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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l'affinità di legame (KD) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L'efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).

Abstract

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è stata considerata un fattore di rischio cruciale per il carcinoma epatocellulare. Il trattamento attuale può solo ridurre la carica virale ma non provocare una remissione completa. Un modello epatocitario efficiente per l'infezione da HBV offrirebbe un ciclo di vita virale realistico che sarebbe cruciale per lo screening degli agenti terapeutici. La maggior parte degli agenti anti-HBV disponibili si rivolge alle fasi del ciclo di vita dopo l'ingresso virale, ma non prima dell'ingresso virale. Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di un modello di epatociti competente in grado di selezionare gli agenti terapeutici mirati alle fasi del ciclo di vita dell'ingresso pre-virale e post-virale. Ciò include il targeting del legame del polipeptide cotrasportatore di taurocolato di sodio (NTCP), la formazione del cccDNA, la trascrizione e l'assemblaggio virale basato su imHC o HepaRG come cellule ospiti. Qui, il test di inibizione dell'ingresso HBV ha utilizzato la curcumina per inibire il legame e le funzioni di trasporto dell'HBV tramite NTCP. Gli inibitori sono stati valutati per l'affinità di legame (KD) con NTCP utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), uno strumento universale per lo screening dei farmaci HBV basato su parametri termodinamici.

Introduzione

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è considerata una malattia pericolosa per la vita in tutto il mondo. L'infezione cronica da HBV è carica di un rischio di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare1. L'attuale trattamento anti-HBV si concentra principalmente sull'ingresso post-virale utilizzando analoghi nucleos(t)ide (NAs) e interferone-alfa (IFN-α)2,3. La scoperta di un inibitore dell'ingresso dell'HBV, Myrcludex B, ha identificato un nuovo bersaglio per gli agenti anti-HBV4. La combinazione di inibitori di ingresso e NA nell'HBV cronico ha ridotto significativamente la carica virale rispetto a quelli mirati alla sola replicazione virale 5,6. Tuttavia, il modello classico di epatociti per lo screening degli inibitori dell'ingresso dell'HBV è limitato da bassi livelli di recettori virali (polipeptide di cotrasporto del taurocolato di sodio, NTCP). La sovraespressione di hNTCP nelle cellule di epatoma (cioè HepG2 e Huh7) migliora l'infettività dell'HBV 7,8. Tuttavia, queste linee cellulari esprimono bassi livelli di enzimi che metabolizzano i farmaci di fase I e II e mostrano instabilità genetica9. I modelli di epatociti che possono aiutare a colpire meccanismi distinti di composti anti-HBV candidati come l'ingresso previrale, il legame NTCP e l'ingresso virale accelererebbero l'identificazione e lo sviluppo di regimi di combinazione efficaci. Lo studio per l'attività anti-HBV della curcumina ha chiarito l'inibizione dell'ingresso virale come un nuovo meccanismo oltre all'interruzione post-ingresso virale. Questo protocollo descrive un modello ospite per lo screening delle molecole di ingresso anti-HBV10.

L'obiettivo di questo metodo è quello di esplorare i composti anti-HBV candidati per l'inibizione dell'ingresso virale, in particolare bloccando il legame e il trasporto NTCP. Poiché l'espressione di NTCP è un fattore critico per l'ingresso e l'infezione da HBV, abbiamo ottimizzato il protocollo di maturazione degli epatociti per massimizzare i livelli di NTCP11. Inoltre, questo protocollo può differenziare l'effetto inibitorio sull'ingresso dell'HBV come inibizione dell'attaccamento dell'HBV rispetto all'inibizione dell'internalizzazione. Anche il test di assorbimento dell'acido taurocolico (TCA) è stato modificato utilizzando un metodo basato su ELISA anziché un radioisotopo per rappresentare il trasporto NTCP12,13. L'interazione tra recettore e ligando è stata confermata dalle loro strutture 3D14,15. L'inibizione della funzione NTCP può essere valutata misurando l'attività di captazione del TCA16. Tuttavia, questa tecnica non ha fornito prove dirette del legame NTCP ai candidati inibitori. Pertanto, il legame può essere studiato utilizzando varie tecniche, come la risonanza plasmonica di superficie 17, ELISA, saggio di spostamento termico basato sulla fluorescenza (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen e vari altri metodi20. Tra queste tecniche, l'ITC è uno standard obiettivo nell'analisi di legame perché può osservare l'assorbimento o l'emissione di calore in quasi tutte le reazioni21. L'affinità di legame (KD) di NTCP e composti candidati è stata valutata direttamente utilizzando ITC; Questi valori di affinità erano più precisi di quelli ottenuti utilizzando il modello di previsione in silico 22.

Questo protocollo copre le tecniche di maturazione degli epatociti, l'infezione da HBV e lo screening per l'inibitore dell'ingresso dell'HBV. In breve, è stato sviluppato un modello di epatociti basato su linee cellulari imHC e HepaRG. Le cellule coltivate sono state differenziate in epatociti maturi entro 2 settimane. La sovraregolazione dei livelli di NTCP è stata rilevata utilizzando la PCR in tempo reale, il western blot e la citometria a flusso11. Il virione dell'epatite B (HBVcc) è stato prodotto e raccolto da HepG2.2.15. L'imHC differenziato o HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) è stato trattato profilatticamente con i candidati anti-HBV 2 ore prima dell'inoculazione con il virione HBV. Il risultato atteso dell'esperimento era l'identificazione degli agenti che riducono l'HBV cellulare e l'infettività. L'attività anti-NTCP è stata valutata utilizzando il test di assorbimento TCA. L'attività NTCP potrebbe essere soppressa dagli agenti che hanno associato specificamente NTCP. La tecnica ITC è stata impiegata per studiare la fattibilità di un legame interattivo che potrebbe prevedere gli inibitori e le loro proteine bersaglio, determinando l'affinità di legame (KD) del ligando per il recettore attraverso interazioni non covalenti del complesso biomolecolare23,24. Ad esempio, K D ≥ 1 × 103 mM rappresenta il legame debole, K D ≥ 1 × 106 μM rappresenta un legame moderato e K D ≤ 1 × 109 nM rappresenta un legame forte. Il ΔG è direttamente correlato con le interazioni di legame. In particolare, una reazione con ΔG negativo è una reazione esoergonica, che indica che il legame è un processo spontaneo. Una reazione con un ΔH negativo indica che i processi di legame dipendono dal legame idrogeno e dalle forze di Van der Waals. Sia l'assorbimento del TCA che i dati ITC potrebbero essere utilizzati per lo screening degli agenti di ingresso anti-HBV. I risultati di questi protocolli possono fornire una base non solo per lo screening anti-HBV, ma anche per l'interazione con NTCP valutata attraverso l'affinità di legame e la funzione di trasporto. Questo articolo descrive la preparazione e la caratterizzazione della cellula ospite, il disegno sperimentale e la valutazione dell'ingresso anti-HBV insieme all'affinità di legame NTCP.

Protocollo

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in una cappa di flusso di pericolo biologico di classe II o in una cappa a flusso laminare. La gestione dell'HBV è stata eticamente approvata dall'IRB (MURA2020/1545). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutte le soluzioni, i reagenti, le apparecchiature e le linee cellulari utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione delle cellule ospiti (epatociti maturi)

  1. Epatociti di coltura (3,75 × 105 cellule HepaRG o imHC) e mantenere in un matraccio di coltura di 75 cm2 con 10 ml di terreno DMEM/F12 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%, all'1% di L-glutammina, a 100 U/mL di penicillina e a 100 μg/mL di streptomicina. Attendere che le cellule raggiungano l'80% -90% di confluenza (entro 1 settimana).
  2. Eliminare il vecchio mezzo dal matraccio e lavare le cellule con 4 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
  3. Aspirare il PBS e aggiungere 4 ml di tripsina-EDTA allo 0,05%.
  4. Incubare il pallone nell'incubatore a 37 °C per 2-3 minuti e controllare le cellule aderenti utilizzando un microscopio invertito con una lente obiettivo 10x. Assicurarsi che il monostrato si sia staccato dalla superficie di coltura.
  5. Inibire la tripsina aggiungendo 4 ml di terreno di coltura integrato con FBS al 10% al pallone e risospendere accuratamente le cellule raccolte. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 3 minuti a 300 × g, 25 °C.
  6. Aspirare il surnatante dal pellet cellulare e risospendere con 1-2 ml di terreno di coltura preriscaldato integrato con FBS al 10% e antibiotici.
  7. Mescolare 10 μL ciascuna delle sospensioni cellulari e del blu tripano e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Assicurarsi che la vitalità cellulare sia superiore al 90% prima di procedere alla fase successiva.
  8. Seminare 1 × 10 6 cellule per 2 ml in ciascun pozzetto di una piastra a6 pozzetti e mantenere in DME / F12 mezzo completo fino a quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza.
  9. Per la maturazione epatica, preparare il terreno di maturazione epatica (mezzo E di Williams integrato con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina, 100 μg / mL di streptomicina, 5 μg / mL di insulina, 50 μM di idrocortisone, 2 mM di L-glutammina e 2% di DMSO).
  10. Sostituire il terreno di coltura 2 volte a settimana.
  11. Mantenere gli epatociti nel mezzo di maturazione per 2 settimane per ottenere epatociti maturi pronti per l'infezione da HBV.

