Induzione dell'infiammazione della superficie oculare e raccolta dei tessuti coinvolti

Riepilogo

L'infiammazione della superficie oculare danneggia i tessuti della superficie oculare e compromette le funzioni vitali dell'occhio. Il presente protocollo descrive un metodo per indurre l'infiammazione oculare e raccogliere i tessuti compromessi in un modello murino di disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD).

Abstract

Le malattie della superficie oculare comprendono una serie di disturbi che disturbano le funzioni e le strutture della cornea, della congiuntiva e della rete di ghiandole superficiali oculari associate. Le ghiandole di Meibomio (MG) secernono lipidi che creano uno strato di copertura che impedisce l'evaporazione della parte acquosa del film lacrimale. I neutrofili e le trappole del DNA extracellulare popolano la MG e la superficie oculare in un modello murino di malattia allergica dell'occhio. Le trappole extracellulari aggregate di neutrofili (aggNET) formulano una matrice simile a una maglia composta da cromatina extracellulare che occlude le prese di MG e condiziona la disfunzione della MG. Qui viene presentato un metodo per indurre l'infiammazione della superficie oculare e la disfunzione MG. Le procedure per la raccolta di organi relativi alla superficie oculare, come la cornea, la congiuntiva e le palpebre, sono descritte in dettaglio. Utilizzando tecniche consolidate per l'elaborazione di ciascun organo, vengono anche mostrate le principali caratteristiche morfologiche e istopatologiche della disfunzione MG. Gli essudati oculari offrono l'opportunità di valutare lo stato infiammatorio della superficie oculare. Queste procedure consentono lo studio di interventi antinfiammatori topici e sistemici a livello preclinico.

Introduzione

Ogni battito di ciglia riempie il film lacrimale liscio disperso sulla cornea. Gli epiteli della superficie oculare facilitano la distribuzione e il corretto orientamento del film lacrimale sulla superficie oculare. Le mucine sono fornite dalla cornea e dalle cellule epiteliali congiuntiva per aiutare a posizionare la parte acquosa del film lacrimale proveniente dalle ghiandole lacrimali sulla superficie degli occhi. Infine, MG secerne lipidi che creano uno strato di copertura che impedisce l'evaporazione della parte acquosa del film lacrimale ^1,2,3. In questo modo, le funzioni coordinate di tutti gli organi oculari proteggono la superficie oculare da agenti patogeni o lesioni invasori e supportano una visione cristallina senza alcun dolore o disagio.

In una superficie oculare sana, la scarica oculare o il reum oculare spazza via polvere, cellule epiteliali morte, batteri, muco e cellule immunitarie. Le trappole extracellulari di neutrofili aggregati (aggNET) formulano una matrice simile a una maglia composta da cromatina extracellulare e incorporano questi componenti nel reum dell'occhio. Gli AggNET risolvono l'infiammazione mediante la degradazione proteolitica di citochine e chemochine pro-infiammatorie⁴. Tuttavia, quando diventano disfunzionali, questi aggNET aberranti guidano la patogenesi di malattie come le occlusioni vascolari in COVID-19⁵, calcoli biliari⁶ e sialolitiasi⁷. Allo stesso modo, gli aggNET sulla superficie oculare svolgono un ruolo protettivo e contribuiscono a risolvere l'infiammazione della superficie altamente esposta⁸. Una formazione esagerata o la mancanza di aggNET nella superficie oculare possono compromettere la stabilità del film lacrimale e / o causare ferite corneali, congiuntivite cicatrizzante e malattia dell'occhio secco. Ad esempio, l'ostruzione della MG è una delle principali cause di malattia dell'occhio secco⁹. Gli AggNET sono anche noti per tappare il flusso di secrezione lipidica dai dotti di MG e causare la disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD). La congestione degli orifizi MG da parte di aggNET provoca una mancanza di fluido grasso che avvolge la superficie oculare e il fluido imbottigliato retrogrado, con conseguente disfunzione della funzione ghiandolare e danni acinosi. Questa disfunzione può provocare evaporazione del film lacrimale, fibrosi dei margini sulle palpebre, infiammazione oculare e danni dannosi alla MG^10,11.

Diversi modelli animali sono stati sviluppati nel corso degli anni per imitare il processo patologico della MGD nell'uomo. Ad esempio, topi C57BL / 6 di età pari o superiore a 1 anno hanno contribuito a studiare gli effetti legati all'età sulla malattia dell'occhio secco (DED) e MGD, riflettendo la patologia della malattia oculare in pazienti di età pari o superiore a 50 anni^12,13,14. Inoltre, i conigli sono modelli appropriati per studiare gli effetti degli interventi farmacologici. Pertanto, l'induzione di MGD nei conigli è stata riportata sia dalla somministrazione topica di adrenalina che dall'introduzione sistemica di acido 13-cis-retinoico (isotretinoina)15,16,17,18,19.

Sebbene questi modelli animali fossero adeguati per determinare i diversi fattori che contribuiscono alla fisiopatologia della MGD, erano limitati nel loro utilizzo. Ad esempio, il modello murino di MGD legata all'età era ideale per decifrare elementi solo negli anziani e, quindi, i conigli sembravano essere il modello animale più adatto per studiare le malattie della superficie oculare, in quanto consentono lo studio di molteplici meccanismi fisiopatologici. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti analitici completi per rilevare le proteine sulla superficie oculare e poiché molte parti del genoma del coniglio non sono annotate, sono limitate per le indagini^20,21.

Inoltre, questi modelli animali utilizzati per studiare la patogenesi della malattia dell'occhio secco non hanno fornito dettagli adeguati per analizzare il braccio immunologico del disturbo che istiga l'infiammazione della superficie oculare. Di conseguenza, il modello murino di MGD sviluppato da Reyes et al. ha mostrato un'associazione tra malattia allergica dell'occhio nei topi e MGD nell'uomo e ha evidenziato l'eziologia immunitaria responsabile della MGD²¹ ostruttiva. Questo modello associa la malattia allergica dell'occhio con una risposta TH17 che recluta neutrofili alla congiuntiva e alla palpebra, causando MGD e infiammazione oculare cronica²¹. L'induzione della MGD e dell'infiammazione oculare in questo modello murino è uno strumento prezioso per studiare gli eventi a monte durante lo sviluppo dell'infiammazione locale guidata da una risposta immunitaria in corso²¹. L'attuale protocollo descrive l'infiammazione della superficie oculare accompagnata da MGD ostruttiva. In questo metodo, i topi vengono immunizzati e, dopo 2 settimane, sfidati sulla superficie oculare con l'immunogeno per 7 giorni. Inoltre, vengono descritti i passaggi per isolare l'essudato oculare e gli organi oculari associati durante l'infiammazione acuta e la dissezione della cornea, della congiuntiva e delle palpebre.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state condotte secondo le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e approvate dalla commissione per il benessere degli animali della Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) (numero di autorizzazione: 55.2.2-2532-2-1217). Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57Bl/6, di età compresa tra 7 e 9 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e tenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni con cicli giorno/notte di 12 ore.

1. Induzione dell'infiammazione della superficie oculare murina

1. Eseguire la preparazione immunogena per l'immunizzazione.
   1. Preparare l'immunogeno fresco il giorno dell'immunizzazione, mescolando l'ovoalbumina (OVA, 50 mg/ml) e la tossina della pertosse (100 μg/ml) in soluzione salina e l'adiuvante idrossido di alluminio (40 mg/ml) (vedi Tabella dei materiali) in proporzione 1:1.
      ATTENZIONE: Eseguire l'apertura, la ricostituzione e la preparazione immunogena della tossina della pertosse in un armadio di sicurezza laminare. Indossare indumenti protettivi ed evitare qualsiasi contatto con la pelle.
   2. Incubare l'immunogeno e la miscela adiuvante a temperatura ambiente per 30 minuti e caricare 100 μL in una siringa da 1 ml.
   3. Eseguire l'iniezione intraperitoneale della soluzione immunogena in un topo non anestetizzato.
      1. Tieni il mouse dolcemente per la coda mentre afferri la griglia della gabbia. Tenere saldamente la pelle della schiena e la regione del collo tra il pollice e l'indice e fissare la coda e gli arti inferiori tra l'anello e il mignolo contro il palmo della mano.
      2. Tieni il mouse fisso con la testa verso il basso.
      3. Iniettare 100 μL della soluzione immunogena preparata nel quadrante destro o sinistro della cavità addominale inferiore.
2. Eseguire la sfida della superficie oculare 2 settimane dopo l'immunizzazione.
   1. Anestetizzare il topo con isoflurano (2,5%).
   2. Applicare 5 μL di OAV (50 mg/ml) o soluzione salina (0,9% NaCl) per occhio su entrambi gli occhi e attendere che la goccia venga assorbita dall'occhio. Questo richiede ~ 5 min.
   3. Ripetere la procedura 1 volta al giorno per 7 giorni.
      NOTA: La somministrazione topica di farmaci può essere effettuata allo stesso modo.

2. Raccolta degli essudati oculari

1. Recuperare gli essudati oculari formati durante la fase di challenge applicando 50 μL di soluzione salina sterile sull'occhio subito dopo la sfida.
2. Per ottenere una sospensione unicellulare, trattare la secrezione oculare raccolta con MNasi ricombinante (2 x 10⁶ gel U/mL, vedi Tabella dei materiali) contenente il calcio cofattore (5 mM) a 37 °C per 20 min.
3. Centrifugare a 400 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
4. Isolare il surnatante e misurare le citochine e le chemochine utilizzando ELISA multiplex secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Il surnatante ottenuto può essere utilizzato per l'analisi delle proteine e il pellet per saggi funzionali come immunofenotipizzazione, fagocitosi, degranulazione ed espressione genica.

3. Asportazione dei tessuti superficiali oculari

1. Seziona le palpebre e il globo oculare seguendo i passaggi seguenti.
   1. Eutanasia del topo mediante asfissia da CO₂ e lussazione cervicale.
   2. Posizionare il mouse su una superficie piana.
   3. Disinfettare l'area orbitale intorno all'occhio con un tampone impregnato di etanolo al 70%.
   4. Fare un'incisione tra l'orecchio e il seno retro-orbitale e lungo la superficie sopra l'osso squamoso verticalmente, estendendo l'incisione orizzontalmente sotto la palpebra inferiore lungo l'osso mascellare e sopra la palpebra superiore lungo l'osso frontale. Questo forma un'incisione intorno all'occhio (Figura 1).
   5. Tenere con cura il tessuto sezionato intorno all'occhio usando una pinza curva e tirare fuori il tessuto e il bulbo oculare.
   6. Posizionare gli organi asportati in PBS sterile.
   7. Tagliare il tessuto muscolare facciale in eccesso intorno alle palpebre superiori asportate usando un bisturi e sotto lo stereomicroscopio.
2. Raccogli la congiuntiva seguendo i passaggi seguenti.
   1. Posizionare la palpebra superiore su una capsula di Petri asciutta sotto lo stereomicroscopio.
   2. Usando una pinzetta fine e un bisturi, staccare lo strato biancastro-mucoso molto delicatamente dalla superficie interna della palpebra.
3. Quindi, sezionare la cornea seguendo i passaggi seguenti.
   1. Posizionare il globo oculare su una nuova capsula di Petri asciutta sopra il ghiaccio secco per 3 minuti.
   2. Portare la capsula di Petri sulla superficie del banco in una posizione stabile.
   3. Fai una piccola incisione sul bordo della cornea vicino al limbus usando sottili forbici affilate.
   4. Prolungare l'incisione con il bisturi intorno al globo oculare, separando la sclera dalla cornea.
   5. Rimuovere i resti dell'iride e della lente dalla parte posteriore della cornea sciacquando generosamente con soluzione salina.

4. Documentazione dell'ostruzione della ghiandola di Meibomio (MG)

1. Per valutare la MG e i suoi orifizi, posizionare le palpebre asportate in posizione verticale sotto lo stereomicroscopio (Figura 2).
2. Cattura immagini con luce bianca epi-illuminazione in base al tempo di esposizione della fotocamera e alle impostazioni ISO.
   NOTA: L'analisi morfometrica di queste immagini fornisce una quantificazione affidabile della dimensione del tappo all'uscita delle ghiandole. La quantificazione può essere eseguita delineando con lo strumento bacchetta i tappi oculari ed eseguendo il comando "Analizza particelle" del software Image J (vedi Tabella dei Materiali).

5. Transilluminazione delle palpebre (morfologia della ghiandola di Meibomio)

1. Per valutare l'area MG, posizionare le palpebre asportate in posizione orizzontale e accendere la retroilluminazione dello stereomicroscopio dotato di una telecamera a infrarossi (Figura 3).
2. Acquisire immagini regolando il tempo di esposizione in base all'ISO della fotocamera (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: L'imaging a infrarossi di queste palpebre transilluminate sotto lo stereomicroscopio può aiutare a misurare la forma e le dimensioni di ogni acini. L'analisi morfometrica di queste immagini fornisce una quantificazione affidabile delle dimensioni e del numero di MG. La quantificazione può essere eseguita delineando la MG con lo strumento bacchetta ed eseguendo il comando "Analizza particelle" del software Image J.

Risultati

Il presente protocollo descrive i passaggi sequenziali per stabilire un modello murino di infiammazione della superficie oculare. I protocolli mirano a mostrare come applicare le terapie localmente, ottenere essudati oculari e asportare organi accessori associati come palpebre sane e infiammate (Figura 2), la cornea e la congiuntiva. Bisogna prestare attenzione quando le palpebre superiori vengono sezionate per l'isolamento della congiuntiva e deve essere conservato in 1x PBS durante la diss...

Discussione

La secrezione oleosa delle ghiandole di Meibomio è di grande importanza per un occhio sano²². Tuttavia, l'ostruzione di queste ghiandole sebacee da parte di trappole extracellulari di neutrofili aggregati (aggNET) che si allineano come filamenti paralleli situati sulle placche tarsali di entrambe le palpebre può interrompere il film lacrimale²³. Questa interruzione provoca disfunzione della ghiandola di Meibomio (MGD)¹ e un'evaporazione lacrimale a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco
Aluminium Hydroxide	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks	Charles River Laboratories
Calcium	Carl roth	CN93.1	1 M Final Concentration: 5 mM
Curved forceps	FST by Dumont SWITZERLAND	5/45 11251-35
Fine sharp scissor	FST Stainless steel, Germany	15001-08
Laminar safety cabinet	Herasafe
Macrophotography Camera	Canon	EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)	Nikon	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)	B.Braun
Ovalbumin (OVA)	Endofit, Invivogen	9006-59-1	10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin	ThermoFisher Scientific	PHZ1174	50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish	Greiner bio-one	628160
Scalpel	Feather disposable scalpel	No. 21	Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi508
Syringe (corneal/iris washing)	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm