseguita per ogni ratto alla fine del FU finale. La riperfusione è stat...

Discussione

Questo studio dimostra che la formazione di neointima è mediata da cellule endoteliali originarie dell'arteria madre del complesso dell'aneurisma, ma è supportata dal reclutamento di cellule derivate dalla parete dell'aneurisma negli aneurismi vitali. Tuttavia, il ruolo delle cellule progenitrici circolanti nella guarigione dell'aneurisma rimane controverso^12,13. Complessivamente, 31 ratti Lewis maschi sono stati inclusi in questa indagine; solo 4 morirono prem...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary