Indagine sugli effetti attenuanti della somministrazione di Bacillus cereus sulla colite attraverso la modulazione del microbiota intestinale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire il modello murino di colite indotta da sodio con destrano solfato pseudo-germe indotto da antibiotici per studiare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti positivi del Bacillus cereus sulla colite.

Abstract

Si ritiene che la disbiosi del microbiota intestinale eserciti un ruolo nella progressione della colite. Tuttavia, gli standard precisi per la somministrazione di probiotici nell'alleviare la colite rimangono indefiniti. La maggior parte dei metodi di analisi si basa su una limitata diversità e abbondanza di microrganismi intestinali. Pertanto, gli studi osservazionali non possono stabilire la causalità. In questo studio, abbiamo applicato topi pseudo-germ-free indotti da antibiotici per studiare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti probiotici del Bacillus cereus (B. cereus) sulla colite indotta da destrano solfato di sodio (DSS) nei topi. Questo processo consente di valutare l'effetto regolatore bidirezionale dell'integrazione di B. cereus sulla salute e fornisce risultati stabili e riproducibili. Qui vengono forniti i protocolli dettagliati per la coltivazione di B. cereus , l'operazione con sonda gastrica, la raccolta delle feci e il trattamento di eliminazione degli antibiotici sui topi con colite. I metodi di ottimizzazione sono applicabili anche per altri disturbi cronici associati all'infiammazione. I risultati hanno mostrato che la somministrazione di B. cereus ha ridotto la perdita di peso corporeo, l'accorciamento della lunghezza del colon, l'indice di attività della malattia e i punteggi istopatologici. Tuttavia, il trattamento con antibiotici ha soppresso l'effetto positivo di B. cereus sulla colite. Questi risultati indicano che il microbiota intestinale è necessario per gli effetti allevianti di B. cereus sulla colite. Pertanto, esplorare gli effetti benefici dei probiotici in questa ricerca è un approccio promettente per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento per alleviare i sintomi dei disturbi cronici associati all'infiammazione.

Introduzione

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono comuni disturbi infiammatori gastrointestinali cronici, tra cui il morbo di Crohn e la colite ulcerosa (UC)¹. Le attuali vie terapeutiche per la colite infiammatoria sono i 5-aminosalicilati, i corticosteroidi, l'azatioprina e gli antibiotici². Inoltre, questi farmaci hanno notevoli effetti collaterali³. Pertanto, dovremmo prestare maggiore attenzione all'effetto dei probiotici sul trattamento della colite.

Gli approcci terapeutici alternativi includono la somministrazione di probiotici, che è stata utilizzata in modelli animali e studi clinici. Studi precedenti hanno indicato che diverse somministrazioni di probiotici, come il Bacillus cereus o il Bifidobacterium infantis, potrebbero alleviare la colite ^4,5. Negli studi preclinici, l'efficacia e la sicurezza dei probiotici devono essere studiate in modelli animali.

I modelli murini di colite con destrano solfato di sodio (DSS) possono aiutare a esplorare i meccanismi della colite e valutare gli effetti positivi dei probiotici. L'incentivo DSS provoca erosione della mucosa intestinale, disfunzione della barriera intestinale e un aumento della permeabilità epiteliale intestinale⁶. La maggior parte dei modelli murini per probiotici ha evidenziato principalmente gli effetti biologici. Tuttavia, il meccanismo alla base della somministrazione di questo probiotico è difficile da esplorare, data la limitazione nel verificare ulteriormente la relazione causale tra probiotici e l'alleviamento della colite. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo standardizzato per studiare il meccanismo dei probiotici.

Tradizionalmente, questi studi richiedono l'inoculazione di alcuni probiotici in topi privi di germi⁷. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni di laboratorio nell'utilizzo di topi privi di germi come recettori per i probiotici, come la bassa capacità immunitaria e le costose strutture prive di germi⁸. Al fine di evitare queste limitazioni, è stato stabilito un modello alternativo di colite indotta da DSS utilizzando topi pseudo-privi di germi. Il modello murino pseudo-germ-free è stato stabilito mediante l'applicazione di antibiotici come precedentemente descritto ^9,10.

In questo articolo, stabiliamo topi pseudo-privi di germi con un cocktail di antibiotici. Descriviamo anche in dettaglio la metodologia per stabilire e valutare i modelli di colite murina e studiamo gli effetti dei probiotici sull'alleviamento dei sintomi della colite. Il protocollo seguente fornisce anche i metodi di somministrazione dei probiotici tramite gavage.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università di Anhui, in Cina, e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato etico per gli animali dell'Università di Anhui, in Cina (n. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Somministrazione di antibiotici

1. Preparare un cocktail di antibiotici sciogliendo l'ampicillina (1 g/L), il neomicina solfato (1 g/L), il metronidazolo (0,5 g/L) e la vancomicina (0,5 g/L) in 1 L di acqua potabile⁵.
2. Dopo la completa dissoluzione, conservare le soluzioni a 4 °C.
3. Metti le soluzioni del cocktail antibiotico in una bottiglia d'acqua. Posiziona la bottiglia sopra la gabbia del topo.
   NOTA: Assicurati di utilizzare bottiglie marroni o avvolgere le bottiglie con un foglio di alluminio per proteggere le soluzioni antibiotiche dalla luce.
4. Sostituire il cocktail antibiotico con soluzioni fresche 2 volte a settimana.
5. Lasciare che i topi bevano liberamente le soluzioni del cocktail antibiotico per 4 settimane.

2. Preparazione dell'acqua potabile DSS e induzione della colite

1. Per preparare una soluzione di destrano solfato di sodio (DSS) al 2,5%, sciogliere 2,5 g di DSS in 100 ml di acqua distillata¹¹.
2. Sostituire l'acqua potabile con la soluzione DSS al 2,5% nel gruppo di topi modello di colite. Assicurarsi che i topi del gruppo della colite non abbiano accesso ad altra acqua potabile. Nel frattempo, trattare i topi di controllo con acqua distillata senza DSS.
3. Ospita topi maschi C57BL/6J (peso corporeo medio, 20 g ± 2 g; età 7 settimane) in condizioni prive di agenti patogeni con libero accesso a cibo e acqua standard.
   NOTA: Ospita un totale di cinque topi per gabbia in condizioni prive di agenti patogeni.
4. Progettazione sperimentale
   NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati progettati in due fasi. Sono stati inclusi cinque topi per ogni gruppo.
   1. Prima fase: per valutare l'effetto positivo di B. cereus sull'alleviamento della colite, assegnare in modo casuale i topi ai seguenti tre gruppi: gruppo di controllo (controllo), modello di colite indotta da DSS (DSS), integrazione probiotica di B. cereus per topi indotti da DSS (B. cereus).
   2. Seconda fase: esplorare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti probiotici di B. cereus sulla colite indotta da DSS, assegnare casualmente i topi ai seguenti tre gruppi: ABX (controllo), ABX (DSS) e ABX (B. cereus + DSS).
      1. Trattare i topi del gruppo ABX (controllo) con soluzione fisiologica.
      2. Dopo il trattamento con soluzioni di cocktail antibiotici per 4 settimane, lasciare che i topi del gruppo ABX (DSS) ricevano acqua contenente il 2,5% di DSS per 1 settimana e soluzione fisiologica normale per 2 settimane.
      3. Dopo il trattamento con soluzioni di cocktail antibiotici e acqua DSS, trattare quotidianamente i topi del gruppo ABX (B. cereus + DSS) con B. cereus (2 x 10⁸ cellule) in 200 μL di soluzione fisiologica utilizzando una cannula intragastrica per 2 settimane.
5. Dopo la somministrazione del cocktail antibiotico, trattare immediatamente i topi maschi C57BL/6 con una soluzione di DSS al 2,5% in acqua potabile per 7 giorni.
6. Registrare il peso corporeo dei topi prima dell'intervento DSS come peso basale.

3. Quantificazione di B. cereus

1. Preparare otto provette per microcentrifuga da 1,5 mL riempite con 900 μL di soluzione fisiologica sterile.
2. Pipettare 100 μL di B . cereus di crescita logaritmica e sciogliere in 900 μL di soluzione fisiologica normale sterile.
3. Diluire in serie B. cereus utilizzando tubi.
4. Piastra 40 μl di ciascuna diluizione sulla rispettiva piastra di agar LB etichettata con il rapporto di diluizione. Ripetere 3 volte per ogni rapporto di diluizione.
5. Fermentare le piastre in un incubatore a temperatura costante a 37 °C per 16 ore.
6. Seleziona le piastre con ~20-70 colonie per il conteggio. Calcolare la concentrazione batterica media in base al multiplo di diluizione delle piastre selezionate.

4. Preparazione di B. cereus per la sonda gastrica

1. Dopo la quantificazione di B. cereus, raccogliere 1 mL di terreno di B. cereus contenente 1 x 10⁹ CFU e centrifugare a 8.000 x g per 10 min. Quindi, lavare le cellule batteriche 2 volte con acqua sterile mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
2. Diluire il B. cereus concentrato con soluzione fisiologica sterile fino a una concentrazione finale di 2 x 10⁸ CFU/200 μL⁴.
3. Pipettare ripetutamente la diluizione su e giù per ottenere una sospensione dispersa di B. cereus .
4. Effettuare la quantificazione della concentrazione di B. cereus con la tecnica del conteggio su piastra prima di completare il metodo della sonda gastrica.

5. Applicazione di integratori di B. cereus mediante sonda gastrica

1. Somministrare gli interventi (2 x 10,⁸ CFU probiotici in 200 μL di soluzione fisiologica normale) nei topi attraverso la sonda orale a un tempo prestabilito.
2. Per somministrare B. cereus, collegare un ago per sonda gastrica (misura dell'ago di alimentazione: 20 G, 38 mm) a una siringa da 1 mL. Pulire l'esterno dell'ago della sonda con etanolo al 70% tra i topi e mantenere la corretta applicazione della dose.
3. Per trattenere i topi, prendili per la coda e afferra saldamente la pelle flaccida della schiena con l'estremità della coda fissata tra le ultime due dita del conduttore.
4. Mantieni i mouse in posizione verticale. Quindi, inserire l'ago della sonda gastrica con cautela e delicatamente attraverso la bocca nell'esofago. Se non si incontra resistenza in questo passaggio, spingere delicatamente l'ago nello stomaco.
   NOTA: Confermare la respirazione regolare e senza ostacoli dei topi prima della somministrazione del farmaco.
5. Far avanzare lentamente l'ago e somministrare la soluzione di B. cereus . Estrarre delicatamente l'ago dopo il completamento del gavagage. Rilascia il mouse e rimettilo nella sua gabbia.

6. Determinazione dell'indice di attività della malattia

NOTA: L'indice di attività della malattia (DAI) è stato calcolato quotidianamente in base alla perdita di peso corporeo dei topi, al sangue occulto nelle feci e alla consistenza delle feci.

1. Misura il peso corporeo dei topi ogni giorno. Assegna un punteggio da 0 a 4 a ciascun topo in base alla percentuale di perdita di peso corporeo (0: 0%, 1: 1% -5%, 2: 6% -10%, 3: 11% -18% e 4: >18%).
2. Raccogli campioni di feci fresche da ogni topo. Usa un batuffolo di cotone per stimolare la contrazione dell'ano per favorire la defecazione. Quindi, raccogliere i campioni di feci subito dopo la defecazione in una provetta da centrifuga sterilizzata.
3. Determinare il sangue occulto fecale con la carta del test del sangue occulto nelle feci. Raccogliere 10 mg di campione di feci su un bastoncino applicatore.
4. Metti il campione sulla scheda di prova e applica una sottile sbavatura sulla carta. Aprire il lembo posteriore e applicare lo sviluppatore sulla sbavatura.
5. Quindi, segnare per il sangue occulto utilizzando la carta del test del sangue occulto nelle feci entro 120 s.
   NOTA: Qualsiasi traccia di blu sopra o sul bordo dello striscio è positiva per il sangue occulto. I punteggi dell'occulto fecale erano i seguenti: 0: Nessuno, 1: Emoocculto positivo, 2: Lieve, 3: Tracce di sangue nelle feci e 4: Sanguinamento grossolano.
6. Identificare la consistenza delle feci rilevando il campione di feci¹¹. Assegna un punteggio da 0 a 4 (0: normale, 1: feci molli, 2: feci semiformate, 3: feci liquide e 4: diarrea).

