Fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) tramite tecnologia microfluidica

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) a base di acido poli(lattico-co-glicolico) attraverso la tecnologia microfluidica facile basata sulla formulazione a singola emulsione. Queste microsfere hanno potenziali applicazioni nell'ingegneria tissutale e nello screening dei farmaci.

Abstract

Rispetto agli scaffold di massa e all'iniezione diretta di cellule da sole, le unità modulari iniettabili hanno raccolto un enorme interesse nella riparazione dei tessuti malfunzionanti grazie alla praticità nel confezionamento delle cellule, al miglioramento della ritenzione cellulare e alla minima invasività. Inoltre, la conformazione porosa di questi vettori su microscala potrebbe migliorare lo scambio del mezzo e migliorare il livello di nutrienti e forniture di ossigeno. Il presente studio illustra la fabbricazione conveniente di microsfere porose altamente aperte (PLGA-HOPM) a base di acido poli(lattico-co-glicolico) mediante la facile tecnologia microfluidica per applicazioni di rilascio cellulare. I PLGA-HOPM monodispersi risultanti possedevano dimensioni delle particelle di ~400 μm e pori aperti di ~50 μm con finestre interconnesse. In breve, le goccioline di olio emulsionato (soluzione PLGA in diclorometano, DCM), avvolte con la fase acquosa di gelatina al 7,5% (p/v), sono state introdotte nella soluzione acquosa a flusso continuo di poli(alcool vinilico) (PVA) all'1% (p/v) attraverso l'ugello coassiale nella configurazione microfluidica personalizzata. Successivamente, le microsfere sono state sottoposte a procedure di estrazione con solvente e liofilizzazione, con conseguente produzione di HOPM. In particolare, varie formulazioni (concentrazioni di PLGA e porogeno) e parametri di lavorazione (potenza emulsionante, agometro e portata della fase dispersa) svolgono un ruolo cruciale nelle qualità e nelle caratteristiche dei HOPM PLGA risultanti. Inoltre, queste architetture potrebbero potenzialmente incapsulare vari altri segnali biochimici, come i fattori di crescita, per la scoperta di farmaci estesi e applicazioni di rigenerazione dei tessuti.

Introduzione

Le microsfere cariche di cellule offrono vantaggi favorevoli, come una maggiore capacità di ritenzione cellulare in situ, una consegna efficiente delle cellule e la successiva capacità di proliferazione cellulare in vivo¹. Ad oggi, sono state avanzate numerose indagini per lo sviluppo di una struttura di impalcatura di successo per supportare un ambiente favorevole per le cellule per la rigenerazione dei tessuti o applicazioni di screening farmacologico². Tuttavia, l'ambiente di ipossia è spesso inevitabile negli interni a causa di insufficienti forniture di nutrienti / ossigeno e accumulo di rifiuti metabolici³. Per ovviare a questi problemi, sono state sviluppate microsfere altamente porose (PM) utilizzando vari biomateriali ^4,5,6. Inoltre, nella coltura dinamica, gli scaffold soffrono di eccessivo sforzo di taglio⁷ e lo stato instabile del terreno di coltura potrebbe rompere la fedeltà dei PM. In alternativa, il poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) potrebbe essere utilizzato per trattare PM con buona resistenza meccanica per coltura dinamica¹. Ad esempio, abbiamo dimostrato la co-iniezione di PMs altamente aperti (HOPM) PLGA carichi di mioblasti di topo (C2C12) e microrod cavi carichi di poli(glicole etilenico) carichi di poli(glicole etilenico) di topo per guarire la perdita muscolare volumetrica, ottenendo un notevole miglioramento della rigenerazione del muscolo scheletrico in situ ⁸.

In particolare, i PM sono caratterizzati da ampie aree superficiali e da elevate porosità, che è di interesse specifico per l'adesione cellulare e la crescita verso la consegna cellulare minimamente invasiva⁹. In considerazione di questi aspetti, sono stati impiegati vari materiali biocompatibili per fabbricare i PM^10,11. Questi PM progettabili in cocoltura con cellule offrono un'adesione eccellente, una notevole resistenza meccanica e finestre altamente interconnesse, che potrebbero migliorare la proliferazione cellulare per riparare i tessuti danneggiati¹². A questo proposito, sono state sviluppate anche varie tecnologie per fabbricare sfere porose^13,14. Da un lato, i PM sono stati prodotti utilizzando agenti che formano gas, come NH₄HCO₃, che sono stati trattenuti a causa dell'insufficiente interconnettività^15,16,17. D'altra parte, i PM sono stati direttamente tranciati dopo l'emulsione, il che ha portato a PM polidispersi¹⁸. Alla fine, la tecnologia microfluidica a goccia basata sull'approccio del modello di emulsione è forse un metodo efficiente per costruire PM, poiché spesso si traduce in particelle di dimensioni uniformi¹⁹. In particolare, gli attributi morfologici delle microsfere spesso dipendono dalla qualità delle goccioline di emulsione generate (cioè acqua-in-olio, W/O, o olio-in-acqua, O/W), che possono influenzare significativamente gli attributi dei biomateriali²⁰. Vale la pena notare che la piattaforma microfluidica preprogettata può essere applicata per generare le microfibre o le microsfere. In un esempio, Yu et al. hanno dimostrato la produzione di strutture microfibrose cariche di cellule basate su piattaforme microfluidiche capillari, che potrebbero essere utilizzate per assemblare reti cellulari per imitare i tessuti naturali²¹. In un altro caso, Ye et al. hanno fabbricato microcapsule di cristalli fotonici mediante la replicazione modello di perle di cristallo colloidale di silice attraverso tecnologie microfluidiche, che potrebbero superare molti limiti delle attuali tecniche che richiedono un'etichettatura complessa e un apparato specifico²².

In effetti, la logica alla base dell'utilizzo di questa tecnica è dovuta a vari vantaggi, come la sua natura facile, che non richiede attrezzature sofisticate e la sua convenienza nel sintetizzare PM di dimensioni uniformi per la consegna di cellule e applicazioni di medicina rigenerativa. In questo contesto, con componenti predefiniti di emulsione-templating, i PM con elevate porosità e interconnettività possono essere comodamente ottenuti da un dispositivo microfluidico assemblato da tubi di poli(cloruro di vinile) (PVC), un capillare di vetro e un ago. Un precursore di emulsione W/O viene preparato omogeneizzando una soluzione acquosa di gelatina e una soluzione organica di PLGA. Iniettando selettivamente la porzione applicabile dell'emulsione nella piattaforma microfluidica, vengono fabbricati i PM con dimensioni uniformi delle particelle e pori interconnessi attraverso la superficie fino all'interno. Il presente protocollo mira a fabbricare i PLGA-HOPM mediante emulsione-templating nella piattaforma microfluidica. Si ritiene che questo protocollo consenta la produzione riproducibile di PLGA-HOPM e sarà potenzialmente applicabile nei loro campi correlati di ingegneria tissutale e screening farmacologico.

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare preventivamente la soluzione madre di PVA riscaldandola a bagnomaria a 80 °C e successivamente mettendola in frigorifero a 4 °C. Raffreddare a temperatura ambiente (RT) per uso sperimentale.
2. Preparare il precursore dell'emulsione aggiungendo la soluzione acquosa di gelatina (1 mL, 7,5%, p/v) alla fase organica di PLGA (2 mL, 2%, p/v in diclorometano, DCM) (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Generalmente, la tecnologia microfluidica coinvolge diverse fasi per formare le microsfere. La fase continua o di raccolta comprende un poli(alcool vinilico) acquoso (PVA, 600 ml, 1%, p/v).

2. Assemblaggio di dispositivi microfluidici a goccia e fabbricazione di PLGA-HOPM

NOTA: gli elementi di consumo necessari per questo assieme sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Personalizzare l'assieme del generatore di gocce.
   1. Costruire un generatore microfluidico co-flow utilizzando un capillare di vetro (OD, 1 mm), tubi in PVC (ID, 1 mm) e un ago erogatore da 26 G.
   2. Collegare il capillare di vetro all'estremità del tubo in PVC e quindi forare con un ago al collegamento della struttura di cui sopra.
   3. Posizionare l'altra estremità del tubo in PVC nella fase continua durante la generazione di gocce. Utilizzando la colla UV, sigillare gli spazi vuoti sul giunto dopo la polimerizzazione.
      NOTA: L'ago deve essere piegato curvato di circa 45° per un comodo piercing sul tubo in PVC e la punta dell'ago allungata nel tubo capillare per formare la struttura coassiale.
2. Preparare la piattaforma microfluidica a goccia.
   1. Utilizzare due pompe a siringa, come mostrato nella Figura 1. Utilizzare una siringa da 50 ml per caricare la fase continua e una siringa da 5 ml per la formazione dell'emulsione.
   2. Impostare le portate delle fasi continua e di dispersione rispettivamente a 2 ml/min e 0,08 mL/min.
   3. Porre un becher da 500 mL in un bagno di ghiaccio e riempirlo con una soluzione acquosa di PVA preraffreddata (fase 1.1).
      NOTA: L'estremità del capillare di vetro deve essere immersa nella fase di raccolta. Si consiglia di agitare (1 h, 60 rpm) il surnatante della fase di raccolta con la bacchetta di vetro dopo la formazione di emulsione-goccioline nella piattaforma. Le goccioline di emulsione sono prodotte sulla punta dell'ago. In generale, il calibro dell'ago influenza la dimensione dei PM, in cui il calibro minore corrisponde alla dimensione più piccola dei PM. Inoltre, il diametro dei pori è principalmente correlato alla concentrazione di porogeno, in grado di aumentare con un'appropriata concentrazione di gelatina¹.
3. Eseguire l'emulsione e la generazione di goccioline.
   1. Preparare l'emulsione seguendo i passaggi seguenti.
      1. Preparare l'emulsione decantando immediatamente la soluzione acquosa di gelatina nella soluzione DCM di PLGA (fase 1.2) ed emulsionando utilizzando il dispositivo ad ultrasuoni (vedere Tabella dei materiali).
      2. Regolare la potenza ultrasonica a 400 W e impostare il tempo di elaborazione totale su 90 s (intervallo 2 s, trattamento ad ultrasuoni 1 s), accompagnato da una costante modifica manuale della posizione della sonda.
      3. Stabilizzare l'emulsione risultante per l'aspirazione della siringa e la generazione di goccioline in circa 20 minuti.
         NOTA: posizionare la sonda dell'interruttore a ultrasuoni nell'interfaccia olio-acqua. Si consiglia di non lasciare che la sonda ad ultrasuoni entri in contatto con il contenitore.
   2. Eseguire la generazione di gocce.
      1. Caricare rapidamente l'emulsione preparata (punto 2.3.1) nella siringa da 5 mL della piattaforma microfluidica dopo il trattamento ad ultrasuoni.
      2. Introdurre l'emulsione W/O instabile (che è in corso di separazione di fase) nel dispositivo microfluidico come fase discontinua. Allo stesso tempo, utilizzare la soluzione acquosa di PVA come fase continua.
      3. Raccogliere le microsfere contenenti l'emulsione sul fondo del becher di raccolta (PVA, 1%, p/v) dopo aver iniettato le porzioni appropriate dell'emulsione nel dispositivo microfluidico.
      4. Porre il campione a 4 °C durante la notte per un'ulteriore stabilizzazione.
   3. Risciacquare e liofilizzare le microsfere preparate (PLGA-HOPM) seguendo i passaggi seguenti.
      NOTA: I PLGA-HOPM generati contengono pori arbitrari all'interno e alla superficie.
      1. Conservare le microsfere a 4 °C prima di normalizzarle a RT e agitare con una bacchetta di vetro (1 h, 60 rpm) per eliminare il DCM residuo.
      2. Filtrare accuratamente la fase di raccolta nel becher da 500 ml e lavare tre volte le microsfere raccolte con acqua deionizzata per lavare via il PVA residuo sulla superficie dei PM.
      3. Posizionare le microsfere di PLGA nel bagnomaria a 37 °C per 30 minuti per sciogliere la gelatina avvolta nella spina dorsale del PLGA.
      4. Risciacquare due volte i PLGA-HOPM risultanti con acqua deionizzata per rimuovere la gelatina residua e pre-raffreddare per la liofilizzazione a -80 °C per 24 ore.
      5. Conservare i PLGA-HOPM asciutti a -20 °C per ulteriori esperimenti.

