Tecniche molecolari e immunologiche in un modello murino geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale

Riepilogo

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere il modello murino Kit^{V558Δ/+ e le} tecniche per la dissezione e l'elaborazione di campioni di topo.

Abstract

Il tumore stromale gastrointestinale (GIST) è il sarcoma umano più comune ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nel recettore KIT. Tra i tipi di tumore, sono stati sviluppati numerosi modelli murini al fine di studiare la prossima generazione di terapie contro il cancro. Tuttavia, in GIST, la maggior parte degli studi in vivo utilizza modelli murini con xenotrapianto che presentano limitazioni intrinseche. Qui, descriviamo un modello murino immunocompetente e geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale che ospita una mutazione Kit^{V558Δ / +} . In questo modello, il KIT mutante, l'oncogene responsabile della maggior parte dei GIST, è guidato dal suo promotore endogeno che porta a un GIST che imita l'aspetto istologico e l'infiltrato immunitario visto nei GIST umani. Inoltre, questo modello è stato utilizzato con successo per studiare sia terapie molecolari mirate che immunitarie. Qui descriviamo l'allevamento e il mantenimento di una colonia di topi Kit^V558Δ/+ . Inoltre, questo documento descrive in dettaglio il trattamento e l'approvvigionamento di GIST, drenaggio del linfonodo mesenterico e cieco adiacente nei topi Kit^{V558Δ / +} , nonché la preparazione del campione per analisi molecolari e immunologiche.

Introduzione

GIST è il sarcoma più comune negli esseri umani con un'incidenza di circa 6.000 casi negli Stati Uniti d'America¹. GiST sembra provenire dalle cellule pacemaker gastrointestinali chiamate cellule interstiziali di Cajal ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nella tirosin-chinasi KIT o PDGFRA². La chirurgia è il pilastro del trattamento per GIST e può essere curativa, ma i pazienti con malattia avanzata possono essere trattati con l'inibitore della tirosin-chinasi (TKI), imatinib. Dalla sua introduzione oltre 20 anni fa, imatinib ha trasformato il paradigma di trattamento in GIST, migliorando la sopravvivenza nella malattia avanzata da 1 a oltre 5 anni ^3,4,5. Sfortunatamente, imatinib è raramente curativo a causa delle mutazioni KIT acquisite, quindi sono necessari nuovi trattamenti per questo tumore.

I modelli murini sono un importante strumento di ricerca nello studio di nuove terapie nel cancro. In GIST ^6,7 sono stati sviluppati e studiati più modelli di xenotrapianto sottocutaneo e derivati dal paziente. Tuttavia, i topi immunodeficienti non rappresentano pienamente il GIST umano poiché i GIST ospitano profili immunitari differenziali a seconda della loro mutazione oncogenica e l'alterazione del microambiente tumorale gastrointestinale migliora gli effetti della terapia TKI ^8,9. Il topo Kit^V558Δ/+ ha una delezione della linea germinale eterozigote nell'esone Kit 11, che codifica nel dominio juxtamembrane, il sito più comunemente mutato nel GIST¹⁰ umano. I topi del kit^V558Δ/+ sviluppano un singolo GIST cecale con penetranza al 100% e i tumori hanno istologia, segnalazione molecolare, infiltrazione immunitaria e risposta alla terapia simili a quelle umane di GIST 8,11,12,13. Qui, descriviamo l'allevamento, il trattamento e l'isolamento e l'elaborazione dei campioni nei topi Kit^{V558Δ / +} per l'uso nella ricerca molecolare e immunologica in GIST.

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Protocollo

Tutti i topi sono stati ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Università della Pennsylvania secondo le linee guida NIH e con l'approvazione dell'Università della Pennsylvania IACUC. L'eutanasia è stata eseguita seguendo le procedure operative standard dell'Università della Pennsylvania Laboratory Animal Resources.

