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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo delinea come un sistema di coltura cellulare tridimensionale può essere utilizzato per modellare, trattare e analizzare le modifiche della cromatina in uno stato quasi fisiologico.

Abstract

Le colture piatte di cellule di mammifero sono un approccio in vitro ampiamente utilizzato per comprendere la fisiologia cellulare, ma questo sistema è limitato nella modellazione dei tessuti solidi a causa della replicazione cellulare innaturalmente rapida. Ciò è particolarmente difficile quando si modella la cromatina matura, poiché le cellule a replicazione rapida sono spesso coinvolte nella replicazione del DNA e hanno una popolazione poliploide eterogenea. Di seguito è presentato un flusso di lavoro per la modellazione, il trattamento e l'analisi delle modifiche della cromatina quiescente utilizzando un sistema di coltura cellulare tridimensionale (3D). Utilizzando questo protocollo, le linee cellulari di carcinoma epatocellulare vengono coltivate come sferoidi 3D riproducibili in un incubatore che fornisce una diffusione attiva dei nutrienti e basse forze di taglio. Il trattamento con butirrato di sodio e succinato di sodio ha indotto un aumento rispettivamente dell'acetilazione e della succinilazione degli istoni. Gli aumenti dei livelli di acetilazione e succinilazione degli istoni sono associati a uno stato di cromatina più aperto. Gli sferoidi vengono quindi raccolti per l'isolamento dei nuclei cellulari, da cui vengono estratte le proteine istoniche per l'analisi delle loro modificazioni post-traduzionali. L'analisi degli istoni viene eseguita tramite cromatografia liquida accoppiata online con spettrometria di massa tandem, seguita da una pipeline computazionale interna. Infine, vengono mostrati esempi di rappresentazione dei dati per indagare la frequenza e la presenza di segni di istoni combinatori.

Introduzione

Dalla fine del 19° secolo, i sistemi di coltura cellulare sono stati utilizzati come modello per studiare la crescita e lo sviluppo delle cellule al di fuori del corpo umano 1,2. Il loro uso è stato esteso anche per studiare come funzionano i tessuti e gli organi in contesti sia sani che malati 1,3. Le cellule in sospensione (ad esempio, le cellule del sangue) crescono in piastre di Petri o fiaschi senza soluzione di continuità e in modo intercambiabile poiché non si assemblano in strutture tridimensionali (3D) in vivo. Le cellule derivate da organi solidi possono crescere in sistemi di coltura bidimensionali (2D) o 3D. Nella coltura 2D, le cellule vengono coltivate in un monostrato che aderisce a una superficiepiana 2,4. I sistemi di coltura cellulare 2D sono caratterizzati da una crescita esponenziale e da un tempo di raddoppio rapido, in genere da 24 ore a pochi giorni5. Le cellule nei sistemi 3D crescono fino a formare intricate interazioni cellula-cellula modellando più da vicino conglomerati simili a tessuti e sono caratterizzate dalla loro capacità di raggiungere un equilibrio dinamico in cui il loro tempo di raddoppio può raggiungere 1 mese o più5.

In questo articolo viene presentata una metodologia innovativa per far crescere sferoidi 3D in sistemi di coltura cellulare rotante che simulano la gravità ridotta6. Questo è un derivato semplificato di un sistema di coltura cellulare introdotto dalla NASA nel 19907. Questo approccio riduce al minimo le forze di taglio, che si verificano nei metodi esistenti come i palloni rotanti, e aumenta la riproducibilità dello sferoide6. Inoltre, il bioreattore rotante aumenta la diffusione attiva dei nutrienti, riducendo al minimo la formazione necrotica che si verifica in sistemi come la coltura cellulare a goccia sospesa in cui lo scambio di media non è pratico6. In questo modo, le cellule crescono per lo più indisturbate, consentendo la formazione di caratteristiche strutturali e fisiologiche associate alle cellule che crescono nei tessuti. Gli epatociti C3A (HepG2 / C3A) coltivati in questo modo non solo avevano organelli ultrastrutturali, ma producevano anche quantità di ATP, adenilato chinasi, urea e colesterolo paragonabili ai livelli osservati in vivo 1,2. Inoltre, le cellule cresciute in sistemi di coltura cellulare 2D vs.3D presentano diversi modelli di espressione genica8. L'analisi dell'espressione genica degli epatociti C3A cresciuti come sferoidi 3D ha mostrato che queste cellule esprimevano una vasta gamma di proteine specifiche del fegato, nonché geni coinvolti in percorsi chiave che regolano la funzionalità epatica8. Pubblicazioni precedenti hanno dimostrato le differenze tra i proteomi di cellule in crescita esponenziale in coltura 2D rispetto alle cellule in equilibrio dinamico in colture sferoidi 3D5. Queste differenze includono il metabolismo cellulare, che a sua volta influenza la struttura, la funzione e la fisiologia della cellula5. Il proteoma delle cellule cresciute in coltura 2D era più arricchito in proteine coinvolte nella replicazione cellulare, mentre il proteoma degli sferoidi 3D era più arricchito nella funzionalità epatica5.

Il tasso di replicazione più lento delle cellule cresciute come sferoidi 3D modella in modo più accurato fenomeni specifici associati allo stato e alle modifiche della cromatina (ad esempio il ritaglio dell'istone9). Il clipping istonico è una modificazione post-traduzionale irreversibile dell'istono (PTM) che causa la scissione proteolitica di parte della coda N-terminale dell'istone. Mentre la sua funzione biologica è ancora in discussione 10,11,12,13, è chiaro che la sua presenza nelle cellule primarie e nel tessuto epatico è modellata da cellule HepG2 / C3A cresciute come sferoidi, ma non come cellule piatte 9. Questo è fondamentale, poiché lo stato della cromatina e le modifiche regolano la lettura del DNA principalmente modulando l'accessibilità ai geni e quindi la loro espressione14. I PTM istonici influenzano direttamente lo stato della cromatina influenzando la carica netta dei nucleosomi in cui sono assemblati gli istoni, o indirettamente reclutando scrittori, lettori e cancellatori di cromatina14. Centinaia di PTM istonici sono stati identificati fino ad oggi15, rafforzando l'ipotesi che la cromatina ospiti un "codice istonico" utilizzato dalla cellula per interpretare il DNA16. Tuttavia, l'identificazione di una miriade di combinazioni PTM15 e la scoperta che le combinazioni di PTM istonici hanno spesso funzioni biologiche diverse dalle PTM presenti in isolamento (ad esempio Fischle, et al.17), evidenzia che è necessario più lavoro per decifrare il "codice istonico".

Attualmente, l'analisi PTM degli istoni si basa su tecniche che utilizzano anticorpi (ad esempio, western blots, immunofluorescenza o immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento [ChIP-seq]) o spettrometria di massa (MS). Le tecniche basate su anticorpi hanno un'elevata sensibilità e possono fornire informazioni dettagliate sulla localizzazione a livello di genoma dei segni istonici, ma sono spesso limitate nello studio di PTM o PTM rari presenti in combinazioni 18,19,20. La SM è più adatta per l'identificazione e la quantificazione imparziali e ad alto rendimento di modificazioni proteiche singole e coesistenti, in particolare proteine istoniche 18,19,20. Per questi motivi, questo e molti altri laboratori hanno ottimizzato la pipeline MS per l'analisi di peptidi istonici (MS bottom-up), code istoniche intatte (MS middle-down) e proteine istoniche a lunghezza intera (MS top-down)21,22,23.

Di seguito è riportato un flusso di lavoro per la coltivazione di sferoidi HepG2 / C3A e la loro preparazione per l'analisi dei peptidi istonici (MS bottom-up) tramite cromatografia nano-liquida, accoppiata online con spettrometria di massa tandem (nLC-MS / MS). È stata coltivata una coltura cellulare 2D e le cellule sono state raccolte e trasferite in un bioreattore dove avrebbero iniziato a formare sferoidi (Figura 1). Dopo 18 giorni in coltura, gli sferoidi sono stati trattati con butirrato di sodio o succinato di sodio per aumentare l'abbondanza relativa di acetilazione e succinilazione degli istoni. In particolare, le colture 3D possono essere trattate con composti genotossici altrettanto bene dei loro equivalenti di coltura piatta; infatti, recenti pubblicazioni evidenziano che la risposta tossicologica delle cellule in coltura 3D è più simile ai tessuti primari rispetto a quelli in coltura piatta 2D 24,25. Le cellule sono state quindi raccolte in punti temporali specificati ed è stato eseguito l'isolamento nucleare. Quindi, gli istoni sono stati estratti e derivatizzati con anidride propionica prima e dopo la digestione della tripsina secondo un protocollo sviluppato per la prima volta da Garcia et al.26. Questa procedura genera peptidi di dimensioni appropriate per la separazione online con cromatografia a fase inversa (C18) e il rilevamento con SM. Infine, i peptidi istonici sono stati identificati e quantificati e i dati generati sono stati rappresentati in più modi per un'interpretazione biologica più completa.