2. Quantificazione delle NTCP cellulari

  1. Misurazione dell'espressione NTCP mediante PCR in tempo reale
    1. Raccogliere il pellet di epatociti maturi attraverso tripsinizzazione (vedere Passi 1.2-1.5).
    2. Estrarre l'RNA totale dal pellet cellulare utilizzando un kit di estrazione dell'RNA con trattamento con DNasi I.
    3. Sintetizzare il cDNA da 200 ng di RNA totale utilizzando un primer oligo-dT e un sistema di trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore.
    4. Diluire il cDNA a 50 ng/μL e usarlo come modello per la reazione PCR. Miscelare 2 μL di cDNA diluito con i reagenti master mix PCR contenenti la soluzione SYBR green qRT-PCR Kit con primer specifici per NTCP da 5 μM (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' e 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Per la normalizzazione, utilizzare GAPDH come gene housekeeping con primer specifici (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' e 5'-AAATGAGCCCCAGCCCTCTC-3').
    6. Amplificare i campioni di cDNA utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni di temperatura: 1 ciclo di 3 min a 95 °C (denaturazione iniziale); 40 cicli di 30 s a 95 °C (denaturazione), 30 s a 60 °C a 65 °C (ricottura), 30 s a 72 °C (estensione); 1 ciclo di 5 min a 72 °C (estensione finale).
    7. Calcolare la variazione del fold NTCP negli epatociti maturi su cellule indifferenziate usando GAPDH come gene calibratore basato sul metodo 2-ΔΔCT .
  2. Quantificazione di NTCP mediante l'analisi western blot
    1. Raccogliere gli epatociti utilizzando un raschietto cellulare e centrifugarli a 300 x g, 25 °C per 5 minuti per raccogliere il pellet cellulare.
    2. Seguire le istruzioni del produttore del tampone RIPA per estrarre la proteina cellulare con 100 μL di tampone RIPA contenente 1x inibitore della proteasi.
    3. Misurare la concentrazione proteica totale utilizzando il metodo dell'acido bicinconinico (BCA).
    4. Mescolare 12,5 μL di proteine con colorante caricante 2x in un rapporto 1:1 in volume.
    5. Far bollire la miscela proteica e la scala standard a 95 °C per 5 minuti.
    6. Aggiungere 1x buffer di corsa alla camera di elettroforesi.
    7. Caricare 5 μL della scala proteica standard o 20 μL della miscela proteica bollita in un gel di poliacrilammide al 10% (p/v).
    8. Eseguire l'elettroforesi su gel: 50 V per 30 minuti seguita da 90 V per 1 ora a temperatura ambiente.
    9. Preparare una membrana PVDF immergendola in metanolo per 30 secondi, lavarla con acqua bidistillata per 1-2 minuti e immergerla insieme a due pezzi di carta da filtro nel tampone di trasferimento per 10 minuti o fino all'uso.
    10. Posizionare la carta da filtro sulla piastra anodica di una cella di trasferimento semi-secca; quindi, posizionare la membrana PVDF, il gel e la carta da filtro sopra, in questo ordine.
    11. Trasferire le proteine dal gel alla membrana PVDF a 10 V per 25 minuti a temperatura ambiente.
    12. Bloccare la membrana con la soluzione di blocco WB per 1 ora a temperatura ambiente.
    13. Incubare la membrana con polipeptide cotrasportante taurocolato anti-sodio (anti-NTCP) (diluizione 1:100) a 4 °C durante la notte.
    14. Lavare la membrana 3 x 10 minuti con TBST.
    15. Incubare la membrana con anticorpo anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (diluizione 1:10.000) per 1 ora a temperatura ambiente.
    16. Lavare la membrana 3 x 10 minuti con TBST e poi 1 x 5 minuti con TBS.
    17. Rilevare NTCP utilizzando un substrato HRP (vedere la tabella dei materiali).
    18. Aggiungere almeno 0,1 ml di soluzione di substrato HRP/cm2 della membrana e incubare la membrana per 3-5 minuti al buio.
    19. Visualizza NTCP utilizzando un sistema di documentazione su gel in modalità chemiluminescenza, seleziona l'opzione marcatore per la membrana, regola il tempo di esposizione con modalità cumulativa ogni 1 minuto e scatta la foto con vari tempi di esposizione per 5 minuti.
    20. Strisciare e sondare la macchia con l'anticorpo anti-GAPDH del topo (diluizione 1:200.000) e l'anticorpo secondario anti-topo coniugato con HRP (diluizione 1:10.000).
  3. Misurazione del livello NTCP mediante citometria a flusso
    1. Raccogliere i pellet cellulari degli epatociti maturi incubando le cellule con 8 mM EDTA per 15 minuti.
      NOTA: Evitare l'uso di tripsina o altre proteasi che possono disturbare i recettori della superficie cellulare. Poiché NTCP è una proteina del recettore della superficie cellulare, il danno dovuto alla tripsinizzazione può dare risultati negativi.
    2. Fissare gli epatociti con 300 μL di paraformaldeide al 3,7% in 1x PBS per 15 minuti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C.
    3. Lavare le celle 2x con 700 μL di 1x PBS con 1% FBS (v/v), centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C, aggiungere 300 μL di Triton X-100 allo 0,05% in PBS al pellet cellulare e incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti per permeabilizzarle.
    4. Centrifugare per 10 min a 300 × g, 25 °C, lavare il pellet cellulare 3 x 1 min con 700 μL di PBS contenente 1% FBS (v/v). Incubare le cellule con l'anticorpo primario contro NTCP (diluizione 1:100) a 4 °C per 30 minuti. Lavare le celle 3 x 1 min con tampone permanente/lavabile e centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C.
    5. Colorare le cellule con anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 a 4 °C per 30 min. Lavare le celle 3 x 1 min con tampone permanente/lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 × g, 25 °C. Risospendere il pellet cellulare con 200 μL di PBS con 1% FBS (v/v).
    6. Accendere il citometro a flusso, riscaldare il laser per 15 minuti ed eseguire la pulizia di routine.
    7. Selezionare i parametri di misurazione, tra cui forward scatter (FSC), side scatter (SSC) e isotiocianato di fluoresceina (FITC) o ficoeritrina (PE), e impostare la regolazione automatica della compensazione da parte del software. Includere i campioni di controllo della compensazione: controllo non colorato, controllo colorato con FITC e controllo colorato con PE.
      NOTA: i parametri FSC e SSC vengono utilizzati per determinare la dimensione e la granularità delle singole celle per selezionare la popolazione cellulare per l'analisi gating. Il rilevatore di canali di fluorescenza ha canali FITC e PE . Per questo protocollo, selezionare il canale FITC per rilevare Alexa Fluor 488.
    8. Eseguire il campione non colorato con portata fluidica media (60 μL/min), regolare la soglia di FSC e SSC fino a coprire la popolazione cellulare di interesse, contrassegnare la regione del gate in quest'area e applicare a tutti i controlli di compensazione.
    9. Impostare il tubo fotomoltiplicatore a fluorescenza (PMT) utilizzando il controllo non colorato e regolare la tensione PMT di FITC o PE nel quadrante negativo. Eseguire il campione colorato positivo e regolare FITC o PE nella scala del quadrante positivo. Eseguire i controlli non colorati, FITC o PE, calcolare la compensazione e applicarla alle impostazioni del campione. Eseguire il campione di epatociti per misurare il livello NTCP.
    10. Analizzare gli epatociti colorati utilizzando il software di citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali).
      1. Nelle finestre BD FACSuite, fare clic sul tubo di controllo nella scheda Origini dati e attendere che vengano visualizzati i dati grezzi.
      2. Nella scheda Foglio di lavoro sul lato destro, fare clic sul pulsante Ellipse Gate , selezionare la popolazione di celle in SSC e il dot plot FSC utilizzando il cursore del mouse e attendere che venga visualizzato il cerchio P1.
      3. Fare clic sul pulsante Interval Gate e contrassegnare la regione nell'istogramma FITC, partendo dal valore di intensità di fluorescenza più alto sul lato destro. Osservare la riga P2 che appare.
      4. Fare clic sulla provetta dell'esperimento e osservare che i dati nella scheda Foglio di lavoro cambiano. Fare clic sul pulsante Statistiche e quindi sullo spazio vuoto nel foglio di lavoro. Osservare i valori statistici della popolazione NTCP che appaiono.