1. Kit^V558Δ/+ allevamento di topi

1. Incrocia i mouse Kit^V558Δ/+ più di 10 volte su uno sfondo C57BL/6J utilizzando mouse C57BL/6J. Per fare questo, allevare i topi maschi Kit^{V558Δ / +} con topi C57BL / 6J femmina con un rapporto 1: 2.
   NOTA: Il genotipo omozigote Kit^{V558Δ/V558Δ} è letale in utero. È possibile allevare topi Kit^V558Δ/+ femmina con topi maschi C57BL/6J, ma la dimensione della cucciolata è circa la metà di quella osservata dai topi femmina C57BL/6J. Inoltre, i topi Femmina Kit^V558Δ/+ producono cucciolate limitate dopo i 4 mesi di età.
2. Genotipizzare i cuccioli a 7-14 giorni di età mediante clipping della punta per confermare la presenza del genotipo Kit^V558Δ/ +. Utilizzare il primer in avanti: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; reporter 1: CCTCGACAACCTTCCA; primer inverso: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; e reporter 2: TCTCCTCGACCTTCCA per la genotipizzazione.

2. Kit^V558Δ/+ trattamento mouse

1. Età e sesso corrispondono ai topi Kit^V558Δ/+prima del trattamento. Utilizzare i topi abbinati all'età e al sesso in coorti poiché i tumori dei topi Kit^{V558Δ / +} femminili sono più grandi di quelli nei topi maschi. Trattare i topi a 8-12 settimane di età, momento in cui i tumori sono stabiliti (Figura 1).
2. Somministrare inibitori della tirosin-chinasi per via orale o mediante iniezione intraperitoneale (i.p.); I tumori del kit^V558Δ/+ sono sensibili agli inibitori della tirosina chinasi. Somministrare imatinib in una dose di 600 mg/L in acqua potabile o iniezioni i.p. di 45 mg/kg due volte al giorno. Misurare la riduzione del peso del tumore utilizzando bilance digitali dopo la dissezione del tumore come mostrato nella fase 3, che è di circa il 50% a 1 settimana e l'80% a 4 settimane dopo il trattamento con imatinib (Figura 2).

3. Kit^V558Δ/+ prelievo di organi di topo

1. Eutanasia dei topi mediante_narcosi da CO 2 ad una portata del 60% del volume della camera al minuto. Lasciare i topi nella camera per almeno 2 minuti dopo che la respirazione è cessata, quindi eseguire la lussazione cervicale per confermare la morte.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti, indossare guanti durante la procedura e mantenere un campo sterile. Preparare la pelle con il 70% di etanolo. Fai un'incisione verticale della linea mediana di 2 cm usando le forbici ed entra nella cavità addominale. Lisare bruscamente eventuali aderenze intra-addominali.
3. Per rimuovere il linfonodo mesenterico drenante, seguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Identifica il cieco e solleva il suo mesentere in modo superiore. Approssimativamente a metà strada verso la base del mesentere del colon, identificare il linfonodo mesenterico e sezionarlo bruscamente. Il linfonodo è bianco sporco e di circa 0,5 cm x 0,5 cm di dimensione.
   2. Dividere il tessuto linfonodale in terzi per l'isolamento proteico, l'istologia e la sospensione unicellulare, se necessario. Per le sospensioni monocellulari, posizionare il tessuto linfonodale in 20 ml di mezzi privi di siero (RPMI) e mantenere sul ghiaccio.
4. Per l'isolamento del GIST e del cieco, seguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Il cieco nei topi Kit^V558Δ/+ è per lo più sostituito da un GIST. Dividere con attenzione la giunzione ileocolica dalla base del tumore. Per raccogliere il cieco, dividere nuovamente il colon, 2 cm prossimale alla base del tumore.
   2. Nel 50%-60% dei topi Kit^V558Δ/+ , la testa del tumore contiene un cappuccio di tessuto cecale, che in genere contiene liquido sieroso ma può raramente contenere pus (Figura 3). Sezionare bruscamente il tessuto del cappuccio lontano dal tessuto tumorale.
   3. Dividere il tessuto tumorale e / o il cieco in terzi per l'isolamento proteico, l'istologia e la sospensione unicellulare, se necessario. Per le sospensioni monocellulari, posizionare il tessuto tumorale o il cieco in HBSS con FCS al 2%, sufficiente per coprire il campione e mantenere il ghiaccio.

4. Analisi Western blot del tessuto GIST

1. Preparare un tampone di lisi tissutale contenente 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, detergente non denaturante all'1%, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 10 mM NaF e 20 μl/ml di miscela di inibitori della proteinasi.
2. Preparare una soluzione salina 1x Tris-buffered con 1% Tween 20 (TBST) combinando 1800 mL di acqua deionizzata, 2 mL di Tween 20 e 200 mL di 10x Tris-buffered saline (TBS).
3. Risospese il tessuto dal punto 3.4.3 in un tubo FACS in 5mL/g di tampone di lisi tissutale e omogeneizzare due volte con un omogeneizzatore meccanico a 15.000 giri / min per 15 s su ghiaccio. Incubare lisato per 30 minuti su ghiaccio.
4. Trasferire il lisato in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare alla massima velocità per 20 min a 4 °C. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga.
5. Eseguire lisati su un gel sfumato dal 4% al 15%, quindi trasferirli su una membrana di nitrocellulosa, come descritto in¹⁴.
6. Lavare la membrana una volta in 1x TBS per 5 minuti e quindi bloccare la membrana nel latte al 5% per 1 ora. Ancora una volta, lavare la membrana una volta in 1x TBS per 10 minuti.
7. Membrana di incubazione in anticorpo primario diluito 1:1000 in BSA al 5% a 4 °C durante la notte. Lavare la membrana 3x in 1x TBST per 10 min ciascuno. Incubare blot con anticorpo secondario diluito 1:2500 in latte al 2,5% per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Lavare la membrana una volta in 1x TBS per 5 min. Aggiungere abbastanza substrato HRP per coprire la membrana, in genere 200-500 μL, e utilizzare un imager digitale per rilevare e quantificare la chemiluminescenza.

5. Immunoistochimica del tessuto GIST

1. Fissare il tessuto dal passo 3.3.2 o 3.4.3 in paraformaldeide al 4% a 4 °C durante la notte. Conservare il tessuto in 70% EtOH fino al momento della lavorazione. Incorporare e sezionare blocchi a 5 μm di spessore su vetrini, come descritto^15,16.
2. Rilevamento immunoistochimico completo utilizzando un kit di immunodetezione di base, come descritto in precedenza¹⁷.

6. Sospensione unicellulare del linfonodo mesenterico

1. Versare il fluido RPMI con il campione linfonodale dal passaggio 3.3.2 su un filtro da 100 μm. Spostare il filtro sul nuovo linfonodo conico e poltiglia da 50 mL con l'estremità morbida di una siringa di plastica da 3 mL. Filtro di lavaggio con 20 mL di supporti RPMI.
2. Centrifugare il filtrato a 450 x g a 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante.
3. Risciacquare il pellet in 20 ml di FBS all'1% in PBS (tampone perline) e versare su un filtro da 40 μm. Raccogliere il filtrato cellulare. Conta le cellule usando un emocitometro.
4. Centrifugare il filtrato a 450 x g a 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospeso in tampone di perline a 6 x 10⁷ cellule/mL per citometria a flusso.