Protocollo

1. Preparazione di tamponi e reagenti

  1. Mezzi di crescita cellulare (per le cellule HepG2/C3A): aggiungere siero bovino fetale (FBS) (10% v/v), aminoacidi non essenziali (1% v/v), integratore di L-glutammina (1% v/v) e penicillina/streptomicina (0,5% v/v) al Modified Eagle's Medium di Dulbecco (DMEM, contenente 4,5 g/L di glucosio). I substrati di crescita vengono conservati a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  2. 200 mM di soluzione di butirrato di sodio (NaBut): per preparare 10 mL, sospendere 220,18 mg di NaBut in 10 mL di ddH2O. Conservare 1 mL aliquote a -20 °C. Prima del trattamento cellulare, filtrare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 mm e aggiungere 1 mL della soluzione filtrata a 9 mL di mezzo di crescita cellulare per una concentrazione di lavoro di 20 mM.
  3. 100 mM di soluzione di succinato di sodio (NaSuc): per preparare 10 mL, sospendere 162,05 mg di NaSuc in 10 mL di ddH2O. Conservare 1 mL aliquote a -20 °C. Prima del trattamento cellulare, filtrare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 mm e aggiungere 1 mL della soluzione filtrata a 9 mL di mezzo di crescita cellulare per una concentrazione di lavoro di 10 mM.
  4. Freddo 0,2 M H2SO4: Per preparare 1 L, aggiungere 10 ml di H2SO4 concentrato a 990 ml di acqua di grado HPLC. Conservare a 4 °C.
  5. Acetone freddo + 0,1% acido cloridrico (HCl): aggiungere HCl concentrato (0,1% v/v) all'acetone. Conservare a 4 °C.
  6. Soluzione nh4HCO3 da 100 mM, pH 8,0: per preparare 1 L, sospendere 7,91 g di NH4HCO3 in 1 L di acqua di grado HPLC. Conservare aliquote da 50 ml a -20 °C.
  7. Soluzione di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%: aggiungere TFA concentrato (0,1% v/v) all'acqua di grado HPLC. Conservare a 4 °C.
  8. Soluzione di acetonitrile al 60%/ TFA allo 0,1%: aggiungere acetonitrile di grado HPLC (60% v/v) all'acqua di grado HPLC. Quindi, aggiungere TFA concentrato (0,1% v / v) a questa soluzione. Conservare a 4 °C.
  9. 2% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico: aggiungere acetonitrile di grado HPLC (2% v / v) all'acqua di grado HPLC. Quindi, aggiungere acido formico concentrato (0,1% v/v) a questa soluzione.
  10. 80% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico: aggiungere acetonitrile di grado HPLC (80% v / v) all'acqua di grado HPLC. Quindi, aggiungere acido formico concentrato (0,1% v/v) a questa soluzione.

2. Preparazione del sistema di coltura 3D

NOTA: Cellule diverse, primarie o immortalizzate, hanno proprietà di coltura diverse, quindi la formazione di sferoidi può differire tra i tipi di cellule. Questo protocollo è stato stabilito per la formazione di sferoidi HepG2/C3A utilizzando bioreattori e un innovativo sistema di coltura cellulare 3D.

  1. Utilizzando mezzi di crescita standard, far crescere le cellule come un monostrato fino a quando non sono confluenti all'80%.
  2. Lavare le cellule con HBSS (5 mL per un pallone da 75 cm2 ) e incubare le cellule con 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% diluita in HBSS (diluizione 1:2) per 5 min a 37 oC con il 5% di CO2.
  3. Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare la tripsina aggiungendo 3 ml di siero bovino fetale (FBS) o mezzo di crescita (contenente il 5%-10% di FBS).
  4. Contare il numero di cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere 1 x 106 celle in un volume massimo di 1,5 ml.
  5. Equilibrare una piastra inferiore rotonda a 24 pozzetti con attacco ultra-basso (contenente più micro-pozzetti per pozzetto) lavando i pozzetti con 0,5 ml di terreno di crescita. Centrifugare la piastra per 5 minuti a 3.000 x g per rimuovere le bolle d'aria dalla superficie del pozzo.
  6. Trasferire la sospensione cellulare nella piastra e centrifugare per 3 minuti a 120 x g.
  7. Incubare la piastra per 24 ore a 37 oC con il 5% di CO2 per la formazione di sferoidi. Nel frattempo, equilibrare il bioreattore riempiendo la camera di umidità con 25 ml di acqua sterile e la camera cellulare con 9 ml di mezzi di crescita.
  8. Incubare il bioreattore, ruotando nell'incubatore clinostat, per 24 ore a 37 oC con il 5% di CO2.

3. Crescita degli sferoidi nei bioreattori

NOTA: per preservare la struttura degli sferoidi, per la gestione delle strutture 3D vengono utilizzate punte di foro largo.

  1. Staccare gli sferoidi dalla piastra di attacco ultra-bassa tubando delicatamente su e giù con punte di foro larghe 1 mL e trasferirli in un piatto trattato con coltura tissutale.
  2. Lavare il piatto con 0,5 ml di terreno di crescita preriscaldato e trasferirlo nello stesso piatto.
  3. Valutare la qualità degli sferoidi al microscopio e selezionare sferoidi sufficientemente formati. Gli sferoidi di buona qualità hanno dimensioni, compattezza e rotondità uniformi.
  4. Trasferire gli sferoidi in bioreattori equilibrati riempiti con 5 ml di terreni di crescita freschi. Dopo aver trasferito gli sferoidi, riempire completamente il bioreattore con mezzi di crescita freschi.
  5. Posizionare il bioreattore nell'incubatore clinostat e regolare la velocità di rotazione a 10-11 giri / min.
  6. Scambia i supporti di crescita ogni 2-3 giorni rimuovendo 10 ml di vecchi supporti e sostituendoli con 10 ml di supporti freschi.
  7. Regola la velocità di rotazione in base alla crescita sferoidale, aumentando man mano che gli sferoidi crescono in dimensioni e numero.
  8. Dopo 18 giorni in coltura, gli sferoidi sono pronti per il trattamento e/o la raccolta

4. Trattamento e raccolta degli sferoidi

NOTA: In questo protocollo, gli sferoidi HepG2/C3A sono trattati con butirrato di sodio (NaBut) e succinato di sodio (NaSuc) per valutare i livelli di segni istonici contenenti acetilazione e succinilazione, rispettivamente.

  1. Preparare i substrati di crescita con l'appropriata concentrazione di lavoro del composto (ad esempio, 20 mM di NaBut o 10 mM NaSuc). Scambiare i media nel bioreattore con i media trattati.
    NOTA: per stabilire una condizione di controllo, raccogliere abbastanza sferoidi per gli esperimenti prima di aggiungere il trattamento o designare un bioreattore per gli sferoidi non trattati.
  2. Raccogliere gli sferoidi per l'analisi proteomica dopo un tempo di trattamento sufficiente (ad esempio, da 48 ore a 1 settimana per il trattamento con NaSuc o 48-72 ore per il trattamento con NaBut).
    NOTA: Per l'estrazione degli istoni utilizzando questo protocollo, sono stati raccolti da sei a otto sferoidi contenenti circa 1 x 106 cellule.
    1. Rimuovere 3-5 ml di media dal bioreattore attraverso la porta superiore.
    2. Aprire la porta anteriore e utilizzare una punta del foro larga 1 mL per rimuovere gli sferoidi e posizionarli in tubi microcentrifuga.
    3. Centrifugare gli sferoidi a 100 x g per 5 minuti e scartare i mezzi.
      NOTA: il supporto nel bioreattore può essere cambiato e il bioreattore può essere restituito all'incubatore per ulteriori tempi di trattamento o recupero.
    4. Lavare gli sferoidi con 200 μL di HBSS per rimuovere l'FBS. Centrifugare a 100 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      NOTA: gli sferoidi possono essere conservati a -80 oC fino all'elaborazione.

