Sintesi di nanocompositi di grafene-idrossiapatite per un potenziale utilizzo nell'ingegneria dei tessuti ossei

Riepilogo

Nuovi nanocompositi di nanonastri di grafene e nanoparticelle di idrossiapatite sono stati preparati utilizzando la sintesi in fase di soluzione. Questi ibridi quando impiegati in scaffold bioattivi possono presentare potenziali applicazioni nell'ingegneria tissutale e nella rigenerazione ossea.

Abstract

Lo sviluppo di nuovi materiali per l'ingegneria dei tessuti ossei è una delle aree di spinta più importanti della nanomedicina. Diversi nanocompositi sono stati fabbricati con idrossiapatite per facilitare l'aderenza cellulare, la proliferazione e l'osteogenesi. In questo studio, i nanocompositi ibridi sono stati sviluppati con successo utilizzando nanonastri di grafene (GNR) e nanoparticelle di idrossiapatite (nHAPs), che se impiegati in scaffold bioattivi possono potenzialmente migliorare la rigenerazione del tessuto osseo. Queste nanostrutture possono essere biocompatibili. Qui, sono stati utilizzati due approcci per preparare i nuovi materiali. In un approccio, è stata utilizzata una strategia di co-funzionalizzazione in cui nHAP è stato sintetizzato e coniugato contemporaneamente ai GGR, con conseguente nanoabridi di nHAP su superfici GNR (indicate come nHAP / GNR). La microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) ha confermato che il composito nHAP/GNR è composto da strutture sottili e sottili di GGR (lunghezza massima di 1,8 μm) con patch discrete (150-250 nm) di nHAP aghiforme (40-50 nm di lunghezza). Nell'altro approccio, nHAP disponibile in commercio è stato coniugato con GGR formando nHAP rivestito GNR (indicato come GNR / nHAP) (cioè con un orientamento opposto rispetto alla nanoibrida nHAP / GNR). Il nanoibrido formatosi utilizzando quest'ultimo metodo ha mostrato nanosfere nHAP con un diametro che va da 50 nm a 70 nm coperte da una rete di GNR sulla superficie. Gli spettri dispersivi di energia, la mappatura elementare e gli spettri infrarossi a trasformata di Fourier (FTIR) hanno confermato il successo dell'integrazione di nHAP e GNR in entrambi i nanoibridi. L'analisi termogravimetrica (TGA) ha indicato che la perdita a temperature di riscaldamento elevate a causa della presenza di GNR è stata dello 0,5% e dello 0,98% rispettivamente per GNR/nHAP e nHAP/GNR. I nanoibridi nHAP-GNR con orientamenti opposti rappresentano materiali significativi da utilizzare in scaffold bioattivi per promuovere potenzialmente le funzioni cellulari per migliorare le applicazioni di ingegneria del tessuto osseo.

Introduzione

Il grafene ha strutture bidimensionali simili a fogli composte da carbonio sp-ibridato. Diversi altri allotropi possono essere attribuiti alla rete estesa a nido d'ape di grafene (ad esempio, l'impilamento di fogli di grafene forma grafite 3D mentre il rotolamento dello stesso materiale provoca la formazione di nanotubi 1D¹). Allo stesso modo, i fullereni 0D si formano a causa dell'avvolgimento². Il grafene ha interessanti proprietà fisico-chimiche e optoelettroniche che includono un effetto di campo ambipolare e un effetto Hall quantistico a temperatura ambiente ^3,4. Il rilevamento di eventi di adsorbimento di singole molecole e l'estremamente elevata mobilità del vettore si aggiungono agli attributi attraenti del grafene ^5,6. Inoltre, i nanonastri di grafene (GGR) con larghezze strette e un ampio percorso libero medio, bassa resistività con un'alta densità di corrente e alta mobilità degli elettroni sono considerati promettenti materiali di interconnessione⁷. Quindi, i GGR vengono esplorati per applicazioni in una miriade di dispositivi e, più recentemente, nella nanomedicina, in particolare nell'ingegneria tissutale e nella somministrazione di farmaci⁸.