7. Sospensione monocellulare di GIST

1. Preparare il tampone della collagenasi aggiungendo 250 mg di collagenasi IV, una compressa di inibitore della proteasi privo di EDTA e 100 μL di DNasi I a 50 ml di HBSS. Ruotare per 10 minuti a temperatura ambiente fino a quando non si scioglie.
2. Mettere GIST in un piatto sterile e aggiungere 2,5 ml di tampone di collagenasi. Tritare il tumore usando un bisturi sterile e forbici fino a quando il tumore è in frammenti fini. Utilizzare una pipetta di grandi dimensioni per aspirare il tumore e la collagenasi in un tubo da 50 ml.
3. Incubare in un incubatore vibrante a 100 giri/min a 37 °C per 30 min. Reazione di spegnimento con 2 ml di FBS.
4. Versare la collagenasi con il campione GIST su un filtro da 100 μm e schiacciare il tumore con l'estremità morbida di una siringa di plastica da 3 ml e raccogliere in un tubo da 50 ml. Filtro di lavaggio con 20 ml di HBSS. Centrifugare il filtrato a 450 x g, 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante.
5. Risospesare il pellet in 20 ml di tampone perline e versare su un filtro da 40 μm. Raccogliere il filtrato e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare il filtrato a 450 x g, 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospeso in tampone di perline a 6 x 10⁷ cellule/mL per citometria a flusso.

8. Sospensione unicellulare del cieco

1. Preparare il tampone di collagenasi come nel passaggio 7.1. Usando le forbici, dividere il cieco longitudinalmente per esporre la mucosa interna. Tagliare in sezioni di 0,5 cm e posizionare in un tubo da 50 ml con 5 mL di HBSS con il 2% di FBS. Agitare energicamente per 30 s, centrifugare a 450 x g per 20 s, quindi aspirare il surnatante.
2. Aggiungere 5 mL di HBSS con 2 mM EDTA. Incubare in un incubatore vibrante a 37 °C a 100 giri/min per 15 min. Centrifuga a 450 x g per 20 s. Aspirare il surnatante.
3. Aggiungere 5 ml di HBSS. Agitare energicamente per 30 s, centrifugare a 450 x g per 20 s, quindi aspirare il surnatante. Ripeti ancora una volta.
4. Aggiungere 5 ml di tampone di collagenasi. Incubare in un incubatore vibrante a 37 °C per 30 minuti a 100 giri/min. Agitare energicamente ogni 10 minuti. Reazione di spegnimento con 2 ml di FBS.
5. Versare la collagenasi con un campione di cieco su un filtro da 100 μm e schiacciare con l'estremità morbida di una siringa di plastica da 3 ml. Filtro di lavaggio con 20 ml di HBSS. Raccogliere il filtrato.
6. Centrifugare il filtrato a 450 x g per 5 min a 4 °C. Aspirare il surnatante. Sostituire il pellet in 20 mL di tampone perline e versare su un filtro da 40 μm. Raccogliere filtrare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
7. Centrifugare il filtrato a 450 x g per 5 min a 4 °C. Aspirare il surnatante. Risospeso in tampone di perline a 6 x 10⁷ cellule/mL per citometria a flusso.

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Risultati

Il modello ^{murino Kit V558Δ/+} consente lo studio delle terapie in un modello murino immunocompetente. I topi Kit^V558Δ/+ hanno una durata media di 8 mesi a causa dell'ostruzione intestinale progressiva (Figura 4). I tumori dei topi kit^V558Δ/+ esprimono marcatori canonici di GIST tra cui il KIT tirosin-chinasico e il canale transmembrana DOG1 (Figura 5...

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Discussione

Il modello^{murino Kit V558Δ/+} è un potente strumento di ricerca nell'analisi molecolare e immunologica del GIST. Sebbene la strategia di allevamento richieda un singolo incrocio, l'utilizzo di coorti di topi Kit^V558Δ/+ in esperimenti di analisi della risposta tumorale richiede un allevamento estensivo. I topi dovrebbero essere abbinati all'età e al sesso per garantire pesi tumorali simili e il 10% dei topi muore prima delle 8 settimane di età quando i tumori sono stabiliti. Str...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical