Un modello di topi di danno peritoneale indotto da clorexidina gluconato

Riepilogo

Il presente protocollo stabilisce un modello murino di dialisi peritoneale (PD) di fibrosi peritoneale indotta da clorexidina gluconato (CG). Il modello attuale è semplice e facile da usare rispetto ad altri modelli animali PD.

Abstract

La fibrosi peritoneale è un'importante complicanza della dialisi peritoneale (PD). Per indagare e affrontare questo problema, è necessario un modello animale appropriato di PD. Il presente protocollo stabilisce un modello di fibrosi peritoneale indotta da clorexidina gluconato (CG) che imita la condizione di un paziente con PD. La fibrosi peritoneale è stata indotta mediante iniezione intraperitoneale dello 0,1% di CG in etanolo al 15% per 3 settimane (somministrato a giorni alterni), per un totale di nove volte nei topi maschi C57BL / 6. I test funzionali peritoneali sono stati quindi eseguiti il giorno 22. Dopo che i topi sono stati sacrificati, sono stati raccolti il peritoneo parietale della parete addominale e il peritoneo viscerale del fegato. Erano più spessi e più fibrotici se analizzati al microscopio dopo la colorazione tricromatica di Masson. La velocità di ultrafiltrazione è diminuita e il trasporto di massa di glucosio ha indicato un aumento della permeabilità peritoneale indotto da CG. Il modello PD così stabilito può avere applicazioni nel miglioramento della tecnologia PD, nell'efficacia della dialisi e nel prolungamento della sopravvivenza del paziente.

Introduzione

La dialisi peritoneale (PD) è un tipo di terapia sostitutiva renale. Tuttavia, il PD ha problemi che non possono essere risolti. Ad esempio, il trattamento a lungo termine della malattia di Parkinson può causare danni peritoneali, portando infine al fallimento dell'ultrafiltrazione e alla sospensione del trattamento 1,2,3,4,5,6. La fibrosi peritoneale è una delle complicanze più gravi ^7,8. La fibrosi peritoneale è caratterizzata dalla deposizione e dall'accumulo di matrice extracellulare all'interno dell'interstizio e dalla neoangiogenesi e vasculopatia del peritoneo ^9,10.

Le cause principali di questi cambiamenti peritoneali sono la peritonite ricorrente e la non biocompatibilità del dializzato, che sono iperosmotiche, alto glucosio, basso pH e accumulo di prodotti di degradazione del glucosio^11,12. Pertanto, modelli sperimentali animali adatti possono aiutare i ricercatori a studiare meglio i cambiamenti fisiologici e patologici del peritoneo durante la terapia con PD. Pertanto, stabilire un modello animale di PD è importante per migliorare la tecnologia PD e l'efficacia della dialisi e prolungare la sopravvivenza del paziente. Questo studio mirava a generare un modello murino PD mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di clorexidina gluconato (CG), come descritto in precedenza^13,14. Questo modello di topo PD è semplice, facile da usare e fattibile rispetto ad altri modelli animali PD.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Laboratory Animal Center dell'E-DA Hospital / I-Shou University e sono stati gestiti secondo la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (NRC, USA 2011). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6, di 7-8 settimane.

1. Preparazione chimica

1. Preparare l'irritante chimico diluendo lo 0,1% di clorexidina gluconato (CG, vedi Tabella dei materiali) in etanolo al 15%.

2. Trattamento degli animali

1. Assegnare tre topi come gruppo di controllo. Eseguire l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 1 ml/kg di soluzione salina normale allo 0,9% (NS) a giorni alterni per 3 settimane, per un totale di nove volte.
2. Assegnare tre topi al gruppo di fibrosi peritoneale. Indurre la fibrosi peritoneale utilizzando clorexidina gluconato (CG) somministrando iniezioni i.p. dello 0,1% di CG in etanolo al 15% (fase 1.1) alla dose di 12,5 μL/g di peso corporeo. Eseguilo a giorni alterni per 3 settimane, per un totale di nove volte.

3. Test di funzionalità peritoneale (test di equilibrio peritoneale modificato)

1. Preparare una soluzione di dialisi contenente glucosio al 4,25%. Prelevare 0,5 ml di campione di dializzato con una siringa, quindi controllare la concentrazione di glucosio nel campione di dializzato.
   NOTA: La concentrazione di glucosio è determinata secondo il metodo esochinasi/G6PD. I campioni di dializzato sono stati sottoposti al test Glu 2 di tipo L e sono stati studiati con un analizzatore biochimico (vedi Tabella dei materiali). Questa è la concentrazione iniziale di glucosio dializzato.
2. Anestetizzare i topi mediante iniezione intramuscolare di Zoletil e Xilazina (preparati in un rapporto di 1:2 in volume, vedere Tabella dei materiali) alla dose di 20 μL/20 gw. Inoltre, utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza in anestesia.
3. Eseguire l'instillazione i.p. della soluzione di dialisi (2 ml/20 g di peso corporeo).
4. Dopo 30 minuti, valutare e verificare la profondità dell'anestesia con mancanza di riflesso del pizzico della punta. Quindi, eseguire un'incisione verticale nella linea mediana dell'addome (sotto il processo xifoideo), quindi aprire l'addome dei topi e raccogliere il liquido intraperitoneale con una siringa (definita come "volume 1"). Quindi, misurare il peso di un cotone pulito e asciutto e mettere il cotone nella cavità addominale dei topi per assorbire il liquido intraperitoneale residuo. Infine, misurare nuovamente il peso del cotone.
   NOTA: L'aumento di peso del cotone è uguale al peso del liquido intraperitoneale residuo. Quindi, convertire nel volume ottenuto (peso specifico: 1 g / cm³; definito come "volume 2"). Il volume finale del dializzato è il volume 1 più il volume 2.
5. Utilizzare 0,5 ml di campione di dializzato (dializzato finale) per misurare la concentrazione di glucosio. Questa è la concentrazione finale di glucosio dializzato.
6. Calcolare l'ultrafiltrazione netta utilizzando la formula¹⁵:
   
7. Calcolare la permeabilità peritoneale utilizzando la seguente formula¹⁵:
   

4. Preparazione tissutale del muscolo della parete addominale e del fegato e analisi istologica

1. Sacrificare i topi mediante puntura cardiaca (flebotomia)^3,16.
2. Tagliare la parete addominale (1 cm x 1 cm) ed epatectomia totale. Fissare la parete addominale dei topi e i tessuti del fegato durante la notte in formalina tamponata neutra al 10%.
3. Preparare sezioni di paraffina spesse 3 μm del muscolo della parete addominale e del fegato ed eseguire l'analisi istologica seguendo il rapporto¹⁷ precedentemente pubblicato.
4. Valutare il peritoneo parietale della parete addominale e il peritoneo viscerale delle superfici epatiche dei topi usando la morfometria¹⁸.
5. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di statistica e grafici (vedi Tabella dei materiali). Esprimere tutti i dati come media ± SD e analizzare la significatività statistica utilizzando un t-test¹⁹. Definire valori con P < 0,05 come risultati significativi.

Risultati

Nella Figura 1A,B, il peritoneo parietale della parete addominale era marcatamente più spesso e più fibrotico sotto la colorazione tricromatica di Masson¹⁷, indicando che nel gruppo esposto a CG, la fibrosi peritoneale è più grave rispetto al gruppo salino di controllo (NS). Nella Figura 2A,B, il peritoneo viscerale delle superfici epatiche era anche marcatamente più spesso e più fibrotico, dimostrando così che nel...

Discussione

In questo studio, un modello di PD murino è presentato mediante iniezione i.p. di CG e i risultati hanno mostrato fibrosi peritoneale e deterioramento funzionale in questo modello, che imitava le condizioni del paziente PD.

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, per eseguire un'iniezione i.p. di CG o NS, la pelle della parete addominale del topo deve essere prelevata usando una pinza per prevenire danni agli organi intraperitoneali indotti dalla puntura. In secondo l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline	Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan	-
10% neutral buffered formalin	Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan	00002A
Automatic biochemical analyzer	Hitachi Ltd., Tokyo, Japan	Labospect Series 008	for determining glucose concentration
Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O	Sigma-Aldrich, MO, USA	C9394	diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection
Ethanol	Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA	BAKR8006-05	diluted to 15% with normal saline for working concentration
Glucose (Dianeal)	Baxter International, Inc., IL, USA	FNB9896	Commercial dialysis solution (4.25%)
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software, Inc., CA, US
L-type Glu 2 assay	FUJIFILM Wako, Japan	461-32403
Xylazine 20	Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan	-
Zoletil 50	Virbac Laboratories, Carros, France	-