Tra i vari disturbi traumatici, le lesioni ossee sono considerate una delle più impegnative a causa delle difficoltà a stabilizzare la frattura, la rigenerazione e la sostituzione con nuovo osso, resistere alle infezioni e riallineare le non unioni ossee ^9,10. Le procedure chirurgiche rimangono l'unica alternativa per le fratture dell'albero del femore. Va notato che quasi $ 52 milioni vengono spesi ogni anno per il trattamento di lesioni ossee in America Centrale e in Europa¹¹.

Gli scaffold bioattivi per applicazioni di ingegneria dei tessuti ossei possono essere più efficaci incorporando nano-idrossiapatite (nHAP), in quanto assomigliano alle proprietà micro e nano architettoniche dell'osso stesso¹². L'HAP, rappresentato chimicamente come Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ con un rapporto molare Ca/P di 1,67, è il più preferito per le applicazioni biomediche, in particolare per il trattamento dei difetti parodontali, la sostituzione dei tessuti duri e la fabbricazione di impianti per interventi chirurgici ortopedici^13,14. Pertanto, la fabbricazione di biomateriali a base di nHAP rinforzati con GNR può possedere una biocompatibilità superiore e può essere vantaggiosa grazie alla loro capacità di promuovere l'osteointegrazione ed essere osteoconduttivi^15,16. Tali scaffold compositi ibridi possono preservare proprietà biologiche come l'aderenza cellulare, la diffusione, la proliferazione e la differenziazione¹⁷. Qui riportiamo la fabbricazione di due nuovi nanocompositi per l'ingegneria del tessuto osseo alterando razionalmente la disposizione spaziale di nHAP e GNR come illustrato nella Figura 1. Le proprietà chimiche e strutturali dei due diversi accordi nHAP-GNR sono state valutate qui.

Protocollo

1. Sintesi di nHAP per precipitazione

1. Sintetizzare il nHAP incontaminato utilizzando 50 mL della miscela di reazione contenente 1 M Ca(NO₃)₂∙4H₂O e 0,67 M (NH₄)H₂PO₄ seguita dall'aggiunta a goccia di NH₄OH (25%) per mantenere un pH intorno a 10¹⁸.
2. Successivamente, agitare la miscela di reazione mediante irradiazione ad ultrasuoni (UI) per 30 minuti (potenza di 500 W e frequenza ad ultrasuoni di 20 kHz).
3. Lasciare maturare la soluzione risultante per 120 ore a temperatura ambiente fino a quando il precipitato bianco di nHAP si deposita. Recuperare il nHAP per centrifugazione a 1398 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare il precipitato con acqua deionizzata (DI) 3x e liofilizzare per 48 ore. Conservare la polvere secca a 4 °C.

2. Preparazione di nanocompositi nHAP/GNR

NOTA: quanto segue descrive due approcci per la fabbricazione di nanocompositi nHAP/GNR (cioè nHAP su superfici GNR) e GNR/nHAP (nHAP rivestito in GNR) che rappresentano due diverse disposizioni spaziali di nHAP e GNR (Figura 1).

1. Sintesi di nHAP/GNR
   1. Per preparare il nanocomposito nHAP/GNR, utilizzare una strategia di co-funzionalizzazione in cui nHAP può essere sintetizzato e coniugato a GGR contemporaneamente, come segue.
   2. Sciogliere 5 mg di GGR (Table of Materials) in una miscela di 1 M di nitrato di calcio tetraidrato [Ca(NO₃)₂·4H₂O] e 0,67 M di idrogeno fosfato di diammonio [(NH₄)₂HPO₄] a un volume finale di 50 mL¹⁹.
   3. Durante questa reazione, aggiungere il 25% di NH₄OH a goccia per mantenere il pH a ~ 10. Agitare la miscela risultante tramite UI per 30 minuti.
   4. Dopo il completamento della reazione, lasciare la soluzione indisturbata per 120 ore a temperatura ambiente fino alla maturazione.
   5. Osservare la formazione di un precipitato gelatinoso di nHAP che ricopre i GNR, in seguito al quale si deposita un precipitato bianco di nHAP/GNR.
   6. Lavare il precipitato 3x mediante centrifugazione a 1398 x g per 5 minuti a temperatura ambiente seguita da ridispersione in acqua DI.
   7. Liofilizzare il precipitato lavato recuperato per 48 ore. Conservare la polvere secca a 4 °C.
   8. Utilizzare nHAP e GNR incontaminati come campioni di controllo.
2. Sintesi di nanocomposito GNR/nHAP
   1. Sospendere nHAP disponibile in commercio ad una concentrazione di 5 mg/mL in 50 mL di acqua DI integrata con 5 mg di GNR.
   2. Agitare la miscela risultante tramite UI per 30 minuti e successivamente lasciare la miscela indisturbata per 120 ore a temperatura ambiente.
   3. Dopo la maturazione, recuperare il precipitato bianco del GNR/nHAP risultante mediante centrifugazione a 1398 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Lavare il campione 3 volte con acqua DI, liofilizzare per 48 ore e conservare la polvere secca a 4 °C per un ulteriore utilizzo.

3. Caratterizzazione di nHAP, nHAP/GNR e GNR/nHAP

1. Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) (vedi Tabella dei materiali) per caratterizzare la morfologia e le dimensioni dei nanocompositi¹¹.
2. Analizzare la composizione elementare dei nanocompositi utilizzando la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) ed eseguire la mappatura elementare utilizzando il microscopio elettronico a trasmissione a scansione (STEM)¹¹.
3. Eseguire la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) per i campioni ordinati a numeri d'onda di 500-4000 cm⁻¹ per analizzare i gruppi chimici nel nanocomposito¹⁶.
4. Eseguire l'analisi della diffrazione a raggi X (XRD) in polvere dell'nHAP sintetizzato utilizzando una lunghezza d'onda a raggi X di 1,5406 Å, impostazioni di corrente e tensione di 40 mA e 40 kV, rispettivamente, e 2θ che vanno da 20 ° a 90 °.
5. Valutare il carico percentuale di GNR nel nanocomposito utilizzando l'analisi termogravimetrica (TGA) riscaldando i campioni dalla temperatura ambiente a 1000 °C ad una velocità di 10 °C/min sotto flusso di azoto.

Risultati

Analisi HRTEM
Individualmente, i GNR erano strutture sottili simili a bambù con alcune curve a una certa distanza, come osservato nella Figura 2. Il GNR più lungo era di 1.841 μm mentre il GNR piegato più piccolo era di 497 nm. I nanonastri hanno spesso mostrato una variazione visibile di larghezza che potrebbe essere attribuita alla torsione per formare configurazioni elicoidali in molti punti. Tale allineamento unidirezionale dei GNR può aiutare a ottenere caratter...

Discussione

Sebbene vari metalli, polimeri, ceramiche e le loro combinazioni siano stati studiati come impianti ortopedici e accessori di fissaggio, l'HAP è considerato uno dei materiali più preferibili a causa della sua somiglianza chimica con l'osso stesso e della conseguente elevata citocompatibilità 20,21,22. In questo studio, l'orientamento dell'HAP è stato variato, il che può avere un impatto significativo sulle sue proprietà un...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	216003-100G	Synthesis
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	237124	Synthesis
Centrifuge	Hettich	EBA 200S	Recovery
Fourier transform infrared spectrometer	Brucker	Vertex 70	Characterization
Graphene nanoribbon	Sigma-Aldrich	922714	Synthesis
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Scientific	Themis Titan 300	Characterization
Magnetic stirrer	IKA	C-MAG HS7 S68	Functionalization
Micropipettes	TreffLab	06H35687	Reagent preparation
pH meter	Eutech pH5+	ECPH503PLUSK	Reagent preparation
Thermogravimetric analyzer	TA Instruments	SDT Q600	Characterization
Ultrasonic bath	Bandelin	DT100	Functionalization
Universal Oven	Memmert	UF55	Functionalization
Weighing balance	Precisa	XB220A	Reagent preparation
X-ray diffractometer	Brucker	D8-Advanced	Characterization