3. Produzione delle particelle HBV derivate da colture cellulari (HBVcc)

  1. Coltura HepG2.2.15 in terreno completo (DMEM integrato con 10% FBS, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina) in una capsula di Petri di 10 cm per 24 h.
  2. Sostituire il terreno completo integrato con 380 μg/mL di geneticina (G418) quando l'HepG2.2.15 raggiunge il 60%-70% di confluenza. Raccogliere il terreno condizionato ogni 2 giorni; conservare il terreno contenente HBV a 4 °C.
  3. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando il surnatante a 5.000 × g, 4 °C per 20 minuti. Raccogliere il mezzo condizionato utilizzando una siringa da 20 ml e filtrarlo attraverso un filtro a basso legame proteico da 0,45 μm per rimuovere i detriti cellulari.
  4. Per concentrare l'HBV, diluire 1 volume di concentratore con 3 volumi di surnatante filtrato dal punto 3.3 in una provetta conica da centrifuga e miscelare accuratamente la soluzione mediante inversione del tubo. Introdurre la miscela a 4 °C per 1 ora. Centrifugare la soluzione per 1 ora a 1.500 × g, 4 °C e assicurarsi che sia visibile un pellet bianco sporco.
    NOTA: Per ogni 30 mL di surnatante filtrato dal Passo 3.3, aggiungere 10 mL del concentratore per raggiungere 40 mL di volume totale.
  5. Valutare il titolo HBV (genoma equivalente) con HBV 1.3-mer WT replicon come curva standard compresa tra 1 × 102 e 1 × 1010 utilizzando la PCR assoluta in tempo reale, come descritto in precedenza11.
  6. Ricostituire delicatamente il pellet in FBS e conservare fino a 1 anno a -80 °C in aliquote monouso.

4. Test di ingresso anti-HBV

  1. Mantenere il 100% confluente imHC o HepaRG in piastre a 6 pozzetti nel mezzo di maturazione (2% DMSO nel mezzo E di Williams, 10% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 5 μg / mL di insulina, 50 μM di idrocortisone e 2 mM di L-glutammina) per 2 settimane e cambiare il terreno 2 volte a settimana.
  2. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere la curcumina (10-30 μM) o 4 μM ciclosporina A (CsA) diluita con il mezzo E di William per 2 ore. Aspirare il candidato inibitore dell'ingresso dell'HBV e sostituirlo con 1 mL di mezzo E di William contenente il 4% di glicole polietilenico.
  3. Aggiungere particelle di HBV al terreno di coltura ad una molteplicità di infezione (MOI) di 100 per pozzetto e incubare a 37 °C per 18 ore. Eliminare il surnatante, aggiungere 2 ml di PBS freddo e ruotare delicatamente per risciacquare il vecchio mezzo con HBV non legato.
  4. Aggiungere 2 ml di mezzo completo William's E e coltura per 7 giorni. Aspirare il mezzo, lavare le cellule con 1x PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 3,7% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Permeabilizzare e bloccare le cellule infette con una soluzione bloccante IF (0,2% Triton X-100 e 3% albumina sierica bovina in PBS) e incubarle per 60 minuti a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere l'anticorpo primario (antigene anti-HBV core) alla diluizione 1:200 nella soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 °C. Lavare le celle 3 x 1 min con soluzione di lavaggio (0,5% Tween 20 in PBS).
  6. Aggiungere l'anticorpo secondario (diluizione 1:500) alla soluzione bloccante IF, incubare per 1 ora a temperatura ambiente e lavare le cellule 3 x 1 min con la soluzione di lavaggio.
  7. Montare il campione con un supporto di montaggio antisbiadimento con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e coprire con un vetrino. Rilevare il segnale di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro DAPI (Ex 352-402 nM ed Em 417-477) e un filtro PE (Ex 542-582 ed Em 604-644), insieme a una lente obiettivo 20x, e determinare l'attività di ingresso anti-HBV dei composti candidati.

5. Saggio di legame delle cellule HBV

  1. Mantenere il 100% confluente imHC o HepaRG in piastre a 6 pozzetti nel mezzo di maturazione (2% DMSO nel mezzo E di Williams, 10% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 5 μg / mL di insulina, 50 μM di idrocortisone e 2 mM di L-glutammina) per 2 settimane e cambiare il terreno 2 volte a settimana.
  2. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere la curcumina (10-30 μM) o la ciclosporina A (4 μM) diluita nel mezzo E di William per 2 ore. Aspirare l'inibitore di ingresso dell'HBV e sostituirlo con 1 mL di mezzo E di William contenente il 4% di glicole polietilenico.
  3. Aggiungere particelle di HBV al terreno di coltura con un MOI di 100 per pozzetto e incubare a 4 °C per 2 ore per consentire il legame dell'HBV agli epatociti. Eliminare il mezzo contenente HBV non legato, aggiungere 2 ml di PBS freddo e agitare delicatamente per rimuovere le tracce del mezzo esaurito.
  4. Raccogliere le cellule infette usando un raschietto cellulare e interrompere le cellule con tampone di lisi. Trasferire il lisato in una provetta di raccolta ed estrarre il DNA totale per valutare il DNA dell'HBV utilizzando la PCR in tempo reale con primer specifici per HBV (primer in avanti: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', e primer inverso: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') utilizzando PRNP (primer diretto: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', primer inverso: 5'- TTTATGCCTACTACCCTCCTA-3') come controllo interno.
  5. Amplificare i prodotti PCR in un termociclatore utilizzando le condizioni di temperatura descritte al Passo 2.1.
  6. Calcolare i livelli relativi di HBV DNA/1 × 106 cellule in trattamento rispetto al controllo utilizzando PRNP come gene calibratore basato sul metodo 2-ΔΔCT .

6. Saggio di assorbimento dell'acido taurocolico (TCA)

  1. Mantenere le cellule imHC e HepaRG confluenti al 100% nel mezzo di maturazione per 14 giorni.
  2. Aspirare il mezzo e lavare gli epatociti con 1x PBS. Aggiungere la curcumina o la ciclosporina A (10-50 μM) diluita nel mezzo E di William per 2 ore. Sostituire il terreno con la soluzione di acido taurocolico di sodio (0,5 M di sodio taurocolato idrato in 1x HEPES) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  3. Aspirare la soluzione di acido taurocolico di sodio e lavare 3 volte con freddo 1x HEPES. Aggiungere 300-500 μL di 1x HEPES freddo e raccogliere le cellule con raschietti cellulari su ghiaccio.
  4. Omogeneizzare le cellule mediante ultrasuoni ad una frequenza di 20 kHz per 20 s e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare i lisati a 10.000 × g per 20 minuti per precipitare i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante e valutare la concentrazione intracellulare di acido taurocolico utilizzando un kit di analisi TCA ELISA (vedere la tabella dei materiali).

7. Determinazione delle interazioni proteina-ligando mediante calorimetria isotermica di titolazione

NOTA: Questo sistema di analisi è stato sviluppato sulla base del software MicroCal PEAQ-ITC (ITC).

  1. Preparare il tampone (tampone Tris-HCl da 50 mM, pH 7,0).
  2. Preparare 15 μM di NTCP nel buffer.
  3. Preparare soluzioni di inibitori di ingresso HBV candidati da 150 μM nel tampone.
  4. Lavare la cella del campione, la cella di riferimento e la siringa nello strumento ITC utilizzando il tampone (Passo 7.1.).
    1. Avviare il software ITC facendo doppio clic sull'icona del software nei sistemi Windows. Nella scheda Esegui evidenziazione esperimento, selezionare Metodo microCal per 19 Injection.itcm e fare clic su Apri. Quando si apre una nuova finestra, fare clic sulla scheda Pulisci e, nella finestra Metodo di pulizia, selezionare il pulsante Lava per Metodo di pulizia cellulare e il pulsante Risciacquo per Metodo di pulizia siringa. Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni visualizzate.
      NOTA: il completamento della fase di lavaggio può richiedere 1,4 ore.
  5. Caricare il campione nell'ITC; nella scheda Esegui esperimento , fai clic sul pulsante Carica e leggi le istruzioni visualizzate. Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni video fino al completamento di questa fase di caricamento.
    1. Riempire la cella di riferimento con tampone di soluzione usando una siringa. Riempire la cella del campione con 15 μM NTCP in tampone usando una siringa e rimuovere la soluzione NTCP in eccesso sulla cella del campione. Riempire la siringa con una soluzione da 150 μM di curcumina (ligando), evitando bolle d'aria nella siringa.
  6. Esegui l'esempio e, nella scheda Esegui esperimento , fai clic sul pulsante Esegui . Osservare le finestre sul lato sinistro che mostrano informazioni sperimentali e impostazioni sperimentali. Inserire le concentrazioni di ligando e proteine come 150 μM in [ Syr], 15 μM in [Cell], e 25 °C in temperatura.
  7. Nel software, fare clic su Start per eseguire il processo di iniezione e attendere 1,4 ore per il completamento dell'interazione proteina-ligando.
    NOTA: il pulsante di analisi sbiadito viene visualizzato sotto le finestre del software.
  8. Osservare che il pulsante di analisi si illumina al termine dell'iniezione. Fare clic sul pulsante di analisi nel software di controllo per analizzare i dati grezzi utilizzando il software di analisi . Fare clic su Panoramica per visualizzare i dati grezzi e scegliere il modello di raccordo come Un insieme di siti di associazione.
  9. Assicurarsi che lo stato di associazione mostri i dati sperimentali (associazione, nessuna associazione, controllo o dati di controllo) e che i valori dell'esperimento (KD, ΔG, ΔH, TΔS e N) siano presentati nel pannello software.
  10. Esportare i parametri termodinamici che prevedono il legame di interazione, inclusi il legame idrogeno, il legame di van der Waals e l'interazione idrofobica in formato tif o jpeg.
  11. Al termine dell'esperimento, lavare la cella del campione seguendo il passaggio 7.4.

8. Analisi statistica

  1. Eseguire tutti gli esperimenti in tre repliche indipendenti (n = 3).
  2. Presentare i dati sperimentali come mezzi ± SD ed eseguire analisi statistiche utilizzando il software di analisi statistica desiderato.
  3. Utilizzare un test t di Students' unpaired a due code per confrontare due valori medi o applicare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con Dunnett per confronti multipli tra più valori e un valore di controllo. Impostare il livello di significatività a p ≤ 0,05.

Risultati

Sono state osservate caratteristiche di maturazione epatica, tra cui cellule binucleate e morfologia di forma poligonale (Figura 1), specialmente nello stadio differenziato di imHC (Figura 1A). Un grande aumento dell'espressione di NTCP è stato misurato in d-HepaRG e d-imHC rispettivamente a 7 volte e 40 volte (Figura 1B). La forma altamente glicosilata di NTCP, postulata per conferire suscettibilità all'ingresso dell'HBV, è stat...

Discussione

L'infezione da HBV viene avviata attraverso il legame a bassa affinità ai proteoglicani dell'eparan solfato (HSPG) sugli epatociti25, seguito dal legame a NTCP con successiva internalizzazione attraverso l'endocitosi26. Poiché NTCP è un recettore cruciale per l'ingresso dell'HBV, l'ingresso mirato all'HBV può essere clinicamente tradotto per ridurre l'infezione de novo , la trasmissione madre-figlio (MTCT) e la recidiva dopo trapianto di fegato. Interrompere l'...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo progetto di ricerca è supportato dalla Mahidol University e dalla Thailand Science Research and Innovation (TSRI) assegnati separatamente ad A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall'Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council attraverso il Program Management Unit for Competitiveness (numero di sovvenzione C10F630093). A. Wongkajornsilp ha ricevuto una borsa di studio Chalermprakiat della Facoltà di Medicina Siriraj Hospital, Mahidol University. Gli autori desiderano ringraziare Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) per la sua assistenza con la tecnica ITC.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell lines
HepaRG Cells, CryopreservedThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell LineMerckSCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer SolutionFUJIFLIM Wako chemical163-20145
BD Perm/Wash bufferBD Biosciences554723Perm/Wash buffer
Cyclosporin Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 disulfate saltMerck108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kitsGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation KitGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription SystemPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X ConcentratorTakara bioPT4421-2concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrateMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
Nucleospin DNA extraction kitmacherey-nagel1806/003
Phosphate buffered salineMerckP3813
Polyethylene glycol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Recombinant NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibodyAbcamab1310841:100 dilution
    Anti-GAPDH antibodyThermo Fisher ScientificAM43001:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibodyAbcamab2057181:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibodyAbcamab970231:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     Sodium azideSigma199931Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12Gibco12400-024
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E mediumSigma AldrichW4125-1L
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
      5 µg/mL  InsulinSigma Aldrich91077C-100MG
      50 µM hydrocotisoneSigma AldrichH0888-1g
     2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBSGibco21300-058
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     0.2% Triton X-100SigmaT8787Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer SolutionMerck20-188Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific78425Final concentration: 1X
       Na3VO4Final concentration: 1 mM
       PMSFFinal concentration: 1 mM
       NaFFinal concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     Tween 20Merck9005-64-5
     1x TBST0.1% Tween 20
     1x PBSGibco21300-058
     Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA53225
     Polyacrylamide gelBio-Rad161-0183
     Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad161-0700Final concentration: 0.05%
    TEMEDBio-Rad161-0800Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk)Bio-Rad170-6404Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG889814.4 g
     SDSMerck7910Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG88987.2 g
     MethanolMerck106009100 mL
Mild stripping solution 1 LAdjust pH to 2.2
    GlycineSigmaG889815 g
     SDSMerck79101 g
     Tween 20Merck9005-64-510 mL
Equipments
15 mL centrifuge tubeCorning430052
50 mL centrifuge tubeCorning430291
Airstream Class IIEsco2010621Biological safety cabinet
CelCulture CO2 IncubatorEsco2170002Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR DetectorBio-Rad1855196
FACSVerse Flow CytometerBD Biosciences651154
Graduated pipettes (10 mL)Jet BiofilGSP010010
Graduated pipettes (5 mL)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernIsothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paperBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
Pipette controllerEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Power supply
PVDF membraneMerckIPVH00010
T-75 cell culture flaskCorning431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad1703940Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated CentrifugeEscoT1000RCentrifuge with swinging bucket rotar

Riferimenti

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