3. Imaging al microscopio elettronico a scansione (SEM)

1. Depositare i PLGA-HOPM sullo stadio campione di SEM (vedi Tabella dei materiali) presso RT e inserire lo stadio campione nella cella di sputter dello sputter magnetron. Accendere il trasformatore e il magnetron uno per uno. Introdurre il campione nel SEM dopo essere stato rivestito d'oro per 1 minuto.
2. Ottenere le immagini SEM impostando la tensione di accelerazione a 5 kV.
3. Inoltre, quantificare la dimensione delle particelle dei PLGA-HOPM utilizzando 100 PM al campo variabile dell'imaging SEM. Misurare il risultato rappresentativo per quantificare la distribuzione delle dimensioni dei pori.
   1. Apri la grafica con Image J e usa la "linea retta" per abbinare la barra della scala dell'immagine SEM, che fa sì che il software identifichi il pixel in lunghezza.
   2. Fare clic su analizza > impostare la scala, impostare la "distanza nota" sulla barra della scala dell'immagine SEM e fare clic su > globale OK.
   3. Fare clic su analizza > Tools > ROI manager... per misurare la dimensione dei pori o delle particelle dei PM PLGA e fare clic su aggiungi. Misurare il numero di campioni in base al requisito.
   4. Fare clic su Misura per ottenere i dati quantitativi dei grafici per ulteriori calcoli.

4. Coltura cellulare e imaging a fluorescenza

NOTA: Per il presente lavoro sono state utilizzate cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di ratto (BMSC). Le celle sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Coltura delle cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco integrato con L-glutammina (DMEM / F-12), siero bovino fetale al 10% (v / v) e penicillina / streptomicina all'1%. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Far passare i BMSC del ratto in un rapporto 1:2 dopo aver raggiunto il 90% di confluenza.
3. Eseguire l'adesione cellulare seguendo i passaggi seguenti.
   1. Incubare i PLGA-HOPM con alcool etilico (5 ml, 70%, v/v) e centrifugare a 500 x g per 10 minuti a RT per sterilizzare.
   2. Lavare due volte i PLGA-HOPM sterilizzati con una soluzione tampone fosfato.
   3. Incubare gli HOPM (cinque in numero) con la sospensione cellulare (5 mL, 1 x 10⁵ cellule/mL) in una provetta da centrifuga sterile (50 mL) in coltura dinamica per l'adesione dei BMSC ai PLGA-HEMP.
   4. Eseguire la coltura dinamica in uno shaker asettico termostatico (37 °C, 90 giri/min) posizionando una provetta da centrifuga sigillata da 50 mL nello shaker (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: La coltura dinamica intende migliorare il tasso di aderenza dei BMSC sugli scaffold, piuttosto che incubare direttamente i PM e le cellule sulla piastra di plastica. Le celle e i PM PLGA vengono aggiunti in una provetta sterile da centrifuga da 50 ml, incubando la provetta in uno shaker asettico termostatico (37 °C, 90 giri/min) e cambiando il fluido ogni 2 giorni.
4. Eseguire il test a doppia colorazione vivo e morto.
   1. Risciacquare tre volte i PM carichi di cellule per eluire BMSC senza collegarli a PLGA-HEMP.
   2. Posizionare i PM carichi di celle sulla piastra di vetro da 35 mm. Aggiungere 1 mL di tampone colorante (vedere Tabella dei materiali), inclusi 1 μL di calceina-AM e ioduro di propidio (PI), rispettivamente, al campione prelavato PBS.
   3. Valutare i campioni mediante microscopia a scansione laser confocale (vedi Tabella dei materiali). Accendere la luce di eccitazione di 488 nm e 552 nm sul rilevatore corrispondente. Per l'analisi z-overlay, impostare la larghezza z per catturare i diversi strati del campione mediante il movimento dell'asse z del microscopio.
      NOTA: Vale la pena notare che le altre macchie possono essere opportunamente impiegate per l'analisi.

Risultati

Sulla base di lavori precedenti che hanno ottimizzato i parametri principali¹, il PLGA è stato sciolto nel solvente DCM evaporabile. L'emulsione primaria W/O è stata preparata mediante omogeneizzazione con gelatina sotto trattamento con sonda ad ultrasuoni. La struttura fluidica co-flow personalizzata è stata assemblata in modo semplicistico, in cui è stata impiegata una siringa per introdurre costantemente i flussi. Inoltre, sono state eseguite sufficienti procedure di risciacquo per eliminar...

Discussione

Questo articolo descrive una strategia efficiente per fabbricare architetture basate su PLGA, vale a dire i PLGA-OPM. Va notato che diversi passaggi critici devono essere presi con attenzione, tra cui evitare la volatilizzazione del solvente del PLGA e regolare delicatamente la potenza ultrasonica nella posizione target durante la preparazione dell'emulsione. Inoltre, l'uscita del liquido della siringa da 20 mL può essere regolata in una certa misura per risolvere la separazione di fase dei precursori emulsionati. Tutta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100