7. Raccolta dei tessuti

1. Anestetizzare i topi iniettando il 10% di idrato di cloralio (10 mg/kg) alla fine della prima e della seconda fase dell'esperimento. Valutare la profondità dell'anestesia nei topi in base al riflesso di astinenza con pizzico.
2. Quindi, sopprimere i topi mediante lussazione cervicale.
3. Fissare i topi in posizione supina sul tavolo operatorio e aprire la cavità peritoneale.
4. Separare chirurgicamente l'intero colon e misurare la lunghezza con un righello.
5. Quindi, lavare delicatamente il colon con una siringa da 5 ml riempita con PBS preraffreddato.

8. Valutazione del danno istologico

1. Tagliare il tessuto del colon in piccoli frammenti, fissarli in paraformaldeide al 4% e incorporarli in paraffina utilizzando una macchina per l'inclusione dei tessuti.
2. Quindi, sezionare i tessuti inclusi in paraffina con un microtomo per preparare sezioni di tessuto del colon spesse 4 μm. Decerare e disidratare le sezioni del colon. Quindi, colorare le sezioni del colon con ematossilina ed eosina (H&E).
   NOTA: I campioni di colon colorati vengono valutati dallo sperimentatore con un sistema per le seguenti misure: grado di infiltrazione delle cellule infiammatorie (Nessuno: 0, Lieve: 1, Moderata: 2, Grave: 3), Danno alla mucosa (Nessuno: 0, Strato mucoso: 1, Sottomucosa: 2, Muscolare e sierosa: 3), Danno alla cripta (Nessuno: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, intero: 3, intero + perdita di epitelio: 4), intervallo di lesioni (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). Il punteggio totale del danno istologico è calcolato per ogni singolo punteggio delle misure di cui sopra⁵.
3. Lascia che due sperimentatori indipendenti valutino (in cieco) i punteggi istologici del campione al microscopio ottico.

Risultati

Integrazione di B. cereus e colite
Il modello sperimentale di colite acuta è stato indotto dall'intervento DSS nell'acqua potabile. La Figura 1A mostra il protocollo sperimentale per la somministrazione di B. cereus al modello murino di colite. L'incentivo DSS ha ovviamente diminuito il peso corporeo (Figura 1B) e la lunghezza del colon. L'effetto attenuante di B. cereus attraverso...

Discussione

Per utilizzare i probiotici negli studi clinici, è necessario valutare l'efficacia e la sicurezza dei probiotici nei modelli animali. I protocolli forniti sono stati precedentemente ottimizzati per valutare la gravità della colite. I topi trattati con DSS sono un modello di infiammazione intestinale, che imita le caratteristiche cliniche e istologiche caratteristiche della colite ulcerosa¹². I topi modello per la colite acuta sono caratterizzati da perdita di pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M PBS (powder, pH7.2–7.4)	Solarbio	P1010-2L
Absolute ethyl alcohol	Hushi	64-17-5
Acid alcohol fsat differentiation solution	Beyotime	No.C0163S
Agar	Sangon Biotech	9002-18-0
Ampicillin	Solarbio	69-53-4	Store at 2–8 °C
Anaerobic incubator	Long Yue	LA1-3T
Dextran sulfate sodium salt colitis grade	MP Biomedicals	160110
Electrothermal incubator	SANFA	HP-050A
General purpose tissue fixator	biosharp	BL539A
Glycerinum	Hushi	56-81-5
Hematoxylin and eosin staining kit	Beyotime	No.C0105
Kisser's Mounting Medium	Beyotime	No.C0181
Metronidazole	Solarbio	443-48-1	Store at 2–8 °C
Neomyein sulfate	Solarbio	1405-10-3	Store at 2–8 °C
Oscillating incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180S
Sodium chloride	Sangon Biotech	7647-14-5
Stool occult blood test paper	Baso	BA2020B
Tryptone	OXOID	2285856
Vancomycin	Solarbio	1404-93-9	Store at 2–8 °C
Xylene	Hushi	1330-20-7
Yeast extract	Sangon Biotech	8013-01-2