Misurazione in vivo risolta nel tempo della dinamica dei neuropeptidi mediante immunosonda capacitiva nel cuore suino

Riepilogo

I metodi immunochimici stabiliti per misurare i trasmettitori peptidici in vivo si basano sulla microdialisi o sul prelievo di liquidi sfusi per ottenere il campione per l'analisi offline. Tuttavia, questi soffrono di limitazioni spazio-temporali. Il presente protocollo descrive la fabbricazione e l'applicazione di un biosensore immunoprobo capacitivo che supera i limiti delle tecniche esistenti.

Abstract

La capacità di misurare in vivo biomarcatori rilevanti per la valutazione della progressione della malattia è di grande interesse per la comunità scientifica e medica. La risoluzione dei risultati ottenuti dagli attuali metodi di misurazione di alcuni biomarcatori può richiedere diversi giorni o settimane per essere ottenuta, in quanto possono essere limitati nella risoluzione sia spazialmente che temporalmente (ad esempio, microdialisi del compartimento fluido del liquido interstiziale analizzato mediante saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA], cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC] o spettrometria di massa); pertanto, la loro guida di diagnosi e trattamento tempestivi viene interrotta. Nel presente studio, viene riportata una tecnica unica per rilevare e misurare i trasmettitori peptidici in vivo attraverso l'uso di un biosensore immunoprobo capacitivo (sonda CI). Vengono descritti il protocollo di fabbricazione e la caratterizzazione in vitro di queste sonde. Vengono fornite misurazioni del rilascio in vivo di neuropeptide Y (NPY) evocato dalla stimolazione simpatica. Il rilascio di NPY è correlato al rilascio simpatico di noradrenalina per riferimento. I dati dimostrano un approccio per la misurazione rapida e localizzata dei neuropeptidi in vivo. Le applicazioni future includono la valutazione intraoperatoria in tempo reale della progressione della malattia e l'implementazione minimamente invasiva basata su catetere di queste sonde.

Introduzione

Diversi metodi chimici per rilevare e quantificare i biomarcatori sono abitualmente utilizzati sia nella chimica delle proteine che nella diagnostica clinica, in particolare nelle diagnosi di cancro e nella valutazione della progressione delle malattie cardiovascolari. Attualmente, metodi come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA) e la spettrometria di massa si basano sulla raccolta di campioni dal compartimento vascolare ^1,2,3 mediante prelievo di liquidi sfusi o dal compartimento interstiziale mediante microdialisi. La microdialisi impiega un tubo di membrana semipermeabile di lunghezza nota che viene collocato in una regione di interesse. Il fluido di raccolta viene perfuso attraverso la provetta per diversi minuti⁴ per raccogliere il campione per l'analisi⁵, limitando così la risoluzione temporale. In questo modo, i campioni raccolti forniscono solo un valore medio nel tempo del microambiente locale e sono limitati dalla velocità di perfusione e dalla raccolta di un volume di campione sufficiente. Inoltre, questi metodi richiedono la messa in comune di dati sperimentali e la media dei segnali; pertanto, potrebbero non riuscire a tenere conto della variabilità tra i soggetti. È importante sottolineare che il tempo tra la raccolta del campione e la successiva analisi offline preclude l'intervento clinico immediato e le terapie.

Nel presente protocollo, viene delineato l'uso di un biosensore immunoprobo capacitivo (sonda CI) per il rilevamento elettrico risolto nel tempo di specifici peptidi bioattivi. Il neuropeptide Y (NPY), rilasciato dai neuroni simpatici post-gangliari che innervano la vascolarizzazione, l'endocardio, i cardiomiociti e i gangli intracardiaci, è un importante trasmettitore peptidico neuromodulatore nel sistema cardiovascolare 6,7,8,9. Il metodo qui presentato è progettato per misurare l'NPY e la fattibilità sperimentale è dimostrata in un modello di cuore suino. Tuttavia, questo approccio si applica a qualsiasi peptide bioattivo per il quale è disponibile un anticorpo selettivo¹⁰. Questo metodo si basa sulla giunzione capacitiva tra una sonda a filo di platino e il fluido conduttivo sulla punta funzionalizzata^11,12. In questa applicazione, l'interazione è stata mediata attraverso un anticorpo contro il neuropeptide bersaglio (NPY), che era legato alla punta dell'elettrodo, interfacciandosi con l'ambiente del fluido conduttivo. Questa funzionalizzazione è stata ottenuta attraverso l'elettrodeposizione di polidopamina reattiva sulla punta della sonda a filo di platino^10,13.

Quando la sonda funzionalizzata con anticorpi viene posizionata in una regione di interesse in vivo, il rilascio di NPY endogeno evocato porta al legame con gli anticorpi di intrappolamento sulla punta della sonda e il fluido conduttivo sulla superficie dell'elettrodo viene spostato dalla proteina NPY. L'alterazione locale nell'ambiente elettrico provoca lo spostamento di fluido ad alta mobilità e ad alto dielettrico con una molecola immobile e caricata staticamente. Ciò altera l'interfaccia elettrodo-fluido e, quindi, la sua capacità, che viene misurata come un cambiamento nella corrente di carica in risposta a un potenziale di comando della funzione step.. Un potenziale di "reset" negativo viene impiegato immediatamente dopo ogni singolo ciclo di misurazione per respingere l'NPY legato dall'anticorpo attraverso l'interazione elettrostatica, eliminando così i siti di legame anticorpale per i successivi cicli di misurazione¹⁰. Ciò consente efficacemente la misurazione di NPY in modo risolto nel tempo. L'esclusiva tecnica CI supera i limiti dei metodi immunochimici basati sulla microdialisi sopra descritti per misurare i livelli di biomarcatori dinamici da un singolo esperimento senza pool di dati o media del segnale su diversi esperimenti⁹, fornendo dati in tempo quasi reale. Inoltre, la capacità di adattare questo metodo a qualsiasi biomarcatore di interesse per il quale esista un anticorpo appropriato su una scala risolta nel tempo e localizzata fornisce un importante progresso tecnico nella misurazione immunochimica per la valutazione della progressione della malattia e la guida di interventi terapeutici.

Il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati è stato scritto su misura in IGOR Pro (un ambiente software completamente interattivo). Un sistema di convertitore analogico-digitale (A/D) emetteva una tensione di comando sotto il controllo del computer e acquisiva i dati da un amplificatore personalizzato. L'amplificatore possedeva alcune caratteristiche uniche. Questi includevano un resistore di feedback (commutabile) per ciascuno dei quattro canali di acquisizione, consentendo di scegliere circuiti di tensione di tensione di feedback da 1 MOhm o 10 MOhm per integrare la variabilità dell'elettrodo. È stata inoltre costruita un'unità di stadio con una singola testa e un circuito di terra/riferimento reciproco per tutti e quattro i canali di acquisizione per posizionare il dispositivo vicino al torace in un unico modulo fisico. Per raccogliere tutti i dati riportati è stata utilizzata un'impostazione del resistore di feedback da 1 MOhm.

Le impostazioni del filtro e del guadagno sono state telegrafate dall'amplificatore e registrate all'interno del file di dati. I dati sono stati filtrati a 1 kHz tramite un filtro Bessel analogico a 2 poli digitalizzato a 10 kHz. La differenza di potenziale tra la sonda e la soluzione conduttiva circostante crea uno strato capacitivo di Helmholtz sulla punta della sonda. Il legame del ligando all'anticorpo sulla punta della sonda provoca una carica locale alterata e, quindi, un cambiamento nella capacità di Helmholtz. Questo cambiamento nella componente capacitiva del circuito si traduce in uno spostamento dell'entità della carica iniettata necessaria per portare la sonda al potenziale nel protocollo di tensione step-function. Pertanto, il legame di un ligando specifico alla sonda funzionalizzata provoca un'alterazione nella misurazione della capacità dell'elettrodo come variazione della corrente capacitiva di picco.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università della California, Los Angeles Animal Research Committee ed eseguiti seguendo le linee guida stabilite dal National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8a edizione, 2011). Suini maschi adulti dello Yorkshire di circa 75 kg sono stati utilizzati per studi in vivo ¹⁰.

1. Fabbricazione e funzionalizzazione di immunosonda capacitive

1. Tagliare un filo di platino rivestito di perfluoroaltoxi (PFA) lungo 25 cm (vedi Tabella dei materiali) e rimuovere circa 5 mm di rivestimento in PFA da un'estremità usando un bisturi, facendo attenzione a non tagliare il filo di platino.
2. Inserire l'estremità spogliata del filo di platino in un perno maschio da 1 mm placcato in oro e crimpare i denti del pin del connettore attorno all'estremità spogliata del filo di platino utilizzando pinze ad ago (vedere Tabella dei materiali).
3. Saldare il filo di platino al pin del connettore placcato in oro. Fare attenzione a non utilizzare una quantità eccessiva di saldatura.
4. Preparare la soluzione di dopamina sciogliendo 50 mg di dopamina HCl in 50 mL di 10 mM di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 6.0) mescolando.
5. Una volta che la dopamina è completamente disciolta, posizionare la punta del filo di platino nel recipiente contenente il PBS appena fatto con dopamina. Collegare un perno del connettore dorato a un canale dell'headstage (vedere Tabella dei materiali).
6. Collegare l'elettrodo a disco AgCl (elettrodo di terra, vedere Tabella dei materiali) al canale di terra nell'headstage. Posizionare il disco AgCl nel recipiente contenente PBS integrato con dopamina e filo di platino; fare attenzione solo a immergere l'elettrodo del disco e non qualsiasi lunghezza del filo o della saldatura. Collegare uno shunt di filo nei canali di riferimento dell'headstage prima di procedere.
7. Aprire il software di acquisizione dati interattivo (vedi Tabella dei materiali). Preparare un protocollo di potenziale di comando dell'elettrodeposizione a dente di sega con i seguenti parametri: potenziale di avvio = -0,6 V; potenziale finale = +0,65 V; velocità di scansione = 0,04 V∙^s-1; durata della deposizione = 420 s. Iniziare il protocollo di deposizione di polidopamina, assicurandosi che tutti i fili siano collegati correttamente.
8. Dopo aver completato la deposizione di polidopamina, rimuovere il pellet macinato AgCl e la punta del filo di platino dal recipiente, facendo attenzione a non disturbare la punta dell'elettrodo a filo di platino. Posizionare la punta del filo in un microtubo contenente PBS (pH 7,4) per 2-5 minuti mentre viene preparata la soluzione anticorpale; assicurarsi che la punta del filo non contatti i lati o il fondo del microtubo.
   NOTA: La soluzione anticorpale può essere prodotta durante la deposizione di polidopamina; tuttavia, il trasferimento del filo di platino dal recipiente contenente dopamina al microtubo di PBS dopo la deposizione di polidopamina non deve essere saltato.
9. Preparare la soluzione anticorpale. Combinare l'anticorpo di interesse con PBS (pH 7,4) in un rapporto 1:20 in un recipiente di dimensioni appropriate (ad esempio, un microtubo).
   NOTA: L'anticorpo monoclonale anti-NPY (vedi Tabella dei materiali) qui utilizzato è stato aliquotato a 1 mg/mL; un esempio di preparazione anticorpale qui sarebbe 4 μL di anticorpo contro 76 μL di PBS.
10. Immergere la punta depositata in polidopamina dell'elettrodo di platino in soluzione anticorpale per un minimo di 2 ore a temperatura ambiente, assicurandosi nuovamente che la punta del filo di platino sia sospesa in soluzione e non appoggiata sulla superficie interna del microtubo.
    NOTA: La recente implementazione di questa tecnica ha favorito l'utilizzo dell'elettrodo a filo di platino immediatamente dopo questo passaggio invece di una conservazione a umido o a secco per un uso successivo.
11. Dopo l'immersione nella soluzione anticorpale, sciacquare brevemente la punta dell'immunosonda capacitiva (sonda CI) appena funzionalizzata in PBS (pH 7,4). La sonda è ora pronta per l'uso.

2. Configurazione sperimentale per il rilevamento e la misurazione in vitro del peptide

1. Posizionare la punta funzionale della sonda CI nella camera di flusso, facendo attenzione a non disturbare in alcun modo la punta dell'elettrodo, in quanto ciò potrebbe danneggiare la punta sensoriale della sonda.
   NOTA: La camera di flusso è stata creata versando l'elastomero siliconico (vedi Tabella dei materiali) in un piatto di coltura di 35 mm con un riempitivo di spazio ovoidale allungato al centro del piatto. Dopo l'indurimento, la forma ovoidale viene rimossa dall'elastomero. La camera viene quindi superfusa con soluzione salina Tris-buffered (TBS) e ha consentito una portata di 3 ml / min. Assicurarsi che l'afflusso e il deflusso mantengano il livello del fluido nella camera in modo tale che non si osservi l'azione di marea del superfusato. Il flusso deve rimanere in posizione per tutto il tempo in cui la sonda CI è in uso.
2. Prima del primo test sperimentale, eseguire un'esecuzione standard TBS per condizionare la sonda CI. Impostare il seguente protocollo di tensione di comando: potenziale di passo positivo = +100 mV; potenziale di passo negativo = −5 mV; durata del passo = 20 ms; durata dell'acquisizione = 600 s.
   NOTA: è importante consentire l'equilibrio della sonda durante la fase iniziale del potenziale di comando ciclico prima dell'acquisizione dei dati.
3. Creare una soluzione del peptide di interesse utilizzando lo stesso TBS per mantenere la composizione del superfusato. Impostare un sistema di collettori in cui il superfusato può essere commutato tra TBS e TBS integrato con peptidi senza introdurre bolle nel sistema di tubazioni o nella camera di flusso.
   NOTA: Il peptide SINTETICO NPY suino (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato nel presente studio.
4. Impostare il protocollo di acquisizione dati con rilevamento peptidico utilizzando i parametri standard TBS (vedere il passaggio 2.2.).
   NOTA: In questa implementazione, la durata di ogni test sperimentale è stata di 360 s (120 s TBS, 120 s TBS integrata con peptidi, 120 s TBS).

3. Adattamento della sonda CI per uso in vivo

1. Prima della deposizione di polidopamina (fase 1.7.), infilare la punta esposta dell'elettrodo a filo di platino attraverso un ago ipodermico da 22 G, lasciando circa 2 mm oltre la punta dell'ago. Usando la pinza, piegare delicatamente la punta dell'elettrodo di filo di platino, creando una "barbetta" che pende dall'estremità dell'ago ipodermico.
   1. Estrarre delicatamente l'ago dalla punta spinata, lasciando abbastanza filo da posizionare nel recipiente senza che l'ago contatti il fluido. Procedere con i passaggi 1.4.-1.11.
      NOTA: a seconda della configurazione in vivo , potrebbe essere necessario tagliare una lunghezza di filo di platino superiore a 25 cm.
2. Prima di collegare la sonda CI all'headstage, assicurarsi che l'intera configurazione elettrica sia correttamente messa a terra. In caso contrario, potrebbero introdurre interferenze elettriche indesiderate durante le registrazioni sperimentali.
3. Anestetizzare gli animali a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato¹⁰.
4. Eseguire un intervento chirurgico per esporre la regione di interesse.
   NOTA: Nel presente studio è stata eseguita una sternotomia mediana per esporre il cuore. Si prega di consultare Kluge et ^al.10 per i dettagli sulla chirurgia animale.
5. Rimuovere delicatamente la punta funzionalizzata dal risciacquo PBS (passaggio 1.11.), inoltrare l'ago idodermico alla sonda C.I. spinata e impiantarla delicatamente nella regione di interesse prima di collegare il perno del connettore dorato alla testa. Una volta impiantato, prelevare l'ago ipodermico, lasciando l'elettrodo in posizione.
   NOTA: Per il presente studio, la sonda è stata posizionata nella parete laterale centrale del miocardio ventricolare sinistro¹⁰.
6. Dopo aver assicurato una corretta configurazione elettrica, procedere con i protocolli di prova standard e sperimentali (passo 2.2. e passo 2.4.).
7. Al termine degli esperimenti, eutanasizzare l'animale seguendo tecniche approvate istituzionalmente.
   NOTA: Nel presente studio, gli animali vengono sottoposti a eutanasia in anestesia profonda tramite induzione della fibrillazione ventricolare¹⁰.

Risultati

Fabbricazione e caratterizzazione degli elettrodi
È stata fabbricata un'immunosonda capacitiva flessibile (sonde CI) e un'immagine rappresentativa è raffigurata nella Figura 1A. Il potenziale dell'elettrodo è stato impostato da un circuito di morsetto di tensione controllato da computer (Figura 1B) e l'elettrodo è stato immerso in una soluzione di polidopamina prodotta in PBS. La polidopamina è stata elettrodepositata sulla punta dell'el...

Discussione

Il presente protocollo descrive la produzione e la sperimentazione di un'immunosonda capacitiva (sonda CI) in grado di rilevare e misurare biomarcatori di interesse sia in vitro che in vivo . Il rilevamento si ottiene intrappolando il biomarcatore sulla punta dell'elettrodo. L'evento di intrappolamento altera la giunzione capacitiva tra un'immunosonda capacitiva a filo di platino e l'ambiente fluido conduttivo circostante, misurato come un cambiamento nella corrente di carica in risposta a un potenziale...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654