5. Estrazione degli istoni

NOTA: I numerosi residui di aminoacidi basici presenti negli istoni permettono loro di interagire strettamente con il DNA, che ha una spina dorsale di acido fosforico. Poiché gli istoni sono alcune delle proteine più basiche nel nucleo, quando vengono estratti con acido solforico ghiacciato (0,2 M H2SO4) c'è una contaminazione minima. Le proteine non istoniche precipiteranno in acido forte. L'acido tricloroacetico altamente concentrato (TCA) diluito ad una concentrazione finale del 33% viene successivamente utilizzato per precipitare gli istoni dall'acido solforico. Conservare tutti i campioni, le provette e i reagenti sul ghiaccio per l'intera estrazione degli istoni.

  1. Aggiungere cinque volumi (~ 100 μL) di freddo 0,2 M H2SO4 al pellet della cella (~ 10-20 μL) e pipettare su e giù per interrompere il pellet e rilasciare istoni.
  2. Incubare tubi per un massimo di 4 ore a rotazione costante o agitazione a 4 oC.
    NOTA: Per i campioni risospesi che hanno un volume superiore a 500 μL, è sufficiente un'incubazione di 2 ore per estrarre gli istoni (un'incubazione più lunga può comportare l'estrazione di altre proteine nucleari di base). Per i campioni risospesi con un volume inferiore a 200 μL, è necessaria un'incubazione di 4 ore per una migliore resa.
  3. Centrifugare a 3.400 x g per 5 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo e scartare il pellet in un secondo momento.
  4. Aggiungere TCA concentrato a freddo in modo tale che costituisca un finale 25%-33% v/v (ad esempio, 40-60 μL di TCA freddo: 120 μL di surnatante) e mescolare invertendo il tubo alcune volte.
  5. Incubare tubi per almeno 1 ora a rotazione costante o agitazione a 4 oC.
    NOTA: per i pellet di partenza di dimensioni più piccole, si consiglia un'incubazione notturna.
  6. Centrifugare a 3.400 x g per 5 min a 4 oC. Scartare il surnatante mediante pipettaggio. Aspirare attentamente il surnatante; non toccare i lati del tubo o del pellet.
    NOTA: gli istoni si depositano su entrambi i lati e sul fondo del tubo. Il pellet bianco insolubile formato nella parte inferiore del tubo contiene principalmente proteine non istoniche e altre biomolecole.
  7. Lavare il tubo (pareti e pellet) con acetone freddo + 0,1% HCl utilizzando una pipetta Pasteur in vetro (~ 500 μL / tubo).
  8. Centrifugare a 3.400 x g per 5 minuti a 4 oC. Scartare il surnatante capovolgendo il tubo.
  9. Lavare il tubo (pareti e pellet) con acetone freddo al 100% utilizzando una pipetta Pasteur in vetro (~ 500 μL / tubo). Centrifuga a 3.400 x g per 5 min a 4 oC.
  10. Scartare il surnatante capovolgendo il tubo e la pipetta fuori dall'acetone rimanente. Aprire il coperchio e asciugare all'aria il campione sul banco per ~ 20 minuti.
  11. Procedere alla propionilazione o conservare i campioni in -80 oC fino all'uso.

6. Primo ciclo di derivatizzazione

NOTA: L'uso della tripsina per digerire le proteine istoniche porta a peptidi eccessivamente piccoli che sono difficili da identificare utilizzando configurazioni proteomiche tradizionali. Per questo motivo, l'anidride propionica viene utilizzata per derivare chimicamente i gruppi ɛ-amminici dei residui di lisina non modificati e monometilici. Questo limita la proteolisi della tripsina ai residui di arginina C-terminale. Per i campioni in piastre a 96 pozzetti, si raccomanda l'uso di pipette e serbatoi multicanale per il prelievo dei reagenti (Figura 2A). La derivatizzazione viene eseguita anche dopo la digestione per etichettare gli N-termini liberi dei peptidi aumentando l'idrofobicità peptidica e quindi la ritenzione cromatografica in fase inversa.

  1. Sospendere i campioni in 20 μL di acetonitrile al 15%-20% in bicarbonato di ammonio da 100 mM (pH 8,0). Vortice per 15 s, e poi spin down a 1.000 x g per 30 s.
  2. Se ci sono otto o più campioni, trasferire ogni campione risospeso in una piastra a 96 pozzetti.
    NOTA: se i campioni non sono stati trasferiti su una piastra a 96 pozzetti, è possibile utilizzare una pipetta a canale singolo nei passaggi 6.3-6.7, 7.1-7.5 e 8.1-8.5.
  3. Sotto il cofano, aggiungere 2 μL di anidride propionica usando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
  4. Aggiungere rapidamente 10 μL di idrossido di ammonio utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
    NOTA: L'acido propionico è un prodotto della reazione tra anidride propionica e ammine libere da peptidi e può ridurre il pH del campione. Il pH 8 può essere ristabilito aggiungendo idrossido di ammonio al campione con un rapporto di 1:5 (v/v).
  5. Assicurarsi che il pH sia 8 utilizzando la carta di prova del pH. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio. Se il pH > 8, regolare aggiungendo 1 μL di acido formico o acetico. Quando il pH > 10, è possibile l'etichettatura di altri residui di aminoacidi con pKa più elevato.
  6. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  7. Ripetere i passaggi 6.3-6.6. Un doppio ciclo di propionilazione degli istoni garantisce un'efficienza di reazione quasi completa.
  8. Piastra asciutta in velocità sottovuoto fino a quando tutti i pozzetti sono completamente asciutti (~ 9 h).
  9. Procedere alla digestione della tripsina o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.

7. Digestione degli istoni

NOTA: gli istoni vengono digeriti in peptidi usando la tripsina, che taglia sul lato carbossilico dei residui di arginina e lisina. Tuttavia, poiché la propionilazione modifica i residui di lisina, solo i residui di arginina vengono scissi (Figura 2B).

  1. Preparare la soluzione di tripsina (25 ng/μL in 50 mM NH4HCO3, pH 8,0). Aggiungere 20 μL di tripsina (500 ng) a ciascun campione.
    1. Per preparare la soluzione NH4HCO3 da 50 mM, diluire la soluzione 100 mM NH4HCO3 1:1 v/v con acqua di grado HPLC.
  2. Assicurarsi che il pH sia 8 utilizzando la carta di prova del pH. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio. Se il pH > 8, regolare aggiungendo 1 μL di acido formico o acetico.
  3. Digerire a temperatura ambiente durante la notte o incubare a 37 oC per 6-8 ore.
  4. Se possibile, controllare il pH dopo ~ 3 ore di digestione, in quanto potrebbe essere diminuito. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio.
  5. Aggiungere altri 5 μL di 50 ng/μL di soluzione di tripsina (250 ng) e continuare la digestione.
  6. Procedere al secondo ciclo di propionilazione o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.

8. Derivatizzazione del peptide N-termini

NOTA: La propionilazione dei peptidi istonici al loro N-terminus migliora la ritenzione dei peptidi più corti mediante cromatografia liquida in fase inversa (ad esempio, amminoacidi 3-8 dell'istone H3), poiché il gruppo propionilico aumenta l'idrofobicità peptidica.

  1. Sotto il cofano, aggiungere 2 μL di anidride propionica usando la pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
  2. Aggiungere rapidamente 10 μL di idrossido di ammonio utilizzando la pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
    NOTA: L'acido propionico è un prodotto della reazione tra anidride propionica e ammine libere da peptidi e può ridurre il pH del campione. Il pH 8 può essere ristabilito aggiungendo idrossido di ammonio al campione con un rapporto di 1:5 (v/v).
  3. Assicurarsi che il pH sia 8 utilizzando la carta di prova del pH. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio. Se il pH > 8, regolare aggiungendo 1 μL di acido formico o acetico. Quando il pH > 10, è possibile l'etichettatura di altri residui di aminoacidi con pKa più elevato.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  5. Ripetere i passaggi da 8.1 a 8.4. Un doppio ciclo di propionilazione degli istoni garantisce un'efficienza di reazione quasi completa.
  6. Piastra asciutta in velocità sottovuoto fino a quando tutti i pozzetti sono completamente asciutti (~ 9 h).
  7. Procedere alla fase di desalinizzazione o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.

9. Dissalazione e pulizia del campione

NOTA: i sali presenti nel campione interferiscono con l'analisi della spettrometria di massa. I sali sono anche ionizzati durante l'elettrospray e possono sopprimere i segnali dai peptidi. I sali possono formare addotti ionici sui peptidi, che fanno sì che il peptide addotto abbia una massa diversa. Ciò riduce l'intensità del segnale del peptide e impedisce una corretta identificazione e quantificazione. La configurazione per la desalinizzazione è illustrata nella Figura 2C.

  1. Iniziare a miscelare la resina HLB (50 mg/mL in acetonitrile al 100%) su una piastra magnetica.
  2. Assicurarsi che ci sia una piastra di raccolta a 96 pozzetti posizionata sotto la piastra filtrante in polipropilene a 96 pozzetti per raccogliere il flusso attraverso.
  3. Aggiungere 70 μL di sospensione HLB per pozzetto alla piastra filtrante. Accendere delicatamente il vuoto per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
  4. Lavare la resina con 100 μL di 0,1% TFA. Accendere delicatamente il vuoto per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
  5. Sospendere ogni campione in 100 μL di TFA allo 0,1%. Controllare il pH; dovrebbe essere ~ 2-3.
  6. Caricare ogni campione in ogni pozzetto. Accendere delicatamente l'aspirapolvere per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
  7. Lavare con 100 μL 0,1% TFA. Accendere delicatamente l'aspirapolvere per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
  8. Sostituire la piastra di raccolta con una nuova piastra di raccolta a 96 pozzetti.
  9. Aggiungere 60 μL di acetonitrile al 60% / TFA allo 0,1% per pozzetto. Accendere delicatamente l'aspirapolvere per evitare schizzi. Raccogliere il flusso attraverso e asciugare in un vuoto di velocità.
  10. Procedere a LC-MS/MS o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.

10. Analisi del peptide istonico mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa

  1. Preparare le fasi mobili per l'esecuzione sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Fase mobile A (MPA): 2% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico. Fase B mobile (MPB): 80% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico.
  2. Programmare il metodo HPLC come segue: (1) 4%-34% MPB oltre 30 min; (2) 34%-90% MPB oltre 5 min; e (3) isocratico 90% MPB per 5 min. Utilizzare le seguenti proprietà consigliate della colonna: materiale di imballaggio C18 3 μm, diametro interno 75 μm, lunghezza 20-25 cm. Impostare la portata a 250-300 nL/min per nanocolonne con diametro interno di 75 μm.
    1. Nel caso in cui l'HPLC non sia programmato per automatizzare l'equilibratura della colonna prima del caricamento del campione, includere (4) 90%-4% MPB su 1 min e (5) isocratico 4% MPB su 10 min.
  3. Programmare il metodo di acquisizione MS.
    1. Assicurarsi che lo strumento esegua una scansione MS completa all'inizio di ogni ciclo di lavoro. Si raccomanda una strumentazione ad alta risoluzione (ad esempio, orbitrap o analizzatori di tempo di volo), grazie alla precisione di massa che può essere utilizzata durante l'estrazione del segnale. Tuttavia, la strumentazione a bassa risoluzione può anche essere utilizzata come descritto in precedenza27,28.
    2. Assicurarsi che la scansione MS completa sia seguita da 16 eventi di scansione MS/MS, ciascuno con una larghezza di isolamento di 50 m/z, che coprono l'intervallo m/z compreso tra 300 e 1100. Ad esempio, la prima scansione dovrebbe isolare i segnali a 300-350 m/z, la seconda a 350-400 m/z, ecc. Se possibile, acquisire scansioni MS / MS anche in alta risoluzione, ma è sufficiente una risoluzione inferiore rispetto alla scansione MS completa (a causa delle masse più piccole di ioni frammento rispetto agli ioni intatti).
    3. Il metodo HPLC genererà segnali cromatografici con larghezze di picco di ~3-40 s; per garantire una corretta quantificazione del segnale, assicurarsi che lo spettrometro di massa esegua almeno 10 cicli di lavoro per picco cromatografico (cioè un ciclo di lavoro di 3 s o più veloce).
    4. Se si utilizza un analizzatore di massa in stile trapping (orbitrap, trappola ionica), assicurarsi che il limite di tempo di iniezione ionica sia impostato su <200 ms; per altri analizzatori (quadrupolo, tempo di volo), questo non è un problema a causa del loro tempo di scansione più veloce. Potrebbe essere necessario un test preliminare.
      NOTA: Maggiori dettagli sui metodi ms per l'analisi dei peptidi istonici sono disponibili nei seguenti riferimenti 27,28,29.
  4. Campione risospeso in 10 μL di MPA, che corrisponde a ~1 μg/μL di campione di istone digerito. L'esatta quantità di carico non è critica (anche non banale da valutare) se tutti i campioni del lotto vengono caricati utilizzando diluizioni e volumi simili.
  5. Caricare 1 μL di campione sulla colonna HPLC.
  6. Eseguire il metodo LC-MS/MS programmato nei passaggi 10.1-10.3.

11. Analisi dei dati

  1. Importare i file di dati grezzi MS in un software progettato per eseguire l'integrazione dell'area di picco.
    NOTA: EpiProfile 30,31 è utilizzato nello studio attuale ed è generalmente raccomandato, in quanto è ottimizzato per l'estrazione affidabile dell'area di picco di peptidi istonici noti. Tuttavia, altri software liberamente disponibili per la cromatografia ionica estratta come Skyline32,33 sono adatti.
  2. Calcola l'abbondanza relativa di un dato peptide (non) modificato come l'area di un singolo peptide divisa per l'area totale del peptide in tutte le sue forme modificate. Software come EpiProfile30,31 contengono già librerie di peptidi per l'estrazione del segnale. Altrimenti, genera una libreria di peptidi di interesse manualmente o tramite l'identificazione peptidica utilizzando pipeline proteomiche di routine.

Risultati

In questo protocollo, gli sferoidi HepG2/C3A sono stati trattati con 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, entrambi i quali hanno influenzato i livelli globali di PTM istonici (Figura 3A). I PTM istonici sono stati quindi identificati e quantificati a livello di singolo residuo tramite acquisizione ms/MS (Figura 3B).

Quando i campioni vengono eseguiti in repliche, è possibile eseguire analisi statistiche per valutare l'arricchimento de...

Discussione

L'analisi dei PTM istonici è fondamentalmente diversa dalla tipica pipeline di analisi proteomica. La maggior parte dei PTM istonici hanno ancora funzioni biologiche enigmatiche; di conseguenza, annotazioni come Gene Ontology o database di pathway non sono disponibili. Esistono diverse risorse che associano le modificazioni istoniche all'enzima responsabile della loro catalisi o proteine contenenti domini che legano questi PTM (ad esempio, HISTome36). Inoltre, è possibile speculare sullo stato g...

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Il laboratorio Sidoli riconosce con gratitudine la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck e l'NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin-EDTA solutionGibco25300054
0.5-20 µL pipet tipsBRAND13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubesBio-Rad2239480
10 µL multi-channel pipetteBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringeHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettesEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tipsRainin30389164
18 G syringe needleAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipetteCorning4082
2-200 µL pipet tipsBRANDZ740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplateCorning07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flaskCorning461464UUntreated, with vent cap
96-well skirted plateAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetoneFisher ScientificA949-1Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Ammonium hydroxide solutionFisher ScientificAC423300250
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStarCelVivoN/AClinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unitCelVivoN/ATablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Formic acidThermo Scientific28905
Fume hoodMottN/AModel 7121000
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-8B9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplementCorning25-015-CI200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrileFisher ScientificA955-4
HPLC grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA481-212
IceN/AN/A
MEM non-essential amino acidsCorning25-025-CI100X solution
Oasis HLB resinWaters186007549Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQHigh resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plateOrochemOF110096-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI100X solution
pH paperHydrionZ111848 (Sigma-Aldrich)0-13 pH test paper
Pipette gunEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillaryMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterileFisher Scientific1367549
Propionic anhydrideSigma-Aldrich240311-50G
Refrigerated centrifugeThermo Scientific75-217-420
Reprosil-Pur resinMSWILR13.AQ.0003120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
RotatorClay Adams25477 (American Laboratory Trading)Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsinPromegaV5111
Sodium butyrateThermo ScientificA11079
Sodium succinate dibasicSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)Savant20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
Sterile hoodThermo Scientific1375Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dishFisher Scientific08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)Thermo ScientificAC421451000Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)Fisher ScientificPI28904Sequencing grade
Vacuum manifold 96-wellMilliporeMAVM0960R
VortexSigma-AldrichZ258415
Water bathFisher ScientificFSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µLAxygen14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µLAxygen14-222-730 (Fisher Scientific)

Riferimenti

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